张 祎１ 杨卫东１ 于惠玲２通讯作者
１．河北保定市第二医院 河北 保定 ０７１０００;２．河北大学附属医院 河北 保定 ０７１０００
【摘要】 目的 观察５氟尿嘧啶(５－Fu)温热化疗对人胃癌MKN４５细胞的体外抑制、凋亡的效果.方法 根据预实验确定工作浓度.实验四组.MTT法检测细胞增殖的抑制作用;应用流式细胞术和逆转录－聚合酶链反应(RT－PCR)观察细胞凋亡及对survivin和Bcl－２表达变化.结果 热化疗组对MKN４５细胞抑制、促凋亡作用最明显;热化疗组Bcl－２与survivin下调最显著.survivin与Bcl－２蛋白的表达呈正相关性,细胞凋亡率与两种蛋白表达负相关.结论 热化疗能增加对MKN４５细胞的抑制及凋亡作用,可能与下调Bcl－２和survivin的表达有关. 【关键词】 热化疗; ５氟尿嘧啶; 胃癌; 凋亡; Bcl－２; survivinTheinhibitiveeffectandapoptosisofGastriccarcinomacelllineMKN４５withhyperthermiaand５－Fuinvitro ZHANGYI (MedicalOncology,secondHospitalofhebeibaoding,HeＧbeiProvince,０７１０００)【Abstract】Objective:Toobservetheinhibitiveeffect,apoptosisofMKN４５cellswith５－Fuandhyperthermia．Methods:MTTassaydeterminetheworkingconcentration．ThecellＧsweredividedintofourgroups．FCMandRT－PCRdeterminetheapoptosisrates,Bcl－２andsurvivinexpression．Results:５－Futhermo－chemotherapyshowedinhibitiveeffect、downregulateexpressionofthem．Thecorrelationbetweenthemispositive,apoptosisandprotionexpressionisnegative．Conclusion:５－Futhermo－chemotherapyinhibitcell,increasestheapopＧtosis,t【Khreoyuwgohrtdhse】down－regulationofthem． ５－Fu;thermo－chemotherapy;gastriccarcinomaA;bcl－２;survivinChineseLibraryClassification:R７３５．２R７３０．５８Documentcode:A 【中图分类号】R７３５．２【文献标识码】A 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０３９１－０１
导言近３O 年来,胃癌的发病率和病死率均居首位.恶性肿瘤的发展,是由于细胞的无限增殖、凋亡障碍所致.热化疗能明显诱导细胞的凋亡[１].survivin 和Bcl－２是主要凋亡抑制分子.该实验通过观察热化疗诱导胃癌细胞凋亡, 研究二者作用机制,为临床治疗提供实验依据. １ 材料和方法１．１ 药品与试剂 ５氟尿嘧啶;四氮甲唑蓝;兔抗人survivin,Bcl－２单克隆抗体,羊抗兔FITC－IgG,RT－PCR试剂盒;引物. １．２ 细胞培养 细胞接种于RPMI１６４０培养液中,３７℃恒温,５％CO２环境中培养,对数生长期细胞进行实验. １．３ 细胞的分组与处理 对照组细胞３７℃常规培养;化疗组加入５－FU;热疗组４３℃水浴加温６０min(温度波动幅度≤±０．２℃);温热化疗组方法同上.
１．４ MTT法确定测定细胞增殖抑制率 将细胞以５×１０４个??mL－１密度接种于９６孔培养板.２４h后加药和(或)加温,继续培养后加MTT,加二甲基亚砜,用全自动酶标仪测OD值,细胞增殖抑制率＝(对照组OD 均值－实验组OD均值)/对照组OD均值×１００％(公式一). １．５ 凋亡率的测定 收集各处理组细胞,以凋亡指数计算凋亡率.AI＝[细胞总数－(G０/G１＋S＋G２/M)各时相细胞数]/细胞总数×１００％(公式二) １．６ 测定Bcl－２,survivin的蛋白表达 取１ml单细胞悬液,分别加入１００μl兔抗人survivin和Bcl－２抗体和FITC－IgG二抗测蛋白表达量以均道值表示.
１．７ RT－PCR检测基因表达 提取细胞总RNA.Bcl－２上游引物５′－GAACＧTAAGGGTATGAAGGA －３′下游引物５′－CACTGGGTAAGACTAAAGG －３′, 扩增产物２０５bp;survivin上游引物５′－CATGGCCTGTCAGAAAATAC －３′下游引物５′－TAACCCGAGTAAGAATGTGC －３′扩增产物１７６bp;内参上游引物５′－AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA －３′下游引物５′－ACTCATCGTACGCＧCTGCTTGCTGA－３′扩增产物４７８bp.经过循环后终止反应.结果以两者光密度的比值表示.表达强度≥０．１０的值定为阳性. １．８ 统计学处理 采用SPSS软件进行单因素方差分析、直线相关与回归分析,P＜０．０５定为显著性标准.
２ 结果２．１ ５－fu浓度的确定 ５－fu对MKN４５细胞抑制作用存在时间、浓度依赖性(表１). ２．２ 细胞增殖抑制率和凋亡率测定 各处理组均有抑制作用,热化疗组细胞抑制率及细胞凋亡率最明显(P＜０．０５);(表２,图．１). ２．３ bcl－２、survivin蛋白和mRNA测定 各处理组细胞bcl－２、survivin的蛋白和mRNA的表达均降低,热化疗组最显著(P＜０．０５)(表３,图．２,３)(表４,图．４,５).
３ 讨论５－Fu为临床重要的化疗药.有试验证明其与PD１７３０７４联用诱导凋亡.bcl－２是最早发现的凋亡抑制蛋白,survivin则在其下游发挥抗凋亡作用. 研究发现豆蔻明和水飞蓟素下调Bcl－２,survivin表达,促进细胞凋亡,增强化疗敏感性.还有实验证明三氧化二砷诱导HL－６０细胞凋亡伴随二者表达降低.本试验结果发现热化疗抑制MKN４５细胞增殖,促进凋亡,可能是通过下调两种因子表达发挥作用.
表１ 确定实验浓度
Bcl－２１热化疗组２化疗组３热疗组４对照组survivin１热化疗组２化疗组３热疗组４对照组
参考文献[１] SaitohY,YoshimotoT,KatoSSynergiccarcinostati － ceffectsofascor －b(icacidandhy－perthermiaonEhrlichascitestumorcell．ExpOncol．２０１５Jun;３７ [ ２):９４－９． ２] YeYW,HuS,ShiYQ,CombinationoftheFGFR４inhibitorPD１７３０７４and５－fluＧorouracilre－ducesproliferationandpromotesapoptosisingastriccancer．OncolＧ[ Rep．２０１３Dec;３０(６):２７７７－８４ ３] WuN,LiuJ,ZhaoX,CardamonininducesapoptosisbysuppressingSTAT －３signalingpath－wayinglioblastomastemcells．TumourBiol．２０１５Jul７
论文作者:张祎１ 杨卫东１ 于惠玲２通讯作者
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/3
标签：细胞论文; 凋亡论文; 抑制论文; 引物论文; 蛋白论文; 胃癌论文; 作用论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;