陈光椿[1]2002年在《晚期前列腺癌中的雄激素受体突变体的功能改变及差异》文中进行了进一步梳理前列腺癌(PC)是雄激素依赖的肿瘤，雄激素可促进PC的增殖，而内分泌治疗即去势和应用雄激素拮抗剂可抑制肿瘤生长并诱导癌细胞凋亡，因此，该疗法一直是PC的重要治疗手段之一。但在临床工作中早已发现，一部分患者在内分泌治疗前或治疗一段时间后其肿瘤细胞出现了对内分泌治疗的不敏感或抵抗，其机制迄今尚未完全阐明。由于雄激素与PC的发生、发展和临床治疗关系密切，而雄激素受体(AR)是介导雄激素作用的关键大分子，因此，PC与AR关系的研究一直是前列腺癌研究的热点之一。一般认为，PC细胞为适应内分泌治疗后体内出现的极低的雄激素环境，可通过多种机制，使AR的信号转导增强(1)AR基因扩增，蛋白表达增加；(2)AR基因突变，造成AR转录激活功能增强，与配体结合的特异性改变等；(3)辅助因子表达的异常；(4)配体非依赖性激活。 本文对我们以前应用PCR-SSCP分析，从50余例前列腺癌组织标本中，发现的4例AR基因突变(G142V、D221H、E872Q和M881I)进行了体外功能分析。 首先，我们应用pALTER体外致突变系统成功地对这些突变位点进行了人工致突变，构建了这些突变的表达载体，然后应用Western blot分析，对转染入无内源性AR表达的COS-7细胞中的表达载体的表达进行了分析，结果表明，表达载体能有效表达AR，其大小与野生型AR一致。而应用完整细胞的放射配体结合分析法，对转染入COS-7细胞中的AR进行了Scatchard分析，结果表明，与野生型AR相比，这些 博士学位论文 陈腑 突变与人N合成的雄激素R1881结合的亲和力及最大结合容量均无明显。 改变。在此基础上，我们对受体的转录激活功能进行了研究。 以无内源性AR表达的＊＊l细胞；为模型，我们首先应用＊＊T对受－体的转录激活功能进行了研究。结果表明，与野生型AR相比，DHT 在 Zxlo－“mol／L时，即对位于 TAD的两突变体＊ 和 D22lH即具有 明显的车录激活增强作用（P＜O．05），Zx ic“’moL几时则有显着的激活作 用（P＜o刀1＊＊＊T对另外两个突变体的转录激活作用无明显的异常。 应用雄激素桔抗剂CPA、Flutamide及雌激素、孕激素、RU486、Dex 对AR突变体进行转录激活功能研究表明，与野生型AR相比，CPA、 雌激素和孕激素对E872Q的转录激活功能异常增强（P＜o刀1）。而其余 叁种突变体则无明显异常。这表明E872Q与2：PA、雌激素和孕激素结 合发主了特异性改变。而RU486和I儿x对四种突变体的转录功能均无 明显异常。 作为配体依赖性的转录调节因于，AR发挥其正常的转录调节作用， 有赖于辅助因子的参与。我什1应用共激活因子 1IF上、CBP及 P300和 共抑制因子NCOR、SMRTMRT及p53对AR突变体转录激活功能的影响进 行了研究。与野生型AR相比，TD上和CBP对突变发生于LBD的两＿突变体＊872和＊8861具有明显异常的转录激活·增强作用（P＜0刀1），而 对发兰于TAD的两个突变体的转录则无明显的异常作用。而P300对四 种突变体的作用，则与野生型AR基本相似，无明显的异常。 对共抑制因子所进行的研究则表明，SMRT和 P53能完全进行 DHT 以及CPA对野生型AR和AR突变体的转录激活作用。而NCOR作用 存在一些差异：能完全阻断 CPA对所有受体的转录激活作用；仅能部＿分抑制＊＊T对野生型AR及＊142、IR21H的转录激活作用，完全阻断 DHT对E872和M8861的转录激活作用。以上研究提示，AIt的转录激 3 博士学位论文 陈光椿 活作用的强弱，不仅与共激活因子表达强弱有关，也与共抑制因子表达 强弱有关；二者表达比例的高低，对受体的转示：活性尤为重要。这也可 能正是受体的转录激活存在细胞特异性的机制之一。 AR的配体非依赖性转录激活功能在前列腺癌的发展过程中，也具－有重要的作用。尽管机制尚不清楚。我们应用PKC激动剂PMA对AR 进行的研究表明，＊M A对野生型AR和AR突变体均有基本相同的配 体依赖性转录激活作用，并且还与］n｛T一起，对野生型AR及AR突 变体的转录激活起协同的作用。尽管 c＊un是I。MA信号转导途径中的 下游蛋白，我们对c＊un在AR季录激活中的作用研究 表明，c－Jun育完 全阻断 AR的转录激活作用，表明 c＊un并不参与 l。MA对 Aft的的配体 非依赖性激活作用。 G CHO为模型，研究了 AR7含 pZI启动子的报告基因 pZI－LUC 的转录激活作用，结果表明，与野生型＊R相比，＊R突变体对报告基
曾锐[2]2010年在《A/B同型雄激素受体与前列腺癌关系的研究》文中研究说明背景前列腺癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。根据2009年的数据,前列腺癌已经成为欧洲和美国男性最大的杀手。前列腺是男性独有的性腺器官,也是一种雄激素依赖的器官,而雄激素是通过其受体发挥作用的,雄激素受体(AR)则是雄激素代谢和发挥作用过程中的中心环节之一。因此,雄激素受体在前列腺癌的发生发展中占有重要地位。受孕激素受体(PR)亚型和雌激素受体(ER)亚型的启发,1993年Carol在人的生殖器皮肤成纤维细胞中首次证实雄激素受体A、B两种同型受体的存在,分别是AR-B和AR-A。其中AR-B是完整、全长的雄激素受体,分子量为110 kDa,它是正常成人大多数组织中最常见雄激素受体亚型,所占比例高达80%-95%。而AR-A缺乏完整氨基端结构,比AR-B少N端起始部位的188个氨基酸,它但其DNA结合区和激素结合区结构完整,分子量为87 kDa,在正常成人大多数组织中表达水平较低,所占比例低于20%。目前尚无克隆AR-A mRNA的报道。雄激素存在A、B两种同型受体这种情况与孕激素受体(PR)极为相似：二者同为单一基因,转录一条mRNA,同样存在完全转录和部分转录的A、B两种同型受体。研究表明：子宫内膜癌和乳腺癌的发病与孕激素A、B两种同型受体存在着密切相关性,孕激素A、B受体的分布、表达和丢失与乳腺癌、卵巢肿瘤的内分泌疗效亦存在密切相关。也有研究表明,孕激素A、B两种同型受体的生物学功能不同。与孕激素同型受体的研究相比,有关雄激素A、B同型受体的研究目前还只是方兴未艾。Catalano在对结肠癌中AR的研究发现,在正常结肠粘膜中AR-A和AR-B均有表达,但在结肠癌组织中AR-B表达缺失,提示两者在肿瘤的形成发展过程中可能发挥不同的作用。Liegibel等研究发现AR-A和AR-B两者的功能不同。研究目的研究A／B同型雄激素受体在不同前列腺组织中的表达,明确前列腺癌组织中A／B同型雄激素受体表达的变化,并研究探讨A／B同型雄激素受体在前列腺癌中的功能,明确A／B同型雄激素受体表达变化及功能差异在前列腺癌发生、发展中的作用。研究方法：本研究旨在通过应用Western blot、免疫荧光技术,研究分析50例前列腺癌、15例前列腺增生和15例正常前列腺组织中A／B同型雄激素受体蛋白的表达情况,从蛋白表达水平研究原发性前列腺癌组织中A／B同型雄激素受体蛋白表达水平的改变。同时应用realtime—PCR技术研究不同前列腺组织中雄激素受体mRNA表达的变化。通过质粒制作、质粒转染等技术初步研究前列腺癌细胞中A／B同型雄激素受体蛋白的功能差异,观察二者对前列腺癌PC3细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力的影响。结果Western Blot结果显示：各个前列腺癌、前列腺增生以及正常前列腺组织均表达AR-A与AR-B两种同型雄激素受体。其中全长的AR-B雄激素受体是优势表达受体,占总数的95-80%,AR-A型雄激素受体表达量较低,占总数的5-20%,与文献报道相符。正常前列腺组织和前列腺增生组织中AR-A(P=0.703)和AR-B(P=0.505)表达量及AR-A/AR-B比值(P=0.871)差异无统计学意义。前列腺癌组织中AR-A、AR-B雄激素受体表达量及AR-A/AR-B比值较正常前列腺中表达量本别增高2.8倍、1.47倍和1.92倍,差异有统计学意义(P<0.01)。较前列腺增生组织组织中AR-A、AR-B及AR-A/AR-B比值较正常前列腺中表达量本别增高2.38倍、1.37倍和1.75倍,差异有统计学意义(P<0.01)。AR-A和AR-B的表达与前列腺癌患者的年龄无关(p>0.05),但与前列腺癌Gleason评分有关。Gleason评分>7的前列腺癌患者组织中AR-A的表达量较Gleason评分≤7的前列腺癌患者组织中增高1.25倍,同时AR-B增高1.15倍。差异有统计学意义(P<0.05)。而Gleason评分<7的前列腺癌组织中,AR-A和AR-B的表达量及二者比例较正常前列腺组织和前列腺增生组织增高(P<0.05)。临床分期>T2期的前列腺癌患者组织中,AR-A和AR-B的表达量及二者比例较临床分期≤T2期的前列腺癌患者组织高,但差异无统计学意义,可能与临床分期>T2期的前列腺癌患者数量较少有关。为在组织中进一步确证A／B同型雄激素受体蛋白的表达,我们使用双重免疫荧光组织化学结果显示：前列腺癌组织中AR-B和AR-A+B雄激素受体表达量较正常前列腺2.53倍和2.10倍,差异有统计学意义(P<0.05)。前列腺癌组织中AR-B和AR-A+B雄激素受体表达量较前列腺增生组织中表达量增高2.31倍和1.93倍,差异有统计学意义(P<0.05). Gleason评分>7的前列腺癌患者组织中AR-B的表达量较Gleason评分≤7的前列腺癌患者组织中增高1.25倍,同时AR-A+B增高1.15倍,差异有统计学意义(P<0.05)。A／B同型雄激素受体蛋白的表达临床分期无关,可能与临床分期>T2期的前列腺癌患者数量较少有关。此结果与Western Blot结果相符。我们使用Realtime—PCR技术检测了前列腺癌,前列腺增生和正常前列腺标本中AR mRNA的表达水平,结果显示正常前列腺组织和前列腺增生组织中AR mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。前列腺癌组织中AR mRNA表达增高10.65倍(P=0.019)和11.93倍(P=0.019)。前列腺癌组织中,Gleason评分>7的前列腺癌患者组织中AR mRNA的相对表达量增高,较Gleason评分≤7的前列腺癌患者组织中AR mRNA的表达量增高5.02倍。差异有统计学意义(P<0.05)。分期>T2的前列腺癌患者组织中AR mRNA的相对表达量增高,较分期≤T2的前列腺癌患者组织中AR mRNA的表达量增高1.45倍,差异无统计学意义,考虑与分期>T2的前列腺癌组织仅仅4例,数量较少有关。在胞浆蛋白与胞核蛋白分别电泳的结果中,我们发现AR-A雄激素受体蛋白仅在胞浆蛋白中表达,胞核蛋白中不表达AR-A雄激素受体蛋白,而AR-B雄激素受体蛋白在胞浆蛋白和胞核蛋白中都有表达。进一步研究结果显示：LNCaP细胞雄激素饥饿培养5天后,加入睾酮刺激2小时,AR-A雄激素受体蛋白可以在睾酮刺激下由细胞浆转运进入LNCaP细胞核内。在进行免疫共沉淀后行Western Blot检测的结果显示：A／B同型雄激素受体二者不可形成异二聚体。此结果与AR-A／B在亚细胞结构分布不同相印证：如果AR-A与AR-B能形成异二聚体,则二者不可能在亚细胞结构分布上如此不同。为进一步研究AR-A在前列腺癌细胞中的生物学活性,我们使用pEGFP-AR质粒通过突变后,制作出仅表达AR-A的新质粒pEGFP-AR-A。通过质粒转染技术将AR-A转染进入不表达雄激素受体的前列腺癌细胞系PC3细胞,获得仅仅表达AR-A的前列腺癌细胞PC3-AR-A。通过增殖实验我们发现,AR-A可以抑制前列腺癌细胞PC3细胞的增殖,抑制率在第3天以后维持在61%左右,而AR-B的抑制率仅维持在10%—20%。侵袭实验和增殖实验结果显示,AR-A和AR-B都可以抑制前列腺癌细胞的侵袭能力和增殖能力,AR-A转染的PC3细胞的迁移、侵袭能力较PC3组降低20.6%和29.3%。AR转染的PC3细胞侵袭、迁移能力最低,较PC3组降低39.4%和44.4%。结论A／B同型雄激素受体在原发性前列腺癌的组织中表达量增高,且A／B二者比例增高。A／B同型雄激素受体蛋白的表达量和表达比例与病理分级及临床分期有关。侵袭实验结果显示,AR-A可以降低前列腺癌细胞的侵袭能力和增殖能力。前列腺癌组织中的A／B同型雄激素受体表达增高可能与前列腺癌发生发展有关,且AR-A表达绝对量和比例增高可能是晚期、低分化前列腺癌进展的自我保护现象。使用特异性AR-A受体激动剂,增强前列腺癌中的AR-A的活性从而抑制前列腺癌细胞增殖,并降低前列腺癌细胞的侵袭能力和增殖能力,可能成为治疗前列腺癌的一种有效方法。
杨铁军[3]2016年在《ELL2在前列腺癌中的功能与泛素化的研究》文中提出背景和目的前列腺癌是男性发病率第二的肿瘤,仅次于第一位的肺癌,其死亡率在男性恶性肿瘤中排第五位。近二十年来,中国前列腺癌的发病率明显升高。虽然前列腺癌在诊疗上取得了很大进展,但是,临床工作中关于前列腺癌的恶性程度与预后判断缺乏有效的检测指标,而且,多数患者在历经一段有效的雄激素阻断治疗阶段后,最终演变为去势抵抗性前列腺癌,目前的治疗方法效果有限,如何控制雄激素非依赖前列腺癌进展,是泌尿系肿瘤领域众所周知的难题。ELL2(eleven-nineteen lysine-rich leukemia 2)是ELL家族中重要的一员,作为SEC(super elongation complex)超级延伸复合体的主要成分,它与结合因子EAF1(ELL-associated factor 1)、EAF2(ELL-associated factor 2)等共同形成超级延伸复合体,作用于RNA聚合酶II,调节转录延伸速度。真核细胞转录调节异常是人类诸多疾病的原因,该领域是近年来的研究热点。ELL2作为ELL蛋白家族中的一员,与ELL类似,它同样可结合RNA聚合II,加快转录延伸速度,但ELL2表达或功能的异常是否同样参与了前列腺癌的发生发展过程,目前尚未见报道。肿瘤的发生是多种致病因子共同作用的结果,其中重要的一点是细胞脱离正常生长周期的调控,表现为过度增殖倾向,而且,肿瘤细胞逃逸正常免疫系统的监视,其程序性死亡(凋亡)的调控出现异常,呈现出永生化倾向。细胞凋亡率降低是肿瘤形成和发展的重要因素之一,调控细胞凋亡信号通路的主要有以下两条:细胞外死亡诱导信号如Fas配体和Fas受体信号通路以及细胞内固有的凋亡通路(即程序性细胞死亡通路)。两者最终都通过激活胞内休眠的蛋白酶起作用,如caspase蛋白家族。前期的研究发现,在前列腺增生组织中,ELL2表达水平上调,但是,ELL2是否对前列腺癌细胞的增殖与凋亡有调控作用,尚不十分清楚。造成前列腺癌的预后不良的另外一个原因是其转移和进展。在肿瘤细胞迁移和侵袭的过程中,基质金属蛋白酶(MMPs)起着主要作用,MMPs可以降解细胞外基质(ECM),提高肿瘤细胞的侵袭力,尤其是MMP1、MMP2、MMP3和MMP9等。此外,细胞黏附分子,如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)等在肿瘤细胞迁移中也起一定作用。ELL2对于前列腺癌细胞侵袭与迁移能力的影响也有待于实验证实。真核细胞内的大多数蛋白质通过泛素-蛋白酶体途径降解,泛素化是蛋白质翻译后修饰的过程,对蛋白活化、浓度调节、降解都发挥重要作用,如果需要上调靶蛋白水平,阻止其泛素化降解是一种重要方法。每个蛋白都在特定的赖氨酸位点与泛素结合,称之为泛素化位点,如果其他因子与该位点的赖氨酸竞争性结合,可阻止该蛋白降解。泛素结构高度保守,性状稳定,其多样性的基础是与靶蛋白结合后通过泛素自身的不同赖氨酸残基(Lys-residues)或氨基端(amimo terminus),形成结构与功能迥异的泛素聚合体。在一系列酶的作用下,靶蛋白与泛素链的复合体进入蛋白酶体内的催化中心,靶蛋白被降解,泛素单体再次游离,与下一个靶蛋白结合,循环往复。泛素的赖氨酸残基有7个,它们形成了不同的泛素链,目前研究较清楚的是Lys48在蛋白酶体途径的泛素化降解中起到重要作用,Lys63在细胞内信号传导中扮演重要角色。但是,还有5个赖氨酸残基参与形成的泛素链功能尚未明确,被称作“反常的泛素赖氨酸残基”,它们是Lys6,Lys11,Lys27,Lys29,Lys33,而且,研究者发现这些反常泛素链的形成与靶蛋白诸多细胞功能相关,是近期研究的热点。有研究表明,下调泛素连接酶Siah可稳定ELL2蛋白在体内的水平,从而保证ELL2构建超级延伸复合体并参与RNA聚合酶的转录调控过程。但ELL2经泛素化途径降解的具体分子机制仍需进一步探讨。本课题首先以临床患者前列腺的病理标本为研究对象,应用免疫组化技术检测人体前列腺癌组织与正常前列腺组织中ELL2表达差异,观察随着前列腺癌的恶性程度增高,ELL2表达趋势的改变;继而以前列腺癌C4-2细胞为研究对象,分别瞬时转染ELL2-si RNA下调ELL2基因表达与Flag-ELL2质粒上调其表达,利用MTT实验、流式细胞技术、Transwell小室技术等观察对前列腺癌细胞增殖能力、凋亡率、侵袭力与迁移的影响;利用Western-Blot观察增殖相关蛋白PCNA、凋亡基因caspase-3与PARP、侵袭性与迁移能力相关因子MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、N-cadherin、E-cadherin和ICAM-1蛋白表达变化的表达变化,探讨ELL2可能在前列腺癌发生发展中的作用及分子机制。关于ELL2泛素化相关研究:以前列腺癌C4-2细胞为研究对象,通过降解时间对比与免疫共沉淀实验证实ELL2是通过泛素-蛋白酶体途径降解的蛋白。应用质粒重建与点突变技术,鉴定ELL2泛素化位点。以293细胞为研究对象,把EAF1、EAF2分别与ELL2共同瞬时转染后通过降解时间对比与泛素化免疫共沉淀实验鉴定EAF1与EAF2是否影响ELL2降解。最后,将ELL2与野生型泛素或不同的泛素赖氨酸残基突变体共同转染,免疫共沉淀实验鉴定参与ELL2泛素化的泛素赖氨酸残基。本研究探索ELL2在前列腺癌中的作用,为调控ELL2在细胞内的蛋白浓度,进一步研发治疗前列腺癌的靶点与药物奠定基础。方法1.ELL2在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响1.1 ELL2在前列腺癌中的表达分别收集临床前列腺癌组织29例及正常组织22例,免疫组织化学方法检测ELL2在这两种不同组织中的表达情况。1.2雄激素作用下对前列腺癌细胞ELL2表达的影响用人工合成雄激素R1881刺激前列腺癌细胞株LNCa P和C4-2,Western blot和Real-time PCR检测不同浓度及不同作用时间R1881对ELL2的影响。1.3 ELL2对前列腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响分别用ELL2-si RNA和Flag-ELL2质粒转染前列腺癌C4-2细胞,应用MTT方法检测细胞增殖率的变化;应用流式细胞技术检测细胞凋亡率的变化;Western blot方法检测增殖细胞核抗原PCNA及凋亡蛋白Caspase3、PARP的变化;应用Transwell小室检测细胞侵袭、迁移能力的改变;Western blot方法检测MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、ICAM-1、N-cadherin和E-cadherin的表达变化。2.ELL2泛素化降解关键片段、位点的研究;EAF1/EAF2对ELL2降解的影响;参与ELL2降解的泛素赖氨酸残基的研究2.1 ELL2蛋白稳定性的检测用人工雄激素R1881刺激前列腺癌C4-2细胞表达ELL2蛋白后,应用CHX抑制蛋白合成,Western blot检测每小时ELL2蛋白水平,连续5小时;分别用C4-2细胞及转染ELL2的293细胞,检测蛋白合成抑制剂CHX及蛋白酶体抑制剂MG132对内源性及外源性ELL2降解的影响。2.2 ELL2泛素化途径降解及降解片段、位点的检测Flag-ELL2与HA-Ub质粒共转染293细胞,MG132抑制蛋白酶体功能,应用抗Flag的琼脂糖珠做免疫共沉淀实验,Western blot检测泛素表达情况;之后,将不同ELL2片段的Flag载体重组质粒(片段1:aa1-aa292,片段2:aa293-aa531,片段3:aa532-aa640)转染C4-2细胞,应用CHX抑制蛋白合成后,Western blot检测各片段4h、8h、12h、24h与1h、2h、3h、4h时间点Flag表达水平,对片段3加测15min、30min、45min、60min、75min时间点Flag表达水平;最后,将ELL2片段3(aa532-640)所包括的9个赖氨酸,均制备Flag载体K/R点突变质粒并转染C4-2细胞,应用CHX抑制蛋白合成,Western blot检测时间点0、6h、12h、24h的ELL2蛋白水平的变化。2.3 ELL结合因子EAF1/EAF2对ELL2降解影响的研究Flag-ELL2分别与Myc-Vector、Myc-EAF1与Myc-EAF2共同转染293细胞,应用CHX抑制蛋白合成,Western blot检测0h、6h、12h、24h ELL2蛋白水平;之后,将Flag-ELL2与HA-Ub共转染至293细胞后,再分别转染Myc-Vector、Myc-EAF1与Myc-EAF2,应用MG132抑制蛋白酶体,抗FLAG琼脂糖珠行免疫共沉淀实验,利用Western blot方法检测泛素与ELL2水平。2.4 ELL2泛素化降解的泛素赖氨酸位点的研究将野生型泛素质粒和不同的泛素赖氨酸残基突变体(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)与Flag-ELL2共转染至293细胞,应用MG132抑制蛋白酶体,抗FLAG琼脂糖珠行免疫共沉淀实验,Western blot检测泛素与ELL2水平。结果1.ELL2在前列腺癌中的表达及其对前列腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响1.1 ELL2在前列腺癌中的表达降低免疫组化结果显示,与正常前列腺组织相比,前列腺癌组织中ELL2表达明显降低(P<0.05),且随着Gleason评分的增高,ELL2表达呈逐渐降低的趋势(P<0.01)。1.2 ELL2表现为雄激素依赖性Western blot和Real-time PCR结果显示,R1881刺激后,LNCa P和C4-2细胞中ELL2蛋白(P<0.05)及m RNA(P<0.05)水平均升高,且在一定范围内表现为剂量、时间依赖性。1.3 ELL2对前列腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响MTT结果显示,前列腺癌C4-2细胞在转染ELL2-si RNA后,细胞增殖率上升(P<0.001)PCNA在蛋白水平上升(P<0.05),而在转染Flag-ELL2后,增殖率下降(P<0.001),PCNA在蛋白水平下降(P<0.05);流式细胞仪结果显示,转染ELL2-si RNA组凋亡率下降(P<0.05),而转染Flag-ELL2组凋亡率升高(P<0.01),Western blot结果显示:转染ELL2-si RNA组Caspase3、PARP蛋白水平下降(P<0.05;P<0.01),而转染Flag-ELL2组Caspase3、PARP蛋白水平升高(P<0.001;P<0.001);Transwell结果显示,转染ELL2-si RNA组细胞侵袭、迁移能力均增加(P<0.01,0.05;P<0.01,P<0.05),MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均升高(P<0.01;P<0.01;P<0.01),N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均升高(P<0.05;P<0.05),E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05),而转染Flag-ELL2组细胞侵袭、迁移能力则下降(P<0.01;P<0.01),MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均下降(P<0.05;P<0.01;P<0.01),N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均下降(P<0.01;P<0.05),E-cadherin蛋白水平升高(P<0.001)。2.ELL2泛素化降解关键片段、位点的研究;EAF1/EAF2对ELL2降解的影响;参与ELL2降解的泛素赖氨酸残基的研究2.1 ELL2是不稳定蛋白Western blot结果显示,应用CHX抑制蛋白合成后,ELL2蛋白水平逐渐下降,到5小时降至起点的20%以下;Western blot结果显示,无论是内源性还是外源性合成的ELL2蛋白,应用蛋白酶体抑制剂MG132后,ELL2蛋白水平均明显高于对照组(P<0.05;P<0.05)。2.2 ELL2经泛素化途径降解;片段3(aa532-aa640)对于维持其蛋白稳定性较重要;K571、K584、K599叁个赖氨酸位点的突变有助于其维持蛋白结构的稳定性Flag-ELL2与泛素共同转染293细胞,应用抗Flag的琼脂糖珠做免疫共沉淀实验,Western blot结果显示,应用MG132抑制蛋白酶体后,在ELL2蛋白上方区域可见到明显的泛素条带,而对照组无泛素条带;不同片段的ELL2载体转染C4-2细胞后,Western blot结果显示,片段3(aa532-aa640)降解速度明显快于其他两段,75min时已经大部分降解;片段2(aa293-aa531)最稳定,12h时降解尚不明显;片段1(aa1-aa292)降解速度居中;不同位点的ELL2突变体转染至细胞后,Western blot结果显示,突变体K/R571、K/R584、K/R599的降解速度明显较野生型ELL2慢,其他突变体与野生型ELL2相似。2.3 ELL结合因子EAF1/EAF2有助于维持ELL2蛋白的稳定性与转染Myc空载体相比较,转染Myc-EAF1与Myc-EAF2均导致ELL2降解减慢。相比之下,转染Myc-EAF2对ELL2降解的影响更明显;并且,分别将Myc-EAF1、Myc-EAF2、HA-Ub与Flag-ELL2共转染293细胞后,应用抗Flag的琼脂糖珠做免疫共沉淀实验,Western blot结果显示,转染Myc-EAF1与Myc-EAF2的两组较转染Myc-Vector组泛素条带明显减弱,且ELL2对应条带明显增强。2.4有5个泛素赖氨酸位点参与ELL2的泛素化降解野生型泛素质粒和7个不同的泛素赖氨酸残基突变体分别与Flag-ELL2共转染293细胞后,应用抗Flag的琼脂糖珠做免疫共沉淀实验,Western blot结果显示,应用MG132抑制蛋白酶体后,K6、K11、K33、K48、K63均可见泛素条带,其中K63、K6、K48较强。结论1.ELL2在人体前列腺癌组织中表达降低,且与肿瘤恶性度相关。2.ELL2是雄激素反应蛋白,其表达的异常可能与去势抵抗性前列腺癌的进展相关。3.ELL2蛋白上调在一定程度上可抑制前列腺癌细胞的增殖,增加其凋亡率,并抑制其侵袭、迁移能力,ELL2参与了前列腺癌的发生发展过程。4.ELL2蛋白在体内经泛素-蛋白酶体系统降解,其与泛素结合位点主要在氨基酸片段aa532-aa640中,该片段在维持ELL2的稳定性上最为重要,K571、K584、K599叁个赖氨酸是ELL2的泛素化位点;ELL的辅助因子EAF1、EAF2均可通过阻止ELL2泛素化而维持ELL2蛋白结构的稳定性。这些对ELL2蛋白结构的发现有助于调控ELL2细胞内水平,从而为治疗相关疾病提供分子水平上的依据。5.除K63及K48赖氨酸残基外,还存在多个泛素赖氨酸残基参与ELL2泛素化过程,提示ELL2可能与多种细胞功能有关。
方习武[4]2004年在《雄激素受体及其亚型在前列腺癌进展中的实验研究》文中认为目的：1．建立雄激素非依赖性LNCaP前列腺癌细胞模型；2．研究雄激素受体及其亚型在LNCaP前列腺癌进展中的作用。3．研究雄激素非依赖性LNCaP前列腺癌细胞的凋亡。 方法：1．在常规RPMI 1640培养液中，对依赖雄激素生长的父代LNCaP前列腺癌细胞进行连续传代培养，依传代次数的不同，依次建立LNCaP C-33，C-51和C-81叁种前列腺癌亚细胞株。然后用双氢睾酮和氟他胺在体内和体外实验中对上述叁种LNCaP前列腺癌亚细胞株的生长特性及其雄激素依赖性进行研究，以论证所建立的前列腺癌细胞模型。2．用RT-PCR和Western Blot方法检测叁种LNCaP前列腺癌亚细胞株中AR mRNA和AR蛋白的表达水平。3．放免法检测不同LNCaP前列腺癌亚细胞株的PSA分泌。4．Western Blot方法检测DHT对不同LNCaP前列腺癌亚细胞株PSA分泌的影响。5．MTT法检测不同LNCaP前列腺癌亚细胞株的细胞活力。6．DNA片段电泳分析和Annexin V-PI双染法流式细胞仪检测不同LNCaP前列腺癌亚细胞株的细胞凋亡。 结果：1．本实验建立了LNCaP C-33，C-51和C-81叁种前列腺癌亚细胞株，经论证这叁种前列腺癌亚细胞株具有不同的生长特性及其雄激素依赖性，其中LNCaPC-81前列腺癌亚细胞株为雄激素非依赖性的前列腺癌细胞，因此建立了雄激素非依赖性LNCaP前列腺癌细胞模型。2．RT-PCR和Western Blot检测显示，AR mRNA和总AP蛋白在3种LNCaP前列腺癌亚细胞株中的表达无差异，但LNCaP C-81细胞表现有特征性的AR-A亚型表达增加和AR-B亚型表达降低。3．放免法检测到3种LNCaP前列腺癌亚细胞株的PSA分泌有差异，其中LNCaP C-81前列腺癌亚细胞株的PSA分泌水平最高。4．Western Blot检测到DHT对LNCaP C-33亚细胞株PSA分泌的刺激作用要强于LNCaP C-81亚细胞株。5．MTT法检测到LNCaP C-81前列腺癌亚细胞株比LNCaP C-33和C-51前列腺癌亚细胞株有更强的活力。6．DNALadder和Annexin V-PI双染法流式细胞仪检测到LNCaP C-81亚细胞株的抗凋亡能力强于LNCaP C-33和C-51亚细胞株。 结论：1．体内和体外研究结果证实，在常规RPMI 1640细胞培养液中，对依赖雄激素的父代LNCaP前列腺癌细胞进行连续传代培养时，LNCaP前列腺癌细胞的生物学行为会发生改变。随传代次数的增加，LNCaP前列腺癌细胞对雄激素的依赖性逐渐降低，显示了LNCaP前列腺癌细胞由雄激素依赖性生长转变为雄激素非依赖性生长的过程。本实验建立的LNCaP前列腺癌细胞模型为雄激素非依赖性细胞模型，它可模拟临床上在未进行雄激素干预治疗时前列腺癌的进展过程，并为研究前列腺癌中文摘要在自然状态下进展的分子机制提供又一个实用模型。2.在LNCaP前列腺癌进展过程中，始终有AR蛋白表达，且AR总表达水平没有改变，表明AR和AR信号途径的激活可能是LNCaP前列腺癌进展的关键步骤。但在LNCaP前列腺癌进展过程中，AR亚型有差异性表达，由于AR亚型在结构和功能上的差异，这可能会使LNCaP前列腺癌的AR信号激活途径发生改变。3.在本实验的LNCaP前列腺癌进展过程中，PSA分泌水平逐渐升高，且DHT对LNCaP前列腺癌细胞PSA分泌的调节作用逐渐降低，证实血清PSA水平检测是监测前列腺癌进展和复发的可靠指标，并可作为判断各种治疗方法疗效的可靠指标。4.在LNCaP前列腺癌进展过程中，癌细胞抗凋亡特性的获得是一个重要机制，而LNCaP前列腺癌细胞的抗凋亡机制可能与AR和AR信号传导途径的异常激活有关，具体分子作用机制有待于进一步研究。
刘艳波[5]2009年在《1. 减毒沙门氏菌携带GRIM-19及Survivin-特异shRNA共表达质粒对前列腺癌的治疗作用 2. 有机硒抑制激素非依赖性前列腺癌的发生》文中提出Survivin是前列腺癌高表达基因,GRIM-19基因(gene associated with retinoid-IFN-induced mortality 19)是一种由IFN-β联合维甲酸诱导表达的细胞死亡调节因子,其过度表达会导致细胞凋亡。应用RNAi技术沉默Survivin可达到抑制前列腺癌生长的作用,为提高其抗肿瘤效应,联合GRIM-19与之建立共表达载体以加强促细胞凋亡效应;体外实验已证明甲基硒酸(MSA)具有抗雄激素依赖性前列腺癌的作用。目的: (1)通过体内外实验探讨pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒抗前列腺癌作用与机制;探讨减毒沙门氏菌作为该共表达质粒运载体进行体内实验的可行性。(2)在成功建立去势后复发型前列腺癌模型的基础上,探讨甲基硒代半胱氨酸(MSC)抑制激素非依赖性前列腺癌的发生并探讨相关机制。方法:(1)应用脂质体法将pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒及对照质粒转染至人前列腺癌细胞DU145内,通过MTT法检测细胞增殖抑制情况,流式细胞术等观察细胞周期与凋亡,以RT-PCR、Western blot法检测目的基因与相关基因和蛋白的表达;复制裸鼠前列腺癌皮下移植瘤模型,腹腔注射携带pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒等的减毒沙门氏菌,进行抗肿瘤作用与机制的研究。(2)复制裸鼠前列腺癌去势后复发模型,观察MSC对前列腺癌雄激素依赖性的影响。.结果:(1)通过体内外实验证明pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒的抗前列腺癌作用优于单基因治疗组,显示出明显的协同效应:①增殖抑制实验结果显示,共表达质粒显着地抑制DU145细胞的增殖活性;②流式细胞术和Annexin V-FITC等检测分析发现:共表达质粒的促凋亡作用最为显着;③DU145细胞的免疫荧光染色显示Survivin的表达聚集在细胞核及其周围的胞浆中;④共表达质粒组Stat3、c-Myc、cyclinD1、BcL-xL和VEGF基因和蛋白表达明显抑制,而caspase3的基因与蛋白表达显着上调。体内实验证明,携带pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒的减毒沙门氏菌治疗组的抗肿瘤作用最明显,主要是通过促凋亡作用实现的;(2)MSA体外可抑制人激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞的增殖并降低雄激素受体表达;MSC可抑制去势诱导的激素非依赖性前列腺癌的发生。结论:减毒沙门氏菌携带pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒,在抗前列腺癌作用中显示明显的协同作用;MSC可抑制去势诱导的激素非依赖性前列腺癌的发生。本研究所采用的技术路线及实验结果在国内外均未见报道。
王敏[6]2016年在《LSD1介导前列腺癌侵袭、转移的机制研究》文中研究指明赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶(Lysine specific demethylase 1,LSD1)属于单胺氧化酶家族,它的活性依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide,FAD),能够特异性使单甲基化和二甲基化H3K4和H3K9位点上的甲基基团去除,从而调节靶基因的转录活性。染色质是真核细胞遗传物质的载体。核小体是构成它的基本结构单位,是由DNA和组蛋白共同构成的。每个组蛋白通常含有一个由核小体DNA包绕形成的球形芯和一个N-末端尾部,N-末端尾的核心/DNA结构域受到多种翻译后修饰的调节,例如乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化等。在2004年以前,人们一直认为组蛋白的乙酰化、磷酸化和泛素化等都是可逆的,但是组蛋白甲基化是不可逆的,而第一个组蛋白去甲基化酶LSD1的出现改变了人们的这一观点。LSD1在哺乳动物的发育过程中发挥着至关重要的作用,它参与许多生物学过程,如细胞分化、基因活化和基因抑制等。研究发现,LSD1在多种肿瘤中表达增高,也包括前列腺癌。在前列腺癌中,LSD1通过影响细胞转录、DNA甲基化和P53的功能,来促进肿瘤形成。LSD1的高表达不仅预示着前列腺癌的术后可能复发率增高,还预示着疗效差。第一部分LSD1和E-cadherin在前列腺癌中的表达关系目的：为了探讨LSD1和E-cadherin在前列腺癌中的表达、两者之间表达关系以及它们跟前列腺癌预后的联系。方法：用免疫组织化学方法检测LSD1和E-cadherin在良性前列腺增生组织和前列腺癌组织中的表达,然后用相关性分析分析LSD1和E-cadherin两者之间的表达关系。同时,我们用或不用LSD1抑制剂优降宁处理雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCap,然后用免疫印迹的方面检测优降宁处理前后LNCap细胞内LSD1和E-cadherin的表达水平。结果：跟良性前列腺增生组织比较,LSD1在前列腺癌组织中表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)；同时,LSD1在前列腺癌中的表达跟Gleason评分、远处转移和预后不良呈明显正相关(P<0.05)。然而,跟良性前列腺增生组织比较,E-cadherin在前列腺癌组织中表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)；同时,E-cadherin在前列腺癌中的表达跟Gleason评分、远处转移和预后不良呈明显负相关(P<0.05)。我们进一步用相关性分析分析LSD1和E-cadherin两者之间在良性前列腺增生组织和前列腺癌组织中的表达关系发现,两者呈明显的负相关(rs=-0.486, P=0.001)。LSD1高表达和E-cadherin氐表达预示前列腺癌患者两年内更容易进展为去势抵抗性前列腺癌以及较低的五年生存率(P<0.05)。另外,我们的细胞实验发现,用优降宁抑制LNCap细胞内LSD1活性,可以上调E-cadherin蛋白的表达水平。结论：LSD1在前列腺癌中高表达,并跟Gleason评分、远处转移和预后不良呈正相关；而E-cadherin在前列腺癌中低表达,并跟Gleason评分、远处转移和预后不良呈负相关。LSD1和E-cadherin的表达在前列腺癌组织中呈负相关。LSD1高表达联合E-cadherin低表达可能能作为判断前列腺癌进展和转移的一个标志。抑制LSD1活性可能为治疗前列腺癌提供新的治疗方向。第二部分LSD1抑制剂优降宁抑制前列腺癌EMT发生并延缓前列腺癌的进展目的：探讨LSD1在前列腺癌上皮间质转化过程以及向去势抵抗性前列腺进展中发挥的作用。方法：首先,我们用优降宁处理激素依赖性前列腺癌细胞株LNCap进行体外实验,用免疫印迹的方法检测H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1、H3K9me2、 AR、PSA、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等蛋白的表达水平；用免疫荧光的方法检测优降宁处理前后LNCap细胞E-cadherin的表达改变；用transwel细胞侵袭和迁移实验检测优降宁处理前后LNCap细胞的侵袭能力改变。另外,我们用NOD/SCID小鼠皮下种植LNCap细胞建立皮下肿瘤模型,再切除小鼠的双侧睾丸建立去势抵抗性前列腺癌模型；用免疫印迹的方法检测LSD1、H3K4me1、 H3K4me2、H3K9me1、H3K9me2、AR、PSA、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等蛋白的表达水平；观察优降宁处理对肿瘤生长的影响和对去势后小鼠血清PSA变化的影响。结果： 在体外,优降宁降低LNCap细胞的侵袭和迁移能力；优降宁处理LNCap细胞后抑制LSD1功能,减少H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1、 H3K9me2的表达；优降宁处理LNCap细胞后不改变AR的表达,但是减少PSA的表达；优降宁处理LNCap细胞后,增加E-cadherin蛋白的表达,同时减少N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白的表达,从而抑制上皮基质转化过程。在动物模型体内实验,LSD1蛋白的表达随着前列腺癌向激素抵抗性前列腺癌进展而增加；优降宁处理小鼠后抑制LSD1功能,减少H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1、 H3K9me2的表达；优降宁处理小鼠后不改变AR的表达,但是减少PSA的表达；优降宁处理小鼠后,增加E-cadherin蛋白的表达,同时减少N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白的表达,从而抑制上皮基质转化过程。结论：抑制LSD1功能能够抑制前列腺癌的侵袭、转移能力,抑制上皮基质转化过程,LSD1抑制剂也许可以作为抗雄激素治疗治疗局部进展性前列腺癌和转移性前列腺癌的的辅助治疗。
何云东[7]2014年在《天然小分子化合物臭椿酮(Ailanthone)抑制去势抵抗性前列腺癌生长和转移的功能与机理研究》文中研究指明前列腺癌是中老年高发恶性肿瘤,其发病率在全球占所有恶性肿瘤的第二位,致死率占第六位,而我国随着生活水平和节奏的改变近年来前列腺癌发病率不断飙升,以每年10%的速度在增加。前列腺癌发展的后期会转变为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC),激素疗法和去势疗法无效而发生转移,这是导致病人死亡的重要原因。而去势抵抗性前列腺癌与雄激素受体(AR)的异常激活密切相关,目前靶向AR信号通路的药物是临床上治疗前列腺癌以及去势抵抗性前列腺癌的有效手段。使用抗雄激素药物如2011年和2010年FDA批准的MDV3100(Enzalutamide)和阿比特龙(Abiraterone)可以显着提高去势抵抗性前列腺癌患者的生存率。然而,经过一段时间治疗后病人肿瘤中的AR会发生突变,突变的AR失去其配体结构域(ligand binding domain, LBD)而不依赖其配体雄激素(如双氢睾酮,DHT)而自发持续激活,这种AR我们称之为持续激活突变型AR (constitutively active truncated AR splice variants, AR-Vs)。 AR-Vs是导致雄激素受体拮抗剂(例如MDV3100)治疗无效和药物抵抗的重要原因。因此,全长型AR (AR-FL)和持续激活突变型AR (AR-Vs)是治疗CRPC的重要靶点。为筛选可以同时抑制AR-FL和AR-Vs转录活性的小分子化合物,本文运用雄激素双氢睾酮(DHT)激活全长的AR (AR-FL)以及缺失LBD端的AR1-651代表持续激活突变型AR(AR-Vs)建立同时抑制AR-FL和AR-Vs转录活性的荧光素酶(Luciferase)报告基因筛选模型。本实验以中草药小分子单体化合物库为药物筛选源,通过上述Luciferase报告基因筛选得到对全长和突变型AR都有强烈抑制效果的天然小分子化合物臭椿酮(Ailanthone, AIL)。进一步研究发现AIL对表达雄激素受体的前列腺癌细胞株具有较好的敏感性,通过体内和体外实验证明该化合物不仅能高效抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP的增殖,而且能抑制雄激素受体突变的前列腺癌细胞株22RV1(该细胞株表达持续激活的突变雄激素受体,且对临床药物雄激素受体拮抗剂比卡鲁胺(Bicalutamide)和MDV3100具有耐药性)的增殖。本研究发现AIL可以同时降低癌细胞中AR-FL和AR-Vs的蛋白表达以及下调其下游基因的表达。进一步实验证明该单体通过结合p23蛋白而抑制AR与热休克分子伴侣之间的结合,从而诱导AR发生泛素化被蛋白酶体降解。另外,本研究从体内水平证明了该单体能够抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的生长和转移。此外,利用肝微粒体实验发现AIL对肝脏主要CYP代谢酶无明显抑制作用。根据以上结果,中草药单体臭椿酮有望成为治疗早期雄激素依赖性前列腺癌和晚期去势抵抗性前列腺癌的备选化合物。
王林[8]2011年在《姜黄素对人前列腺癌DU-145细胞TGF-β/Smads信号传导通路的影响》文中研究表明目的：探讨中药提取物姜黄素对人雄激素非依赖性前列腺癌DU-145细胞TGF-β/Smads信号传导通路的影响,从而探讨姜黄素抑制DU-145细胞的机理。方法：采用细胞培养技术,将姜黄素配制成12.5μmol/l、6.25μmol/l以及3.125μmol/l叁个不同浓度组的溶液,分别处理DU-145细胞48小时。以光镜观察DU-145细胞形态变化,以MTT法检测DU-145细胞生长情况,以ELLISA法和RT-PCR法检测TGF-β,SMAD2, SMAD4和SMAD7的浓度和表达情况。结果：姜黄素溶液作用DU-145细胞48小时后,出现了细胞凋亡的形态学改变,表现为数量减少、体积缩小、染色质凝集、核固缩；DU-145细胞生长受到抑制,呈一定的量效关系；ELLISA法检测DU-145细胞TGF-β,SMAD2和SMAD4的吸光度OD值(代表上述物质浓度)均不同程度增加,而SMAD7的OD值不同程度减少；RT-PCR法检测DU-145细胞TGF-β,SMAD2和SMAD4基因表达均不同程度增加,而SMAD7的基因表达不同程度减少。两种检测法得出结果一致。结论：姜黄素通过对TGF-β及下游蛋白Smad2、Smad4、Smad7表达的影响,进而激活或调节TGF-β/Smads信号传导通路,这可能是姜黄素促进DU-145细胞凋亡和抑制其生长的重要分子机制。
许多[9]2015年在《雄激素受体剪切突变体促进前列腺癌细胞去势抵抗性生长的机制研究》文中研究指明2012年的统计数据表明，在全球范围内，前列腺癌的发病率居男性恶性肿瘤的第二位，死亡率居第五位。近十余年来，我国前列腺癌的发病率和死亡率均明显上升，其发病率已位居我国男性恶性肿瘤的第七位。2011年，我国将前列腺癌研究列入国家“973”计划项目。雄激素受体（Androgen Receptor, AR）在前列腺癌的发生和发展中具有关键作用。AR与其配体——雄激素结合后转移至细胞核，与靶基因启动子中的特异序列（雄激素反应元件，Androgen Response Elements, AREs）结合，从而调节靶基因的表达。前列腺特异性抗原（Prostate Specific Antigen, PSA）是受AR调节的重要靶基因之一，也是公认的前列腺癌诊断和预后的监测标志物。鉴于AR信号通路在前列腺癌发生与发展中的重要作用，内分泌疗法（或称雄激素剥夺疗法，Androgen DeprivationTherapy, ADT）一直作为治疗晚期前列腺癌的经典疗法。在我国，由于前列腺癌早期筛查未得到普及，大部分病人就诊时已是晚期，因此ADT是主要的治疗方法。在ADT治疗初期，伴随病人血清中PSA浓度的降低，ADT对绝大多数病人具有较好的疗效，但几乎所有病人最终都会对该疗法产生抗性，并发展为去势抵抗性前列腺癌（Castration-Resistant Prostate Cancer, CRPC）。CRPC是前列腺癌治疗领域的难点，也是导致病人因前列腺癌而死亡的主要原因。美国食品和药物管理局最近批准的治疗CRPC的新型内分泌药物恩杂鲁胺（Enzalutamide）和阿比特龙（Abiraterone）都是以AR为靶点，阻止其活化。使用新药可使CRPC病人的存活期延长4-5个月，但绝大多数病人在服药数月后即对药物产生耐受性，并伴有血清PSA浓度的升高，提示病人CRPC细胞中AR信号通路再激活。在CRPC中，AR剪切突变体（AR splice variants, AR-Vs）的表达量普遍高于激素依赖性前列腺癌（Hormone-Naive Prostate Cancer）。迄今为止，在前列腺癌细胞系及组织中共发现25种AR-Vs，其中AR-V7（又称AR3）及ARv567es是最具有临床意义的2种AR-Vs。相关临床研究表明，若前列腺癌组织中AR-V7高表达，则该病人手术后前列腺癌复发的几率更高；在CRPC组织中若存在AR-V7高表达或ARv567es的表达，则更易发生癌症的远端转移和病人的生存期缩短。而CRPC中AR-Vs表达上调可能是前列腺癌经ADT（包括恩杂鲁胺和阿比特龙）治疗后，CRPC生长与增殖的主要适应途径。本研究通过细胞模型，揭示AR-Vs/AR-Vs、AR-FL/AR-Vs之间的相互作用，阐明AR-Vs调控靶基因表达的方式以及促进CRPC发生发展的分子机制。利用分子克隆技术将AR-FL、AR-V7及ARv567es的cDNA克隆至双分子荧光片段互补（BiFc）系统中，并通过脂质体转染的方法，分别将上述表达质粒转染至AR null前列腺癌细胞系PC-3中。Western Blot技术检测目的蛋白的表达情况；荧光显微镜观察转染后细胞中AR-Vs/AR-Vs及AR-FL/AR-Vs的二聚化情况，探寻发生二聚化的作用位点；流式细胞术对荧光强度进行量化；激光共聚焦显微镜观察二聚化的AR-Vs/AR-Vs及AR-FL/AR-Vs的细胞内定位；雄激素反应元件报告基因系统检测AR-Vs/AR-Vs二聚体及AR-FL/AR-Vs二聚体的转录活性；qRT-PCR检测AR-Vs/AR-Vs二聚体及AR-FL/AR-Vs二聚体对靶基因（UBE2C、PSA）表达的影响；SRB检测AR-Vs/AR-Vs二聚化及AR-FL/AR-Vs二聚化促进前列腺癌细胞去势抵抗性生长的影响。Western blot结果表明，成功构建BiFc表达质粒BiFc-AR-FL、BiFc-AR-V7及BiFc-ARv567es；利用BiFc系统在荧光显微镜下观察及流式细胞术定量结果表明，AR-Vs/AR-Vs二聚化主要由D-box介导，而AR-FL/AR-Vs二聚化主要由FxxFL及D-box介导；激光共聚焦显微镜观察发现，AR-Vs二聚化对于其细胞定位并无影响，提示AR-Vs进入细胞核并不依赖于二聚化，而AR-FL/AR-Vs的二聚化对于AR-FL非雄激素介导的细胞核转移是必要的；雄激素反应元件报告基因及qRT-PCR结果显示，AR-Vs/AR-Vs二聚体及AR-FL/AR-Vs二聚体具有转录活性，可以调控其靶基因的表达；SRB结果表明，AR-Vs/AR-Vs二聚化或/和AR-FL/AR-Vs二聚化共同作用，可促进前列腺癌细胞去势抵抗性生长。以上研究提示，在ADT条件下，AR-Vs可通过AR-Vs/AR-Vs和/或AR-FL/AR-Vs二聚体调控靶基因的表达，促使前列腺癌细胞去势抵抗性生长。
闫天中[10]2005年在《前列腺癌雄激素非依赖的发生机理及熊果酸治疗作用的实验研究》文中进行了进一步梳理在欧美国家中,前列腺癌(PCa)的发病率占男性恶性肿瘤的第一位,肿瘤致死的第二位。我国前列腺癌的发病率也呈明显的上升趋势。雄激素阻断是PCa 治疗的最有效方法。但不幸的是,约80%的PCa 在去雄治疗后的18 个月左右发生雄激素非依赖性生长,而失去治疗作用,癌肿继续生长并恶化,病人死于该病。雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)的发生成为PCa 治疗中最棘手的问题。AIPC 发生的机制比较复杂,目前多认为雄激素受体(AR)的扩增和突变及甲基化所导致的经典的AR 激活途径的活性增高是其主要原因。尽管一些雄激素抵抗性前列腺癌有AR 表达的增高,但研究显示:PCa 在雄激素非依赖发生前后AR 基因扩增率很低,不足于单独解释AIPC 的进展,而突变的细胞也只占所有肿瘤细胞的一小部分,无法解释肿瘤整体上的雄激素非依赖状态。而在原发肿瘤中有AR 的扩增,其对雄激素撤除仍然有反应,在激素非依赖性肿瘤,针对AR 的治疗也没能逆转其雄激素非依赖性。可见,AR 途径活性增高学说尚缺乏有效依据。AR的丢失或失活在AIPC发生中的作用逐渐受到关注。雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)细胞株LNCaP和AIPC细胞株DU145在AR和GR(糖皮质激素受体)的表达方面存在巨大差异提示AR的丢失或失活,GR表达增高可能是AIPC发生的重要原因。HSP90是调节GR作用的最重要的分子伴侣,能激发GR功能与活性的发挥,GR途径的活化能引发下游炎性因子如IL-6等的大量分泌,且IL-6具有雄激素活性,这些炎症因子也是促进前列腺癌细胞不依赖雄激素生长的重要因素。我们推测,在去雄治疗所导致的生存压力下,癌细胞发生“细胞应激”,在HSP90的辅助下,通过高表达GR可以快捷地获得新的生长动力,在无雄激素情况下继续生长。所以,研究GR及其下游炎症因子IL-6等在前列腺癌中的表达及作用对探索AIPC的发生机制和治疗途径有重要意义。同时,探索应用调节激素平衡,调节代谢及免疫作用的药物来调节GR、AR途径之间的平衡,抑制异常活化的GR途径及其下游炎症因子的释放,以维持或恢复前列腺癌细胞对雄激素的反应性,使去雄治疗长期有效成为我们探索治疗方法的思路及途径。主要研究内容:
参考文献：
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