（1.辽宁中医药大学研究生学院 辽宁沈阳 110032；2.辽宁中医药大学针灸推拿学院 辽宁沈阳 110032）
摘要：目的 观察艾灸对小鼠Lewis肺癌的抑制作用以及对肺癌组织Caspase-3蛋白表达的影响。方法 C57BL/6小鼠40只，右腋下接种Lewis肺癌瘤株后，完全随机分为模型组、顺铂组、艾灸组、艾灸联合顺铂组。给药14d后处死小鼠，无菌条件下取肿瘤组织，计算肿瘤相对增殖率和抑制率，采用免疫组化法测定各组小鼠Lewis肺癌组织Caspase-3的表达。结果 ①与模型组比较，艾灸组、顺铂组、艾灸联合顺铂组的肿瘤相对增殖率分别为58.75%、48.35%、46.44%，肿瘤抑制率分别为41.64%、52.44%、54.13%，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）；②艾灸组、顺铂组和艾灸联合顺铂组都可不同程度的使Caspase－3蛋白表达增加，与模型组相比有显著差异（P﹤0.01）。结论 ①艾灸法可诱导Lewis肺癌细胞凋亡，抑制肿瘤生长。②艾灸法可增加Caspase－3蛋白的表达。
关键词：艾灸；凋亡细胞；Caspase－3；Lewis 肺癌细胞
Effect of Moxibustion on Lewis Lung Cancer in Mice and Caspase-3 Protein Expression in Lung Cancer*
Chen Shibo，Wang Shujuan，Su zhuang
（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）
Abstract：Objective：To observe the inhibitory effect of moxibustion on Lewis lung cancer in mice and its effect on the expression of Caspas－3 protein in lung cancer.Methods：To select 40 C57BL/6 male mice，after inoculated Lewis lung cancer tumor strain，choose the 40 with Lewis lung cancer and randomly divided them into four groups：model group，cisplatin group，moxibustion group，moxibustion combined with cisplatin group. Mice were sacrificed 14d after administration，tumor tissue was removed under aseptic conditions，the relative tumor growth rate and inhibition rate were calculated.The expression of Caspase-3 in Lewis lung cancer tissues was detected by immunohistochemistry.Results：①Compared with the model group，the relative tumor proliferation rates of moxibustion group，cisplatin group and cisplatin combined with moxibustion group were 58.75%，48.35% and 46.44% respectively，and the tumor inhibition rates were 41.64%，52.44% and 54.13% respectively.Compared with model group，there was significant difference（P <0.01）.②Caspase-3 protein expression increased to varying degrees in moxibustion group，cisplatin group and cisplatin combined moxibustion group，with significant difference compared with the model group（P<0.05，P<0.01）.Conclusion：①Moxibustion method can induce cell apoptosis of Lewis lung cancer and inhibit tumor growth..②Moxibustion can increase the expression of Caspase-3 protein.
Keywords：Moxibustion；Apoptotic cell；Caspase-3；Lewis lung cancer cell
灸法是我国最早的治病方法之一，以点燃用艾叶制成的艾柱、艾条为主，通过熏烤人体的穴位来起到通经活络、祛湿散寒、消肿散结、回阳救逆、升提阳气的作用，可升血中之气，通气中之滞，能通诸经，而除百病。自产生后，其在不同的朝代有着不同程度的发展，唐代尤为兴盛。早在《灵枢 官能》就有“针所不为，灸之所宜”的记载。《医学入门》中有“凡病药之不及，针之不利，必须灸之”的说法，充分说明了艾灸的重要作用。
1.材料
1.1细胞株及动物Lewis肺癌细胞株；C57BL/6雄性小鼠40只，4-5周周龄，体重：（20±2）g，由上海灵畅生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证：SCXK（沪）2013-0018，合格证编号：2013001818522，实验动物使用许可证：SYXK（苏）2012-0004
1.2主要试剂及药物顺铂、艾条，顺铂由齐鲁制药（海南）有限公司提供，生产批号：1A2A1605010A；艾条由南阳市卧龙汉医艾绒厂提供，生产批号：20150816。配制方法 顺铂4℃保存，加生理盐水稀释至所需浓度，现配现用；艾条常温保存。
2.实验方法
2.1 Lewis肺癌模型的制备 收集培养小鼠肺癌细胞Lewis细胞悬液，将细胞液浓度调整为1×10^7个/ml，将调整好的细胞悬液摇匀，以每只0.1ml接种于小鼠右侧腋窝皮下，观察肿瘤生长，建立Lewis肺癌小鼠模型。
2.2 分组与给药 将上述40只造模后的小鼠随机分成4组，每组10只，造模后次日开始腹腔注射给药。模型组：腹腔注射生理盐水，0.1ml/10g，每周一次，给药2次；顺铂组：腹腔注射药物，0.05mg/10g，每周一次，给药2次；艾灸组：将艾条点燃，对准肿瘤部位施灸，每次持续5min，每天一次，连续14天；艾灸联合顺铂组：腹腔注射药物，0.05mg/10g，每周一次，给药2次；同时用艾条施灸，每次持续5min，每天一次，连续14天。
2.3 观察指标与检测
2.3.1 肿瘤相对增殖率 采用游标卡尺测量移植瘤直径，肿瘤体积（tumor volume，TV）的计算公式为：TV=1/2×a×b2，其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），计算公式为：RTV=Vt/V0，其中V0为分笼给药时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。相对肿瘤增殖率T/C（%）＝治疗组相对肿瘤体积/模型组相对肿瘤体积×100%，其中相对肿瘤体积＝每一次测量时的肿瘤体积/分笼给药时测量所得肿瘤体积。
2.3.2肿瘤抑制率 给药完毕24小时后处死小鼠，手术完整剥取瘤块，称取瘤重。抑瘤率（%）=（模型组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。
2.3.3 检测小鼠Lewis肺癌组织Caspase-3的蛋白表达 Caspase－3的蛋白表达，采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Caspase-3蛋白的表达量的变化。每个样本取等量蛋白（50μg）进SDS-PAGE凝胶电泳，电压l00V，时间100min，电泳后，电泳凝胶放入半干转膜槽内进行转膜，恒流200mA，时间100min，将蛋白条带转膜至PVDF膜，转膜后，膜用 TBST漂洗3次，每次5min。取出膜，放于封闭液中，37℃封闭2h。TBST漂洗1次，时间5min，将膜按照分子量裁成小条加入一抗，4℃孵育过夜后用适量TBST漂洗3次，每次5min。将膜又分别浸入二抗，室温孵育1h 后用适量TBST漂洗3次，每次5min。参考相关说明书，使用ECL发光试剂盒来检测蛋白。
3.统计处理均值用X±SD表示，组间分析用t检验进行统计学处理，应用SPSS（Staffstical Package for the Social Science）17.0对结果进行统计分析。
3.结果
3.1艾灸对Lewis 肺癌小鼠肿瘤生长抑制作用 Lewis 肺癌小鼠模型建立成功时，各组肿瘤体积没有差异；经过14d给药治疗后，顺铂联合艾灸组的相对肿瘤增殖率为46.33%，低于顺铂组（P＜0.01）；而顺铂联合艾灸组的抑瘤率为54.13%，高于顺铂组，与模型组相比差异最为明显（P＜0.01）。结果见表1
3.2 瘤组织中促凋亡蛋白Caspase－3蛋白表达结果 如表2所示，艾灸组、顺铂组和艾灸联合顺铂组，都可不同程度的使Caspase－3蛋白表达增加（P﹤0.05或P＜0.01），但艾灸联合顺铂组的作用最为显著，与顺铂组、艾灸组相比均有极显著性差异（P﹤0.01）。表明艾灸与顺铂联合应用，诱导Lewis肺癌细胞凋亡的作用最为显著，证明艾灸疗法可协同增效。
4.讨论
肺癌已经成为危害我国公众健康的常见的恶性肿瘤之一，以其高发病率和高病死率目前居于全球癌症首位。其中，非小细胞肺癌占肺癌总人数的 75%～80%。中医药治疗是目前中晚期非小细胞肺癌患者的主要方法之一。与化疗相比，中医药治疗对实体瘤的疗效不及化疗，但在症状改善和中位生存期方面较化疗有明显优势和增效作用［1］。目前，细胞凋亡是国内外肿瘤学研究的热门领域，尤其是在筛选抗肿瘤药物及其机制研究方面。肿瘤的发生是一个复杂过程，打破细胞的自身平衡。肿瘤细胞一般会出现无限增殖、分化和凋亡减少的特点[2]。而Caspase 家族是执行凋亡的最终途径，直接导致凋亡细胞的蛋白酶系统，它在细胞凋亡机制中，起着重要作用[3]。Caspase-3不但是caspase通路中最重要的蛋白酶，还是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路［4］。在细胞凋亡中的关键[5]。另外，肺癌患者中Caspase-3表达低于健康人群，提示其失表达可能在肺癌的发生中起重要作用。本实验应用免疫组化法检测小鼠瘤组织中的Caspase-3蛋白的表达，结果显示在生长活跃的肿瘤细胞中，Caspase-3表达较弱，而艾灸组与顺铂组均可上调Caspase-3的表达，且与单一顺铂组比较，艾灸联合顺铂组的Caspase-3的蛋白表达显著上调。
综上所述，本实验表明，艾灸可以上调Caspase-3蛋白的表达，同时，可抑制 Lewis肺癌小鼠实体瘤生长，有明显的协同增效作用。
参考文献
[1]张培彤，于明薇，杨宗艳，等．中晚期非小细胞肺癌中西医疗效评价方法比较研究［J］．中国中西医结合杂志，2010，7（30）：702-705．
[2]Evan G，Littlewood T.Science，1998；281（5381）：1317-1322
[3]弓娟琴，陈志强，李文忠等．Fas 介导的凋亡与Caspase家族[J]．国外医学：肿瘤学分册，2001，27（5）：279-280.
[4]Nguyen QD，Challapalli A，Smith G，et al.Imaging apoptosis with position emission tomography：'bench to bedside' development of the caspase-3/7 specific radiotracer〔（18）F〕ICMT-11〔J〕．Eur J Cancer，2012；48（4）：432-40.
[5]JosePh E K，LevineJ D. Caspase signalling in neuropathic and inflammatory pain in the rat [J]．Eur J Neurosci，2004，20（11）：2896-2902.
*基金项目：辽宁省科技厅自然科学基金（2015020373）
论文作者:陈诗博1,王淑娟2通讯作者,苏,妆2通讯作者
论文发表刊物:《航空军医》2017年27期
论文发表时间:2018/2/1
标签：艾灸论文; 肺癌论文; 肿瘤论文; 小鼠论文; 蛋白论文; 细胞论文; 模型论文; 《航空军医》2017年27期论文;