黄华[1]2003年在《苦豆子生物碱对小鼠肝功能和免疫功能的影响》文中指出实验目的: 探讨苦豆子生物碱(AL)对肝功能和免疫功能的影响; 实验方法: AL以3mg/kg、6 mg/kg、12 mg/kg叁个剂量给小鼠灌胃(ig),每天一次,连续7天,分别以四氯化碳(CCL_4)、D-氨基半乳糖(GaLN)腹腔注射(ip)、卡介苗(BCG)加脂多糖(LPS)尾静脉注射(iv)致小鼠肝损伤,此叁项实验均取血测定ALT和AST,并取肝脏作病理组织学检查;用分光光度法测定AL对血清溶血素(IgM)生成影响;MTT比色法测定AL对小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响;双抗体夹心ELISA法测定AL对肿瘤坏死因子(TNT-α)生成的影响:~3H-TdR掺入法测定AL对小鼠腹腔巨噬细胞(PMΦ)吞噬功能和白介素2(IL-2)活性的影响。 实验结果: 1、AL叁个剂量均能明显降低CCL_4致小鼠肝损伤模型血清ALT、AST水平,作用强度与剂量呈正相关;组织学检查表明,叁个剂量组的肝损伤与模型组相比均有明显改善。 2、降低GaLN致小鼠肝损伤模型血清ALT、AST水平,中、大剂量组作用较明显,组织学检查表明叁个剂量组肝损伤程度与模型组相比均有所减轻。 3、AL叁个不同剂量均可降低BCG加LPS致小鼠肝损伤模型血清ALT、AST水平,其中大剂量组作用较明显,组织学检查表明叁个剂量均可明显减少肝细胞坏死。4、叁个剂量的AL均可使血清溶血素(HCS。)降低,中、大剂量组作用明显,作用强度与剂量呈正相关。 5、AL在浓度为62.5一250“g/m1之间对B淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用,作用强度与浓度呈正相关。 6、在浓度为62.5一250 pg/m1之间对T淋巴细胞增殖有促进作用,作用强度与浓度呈正相关。 7、对小鼠腹腔巨噬细胞(体外)的吞噬功能有抑制作用,在浓度为62.5一250 pg/ml之间作用较明显。 8、AL叁个不同剂量组对TNF一。的生成均有明显的抑制作用,作用强度与剂量呈正相关。 9、可增强工L一2的生物活性,浓度为62.5一250 pg/m1之间作用明显,作用强度与浓度呈正相关。 结论:对CCI;和GalN所导致的肝损伤有明显的保护作用;对BCG加LPS致小鼠肝损伤亦有一定的保护作用;对B淋巴细胞的增殖、IgM的生成、PM中的吞噬功能以及TNF一的生成均有抑制作用;促进T淋巴细胞的增殖并增强工L一2的生物活性:表明AL可增强细胞免疫功能,对体液免疫和非特异性免疫功能有抑制作用。
叶文初[2]2016年在《苦豆子提取物的抑菌、抗炎及对小鼠免疫功能的影响和毒性作用研究》文中研究表明苦豆子属于天然中草药,是重要的药用植物资源,全株味苦、性寒、有毒。中医认为苦豆子具有清热燥湿、止痛、杀虫之功效。当代医学及兽医学研究表明苦豆子具有抑菌消炎、抗癌、增强免疫功能、驱虫等多种药理作用。本试验是主要研究苦豆子提取物抗菌、抗炎以及对小鼠免疫功能的影响和急性毒性作用的研究。1.奶牛乳房炎致病菌的分离与鉴定目的:本试验旨在研究奶牛乳房炎致病菌的种类以及分离鉴定出致奶牛乳房炎的致病菌。方法:从陕西宝鸡某奶牛场患乳房炎的奶牛中采取乳样46份,用于分离与鉴定致奶牛乳房炎的病原菌。结果与结论:本试验分离鉴定出金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、停乳链球菌、致病性大肠埃希菌。2.苦豆子提取物体外抑菌作用研究目的:本试验旨在进行苦豆子提取物的体外抑菌作用研究。方法:试验采用试管二倍稀释法和牛津杯法分别测定致病菌的最小抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)、抑菌圈(mm)。结果:苦豆子提取物对致病菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、停乳链球菌、致病性大肠埃希菌)的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.585、2.340、2.340、4.687 mg/L;最小杀菌浓度(MBC)均为9.38 mg/L;苦豆子提取物均对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、停乳链球菌及大肠埃希菌有明显的抑菌作用,且药液浓度越高,抑菌效果越好。结论:苦豆子提取物在体外具有明显的抑菌作用。3.苦豆子提取物的抗炎作用目的:本试验旨在探讨苦豆子提取物在小鼠体内的抗炎效果。方法:试验采用二甲苯致小鼠耳廓炎症肿胀模型、新鲜鸡蛋清致小鼠足趾肿胀模型及小鼠棉球所致肉芽肿模型来观察苦豆子提取物的抗炎作用。结果:苦豆子提取物高、中、低剂量组均使小鼠耳廓肿胀明显降低,其中耳廓肿胀率分别为82.61%、65.22%、42.83%;苦豆子提取物剂量组对蛋清所致的炎症具有明显的抑制作用,使小鼠足趾肿胀均明显降低;苦豆子提取物高、中、低剂量组均可抑制棉球所致小鼠肉芽组织的增生,增生抑制率依次为39.76%、35.45%、54.18%。结论:苦豆子提取物具有明显的抗炎作用。4.苦豆子提取物对小鼠免疫功能的影响目的:本试验旨在探讨苦豆子提取物对小鼠体内免疫功能的影响。方法:试验采用胸腺脾脏法、迟发型变态反应—足跖增厚法、抗体效价—试管凝集法及血清半数溶血值(HC50)法来研究苦豆子提取物对免疫功能作用的影响。结果:苦豆子提取物可增加脾脏和胸腺重量;苦豆子提取物高、中、低剂量组均可提高小鼠体内的细胞免疫功能作用,其免疫反应(足跖增厚)分别为82.38%、59.07%、59.33%;苦豆子提取物可明显提高SRBC抗体效价,其中苦豆子提取物高、中、低剂量组的抗体效价分别为1:1280、1:1280、1:640;苦豆子提取物高、中、低剂量组可明显提高血清半数溶血值(HC50),且HC50值分别为145.10±4.26、136.12±6.15、133.70±6.09。结论;苦豆子提取物具有改善小鼠体内免疫功能的作用。5.苦豆子提取物对小鼠的急性毒性作用研究目的:本试验旨在探讨苦豆子提取物对昆明小鼠的毒副反应情况。方法:试验采用小鼠灌服苦豆子提取物的方法,采用改良寇氏法计算出半数致死量(LD50)和95%可信限。结果与结论:灌服小鼠苦豆子提取物的半数致死量LD50=144.63 mg/L,95%的可信限为109.88~191.89 mg/L,属于中等毒性药物。
杨舒淳[3]2008年在《旋覆花苦豆子合剂应用于急性免疫性肝损伤的实验研究》文中认为目的:研究观察中药经方“旋覆花汤”加维吾尔药苦豆子——旋覆花苦豆子合剂对小鼠急性免疫性肝损伤的治疗和预防作用。方法:将60只昆明小鼠随机分为6个组,即空白对照组、模型组、联苯双脂对照组、苦豆子煎剂组、“旋覆花汤”组、旋覆花苦豆子合剂组。实验开始的第一天,除空白组小鼠每只尾静脉注射生理盐水外,其余各组小鼠尾静脉注射卡介苗(BCG),0.5mg(含活菌5×10 5个)/只,于实验开始第一天造模同时,给予分组灌胃治疗,连续治疗用药12天。第12天,空白组以生理盐水每只尾静脉注射,其余各组用脂多糖(LPS)7.5μg/只尾静脉注射。LPS注射12小时后,小鼠眼眶取血,测定丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)值,检测造模及用药后各组小鼠肝功能损害程度;解剖取各小鼠肝脏最长叶肝组织,做肝组织病理切片,检测造模及用药后各组小鼠肝组织病理损害程度。结果:各治疗组对急性免疫性肝损伤小鼠的肝功能和肝组织病理结构的影响优于模型组;旋覆花苦豆子合剂对急性免疫性肝损伤小鼠肝功能和肝组织病理结构的改善作用明显优于苦豆子煎剂和“旋覆花汤”,且与联苯双脂作用相当;苦豆子煎剂改善肝功能的作用优于“旋覆花汤”;“旋覆花汤”对小鼠肝组织病理结构的改善优于苦豆子煎剂。结论:旋覆花苦豆子合剂、苦豆子煎剂和“旋覆花汤”均能减轻BCG加LPS对小鼠肝脏的急性免疫性损伤;且旋覆花苦豆子合剂优于苦豆子煎剂和“旋覆花汤”;通过实验推断:苦豆子煎剂和“旋覆花汤”有协同作用;旋覆花苦豆子合剂和联苯双脂对BCG加LPS引起的小鼠肝脏的急性免疫性损伤疗效相当。
丁佩兰[4]2004年在《山豆根和苦参化学成分的比较研究》文中研究表明山豆根和苦参均为豆科槐属植物来源的常用中药,其中山豆根为越南槐Sophora tonkinensis Gapnep. 的干燥根及根茎,苦参为苦参 Sophora flavescensAit.的干燥根。两者药用部位相仿,而且成分相似,都含有喹诺里西啶类生物碱、异戊烯基类黄酮和齐墩果烯型叁萜等成分,但两种药材的临床应用却有明显不同,山豆根主要用于治疗咽喉疾病,而苦参主要用于皮肤病和妇科疾病的治疗。另外,在药材的质量标准方面,山豆根和苦参都以苦参碱型生物碱(苦参碱、氧化苦参碱或槐定碱)作为定性指标缺乏专属性,且苦参药材仅以含量相对较小的苦参碱为质控指标,不尽合理。为了阐明山豆根和苦参药材的化学组成差异,以完善山豆根和苦参药材的质量标准并为两者药效物质基础的阐明奠定基础,同时也为了寻找新的抗病毒活性成分,以更好地利用槐属药用植物资源,本文采用天然药化和分析化学等手段对山豆根和苦参的化学成分进行了系统地比较研究,建立了其有效部位的 HPLC 指纹图谱,并对不同来源药材的多种有效成分进行了含量测定,同时结合国家“九五”攻关课题的要求对山豆根的化学对照品进行了研究。一、山豆根和苦参的化学成分1、 山豆根的化学成分:采用柱层析和制备薄层色谱等方法从山豆根(Sophora tonkinensis Gapnep.)的生物碱部位分离得到 10 个化合物,从其乙醇提取 物的乙醚萃取部位分离得到 22 个化合物。经波谱学分析以及与对照品比 较的方法,鉴定了其中的 30 个化合物,它们分别是:生物碱类成分(+)- 苦参碱(T1)、(+)-氧化苦参碱(T2)、(+)-槐花醇(T3)、(-)-14β-羟基苦 参碱(T4)、(-)-14β-羟基氧化苦参碱(T5)、(-)-槐果碱(T6)、(-)-5α-羟 基槐果碱(T7)、(-)-金雀花碱(T8)和 (-)-N-甲基金雀花碱(T9),黄酮 类成分山豆根色满二氢黄酮 A(T10)、山豆根色满二氢黄酮 B(T11)、山 豆根色满二氢黄酮 C(T12)、山豆根色满二氢黄酮 D(T13)、山豆根色满 查耳酮 B(T14)、山豆根色满查耳酮 A(T15)、山豆根色满查耳酮 C(T16)、 芒柄花素(T17)、8-甲雷杜辛(T18)和(-)-叁叶豆紫檀苷(T19),叁萜类 i<WP=7>成分(+)-羽扇豆醇(T20)和(+)-槐花二醇(T21),小分子酚性成分番石榴酸乙酯(T22)、麦芽酚(T23)、香草酸(T24)、对羟基苯甲酸(T25)和咖啡酸十二醇酯(T26)以及大黄素甲醚(T27)、大黄素(T28)、flemichapparin(T29)和β-谷甾醇(T30)。其中化合物 T5、T10、T11、T12、T13、T14 和 T16 为新化合物,化合物 T22、T23、T27 和 T28 为首次由槐属植物中分离得到,化合物 T17、T18、T24、T25 和 T29 为首次由该种植物中分离得到。2、 苦参的化学成分:采用柱层析和制备薄层色谱等方法从苦参(Sophoraflavescens Ait.)的生物碱部位分离得到 11 个化合物,从其乙醇提取物的乙醚萃取部位分离得到 22 个化合物。经波谱学分析,结合单晶 X-衍射实验,鉴定了其中的 29 个化合物,它们分别是:生物碱类成分(+)-氧化苦参碱(F1)、(+)-别苦参碱(F2)、(-)-9α-羟基苦参碱(F3)、(-)-槐果碱(F4)、(+)-氧化槐果碱(F5)、(+)-莱蔓碱(F6)、(-)-13,14-去氢槐定碱(F7)、(-)-9α-羟基槐果碱(F8)、(+)-12α-羟基槐果碱(F9)和(-)-臭豆碱(F10),黄酮类成分苦参色满二氢黄酮 B(F11)、苦参色满二氢黄酮 C(F12)、苦参色满二氢黄酮 D(F13)、苦参色满二氢黄酮 A(F14)、苦参色满黄酮 A(F15)、苦参色满黄酮 B(F16)、苦参色满黄酮 C(F17)、5-去羟山柰素(F18)、7,4′-二羟基-3′-甲氧基异黄酮(F19)、毛蕊异黄酮(F20)、鹰嘴豆素甲(F21)、大豆素(F22)和芒柄花素(F23),叁萜类成分大豆皂醇 B(F24),小分子酚性成分番石榴酸二乙酯(F25)、对羟基苯甲酸乙酯(F26)和麦芽酚(F27)以及大黄酚(F28)和β-谷甾醇(F29)。其中化合物 F9、F11、F12、F13、F15、F16 和 F17 为新化合物,化合物 F25、F27 和 F28 为首次由槐属植物中分离得到,化合物 F18、F19、F20、F21、F22、F24 和 F26 为首次由该种植物中分离得到。3、 抗病毒活性试验:对实验中分离得到的生物碱类成分进行抗乙肝病毒活性筛选,结果表明苦参碱、氧化苦参碱、槐花醇、槐果碱、氧化槐果碱、莱蔓碱、9α-羟基苦参碱、13,14-去氢槐定碱、12α-羟基槐果碱和金雀花碱在 0.2μmol/mL 时,臭豆碱在 0.4μmol/mL 时对 HBsAg 的抑制率高于阳性对照拉米呋啶(1.0μmol/mL 时抑制率为 29.6%),其中槐果碱、莱蔓碱和13,14-去氢槐定碱抑制作用较明显,在 0.2μmol/mL 时抑制率均大于 50%。槐果碱在 0.2μmol/mL 时对 HBeAg 亦有一定的抑制作用,抑制率为 34.6%,和拉米呋啶相当(1.0μmol/mL 时抑制率为 35.4%)。槐果碱、氧化槐果碱、 ii<WP=8>莱蔓碱和 13,14-去氢槐定碱对 HBsAg 和 HBeAg 的抑制率均较目前临床用于治疗乙肝疾病的药物苦参碱和氧化苦参碱的相应抑制率高,值得深入研究。4、 部分异戊烯基黄酮类化合物的定性检测:采用 HPLC-DAD-MS 的方法对实验中分离得到的部分异戊烯基黄酮类化合物进行了定性检测,发现本人分离得到的具有 2,2-二甲基苯并二氢吡喃环取代的黄酮类?
雒艳萍[5]2017年在《砂生槐种子生物碱抗包虫效应及机制研究》文中认为研究背景包虫病是主要由棘球蚴或泡球蚴寄生于人体或动物体内引起的人兽共患寄生虫病,在全球广泛流行,严重危害人类健康和生命安全。目前,治疗包虫病以手术为主,但无法耐受手术或病情复杂而无法进行手术的患者,只能依赖药物治疗,而获批临床使用的药物仅有阿苯达唑和甲苯达唑两种,品种单一,疗效不理想,并且发现副作用多而严重,耐药现象日益增多。因此,亟需研发疗效明确、副作用小的抗包虫药物。从祖国传统医学的数千年治疗虫病的经验中寻找线索,是发掘抗包虫药物的一个重要途径。砂生槐为青藏高原特有植物,藏医记载其种子性苦、寒,具有治疗白喉、虫病、中毒症、消化不良等功效。本实验室在前期研究中发现砂生槐种子亲脂性总生物碱在体外具有杀灭细粒棘球蚴原头节活性,在体内可抑制小鼠继发性棘球蚴生长,提示砂生槐种子总碱中含有驱虫成分。但砂生槐种子在藏医中以水煎剂入药,亲脂性总碱水溶性差、抗虫效果弱,因此,本课题从砂生槐种子的水溶性成分中寻找有效的抗包虫成分并研究其抗虫机制。研究方法以乙醇为溶剂,采用热回流提取法分离砂生槐种子生物碱,以秀丽隐杆线虫为模型,对砂生槐种子的分离产物进行杀虫活性筛选。采用柱层析分离法,从杀虫活性较强的成分中提取极性较小的馏分和极性较大的馏分,TLC定性鉴定馏分的成分,通过秀丽隐杆线虫确定砂生槐种子的杀虫活性成分,并通过HPLC分析其主要化学成分。分离自然感染羊肝细粒棘球蚴原头节,在体外与砂生槐种子成分共同培养7天,观察原头节形态变化及存活情况,进一步确定砂生槐种子的杀虫活性成分。NIH小鼠腹腔注射细粒棘球蚴原头节建立慢性棘球蚴病模型,BALB/c小鼠腹腔注射泡球蚴建立慢性泡球蚴病模型,分别于感染后20 w和14 w用砂生槐种子杀虫活性成分灌胃治疗,剂量为100 mg/kg/day,治疗6 w后剖杀小鼠检测。剥离棘球蚴囊泡组织,称量湿重,常规HE染色;FCM分析脾脏CD3+、CD4+、CD8+和PD-1+的T细胞亚群;ELISA检测IFN-γ和IL-4水平;CFSE染色检测脾细胞增殖能力。以秀丽隐杆线虫为模式生物,检测砂生槐种子杀虫活性成分作用后秀丽隐杆线虫的运动行为能力、生殖能力、寿命、体长及ROS水平,反映其抗虫机制。体外培养肝细胞株Hep G-2细胞和Chang liver细胞,MTT法检测砂生槐种子杀虫活性成分对细胞生长的影响;BALB/c小鼠口服砂生槐种子杀虫活性成分(100 mg/kg/day)6 w后,检测血清肝肾生化指标和病理变化,评价砂生槐种子杀虫活性成分的毒副作用。Ⅲ型干扰素成员IL-28B与抗原EAMMH在0、3、6 w同时注射C57BL/6小鼠,10 w分离脾细胞,FCM分析CD4+CD25+Foxp3+Treg占脾淋巴细胞比例,ELISPOT检测分泌IFN-γ的T细胞数目,间接ELISA检测抗原特异性Ig G1和Ig G2c水平,反映IL-28B对Treg及免疫应答的调节作用,为其应用于包虫病治疗奠定基础。研究结果本课题从砂生槐种子获得4种提取物:非水溶性生物碱(E1)、水溶性生物碱(E2)、水溶性非生物碱(E3)和不溶性非生物碱(E4)。E1、E2、E3和E4的杀秀丽隐杆线虫的24 h-LC50分别为31.03 mg/ml、14.29 mg/ml、29.94 mg/ml和25.64 mg/ml,E2的LC50最低。从E2中提取到极性较小的馏分E2-a和极性较大的馏分E2-b。E2-a和E2-b杀秀丽隐杆线虫的24 h-LC50分别是9.06 mg/ml和36.24 mg/ml。TLC定性鉴定,E2-a含有苦参碱和槐果碱,E2-b含有氧化苦参碱和氧化槐果碱。苦参碱和槐果碱杀秀丽隐杆线虫的24 h-LC50分别是12.03 mg/ml和9.81 mg/ml。HPLC分析100μg/ml E2-a中苦参碱和槐果碱的含量分别为42.8μg/ml和25.7μg/ml。E2-a体外作用于细粒棘球蚴原头节后,虫体出现皱缩、一端或两端出现气泡、吸盘变形、顶突明显外翻等异常表现,活性降低。E2-b、E2、苦参碱、槐果碱在体外对原头节活性均有不同程度影响。杀原头节的72 h-LC50值由低到高依次是E2-a(0.35 mg/ml)、E2(0.45 mg/ml)、槐果碱(0.79 mg/ml)、苦参碱(1.16 mg/ml)、E2-b(2.12 mg/ml),E2-a的LC50值最低。治疗小鼠慢性棘球蚴病的结果表明,E2-a组的棘球蚴囊泡组织湿重(8.40±2.93 g)明显低于阴性对照组(11.33±1.64 g)(p=0.042);E2-a组的囊泡生发层与角皮层部分剥离,角皮层增厚,变得疏松,出现大量泡状物,失去典型的纹状结构,与外膜之间的界限变得模糊不清;E2-a组小鼠脾脏CD3+T细胞占脾淋巴细胞的比例(45.14%±23.93%)高于阴性对照组(14.74%±9.39%)(p=0.011),且主要是CD4+T细胞比例(72.28%±3.63%)高于阴性对照组(50.33%±27.92%)(p=0.036)所致,CD8+T比例无明显升高或降低(p>0.05);E2-a组小鼠PD-1+T细胞比例(9.92%±6.77%)显着低于阴性对照组(25.51%±13.53%)(p=0.009),且CD4+PD-1+T细胞比例为5.73%±1.62%,明显低于阴性对照组(12.59%±6.35%)(p=0.023),CD8+PD-1+T细胞比例为0.86%±0.35%,明显低于阴性对照组(2.77%±1.87%)(p=0.020);E2-a组小鼠血清IFN-γ水平无明显变化,血清IL-4浓度平均为4.21 pg/ml,与阴性对照组(1.13 pg/ml)比较有升高趋势;E2-a组抗原刺激后脾细胞培养上清中IL-4浓度平均为5.75 pg/ml,与阴性对照组(3.10 pg/ml)比较有升高趋势;E2-a组小鼠脾细胞增殖能力无增高。治疗慢性泡球蚴病小鼠的结果表明,E2-a组小鼠的泡球蚴囊泡组织湿重为6.10±2.16 g,显着低于阴性对照组(11.25±1.73 g)(p<0.01),平均降低囊重约5.15 g;E2-a组小鼠血清INF-γ水平无降低,IL-4浓度平均为48.46pg/ml,较阴性对照组(32.08 pg/ml)明显升高(p=0.032)。秀丽隐杆线虫的运动行为能力检测结果表明,8 mg/ml的E2-a作用24 h后,引起秀丽隐杆线虫的身体弯曲频率降为阴性对照组的1/3(p<0.01);头部摆动频率平均为34.5次/min,明显低于阴性对照组(59.1次/min)(p<0.01);咽泵频率平均为38.9次/min,低于阴性对照组(71.4次/min)(p<0.01)。E2-a能够抑制秀丽隐杆线虫的排卵功能,8 mg/ml的E2-a处理后的秀丽隐杆线虫每条虫排卵总数平均为205.2,明显低于阴性对照(248.8/虫)(p<0.01),在第3天和第4天的排卵量分别平均为36.8/虫和13.2/虫,明显低于阴性对照组(分别为54.4/虫和28.2/虫)(p<0.05),但AO染色未发现生殖细胞凋亡增多。8 mg/ml E2-a组线虫的寿命为9.1±4.1天,明显低于阴性对照组(13.0±4.6天)(p=0.021)。8mg/ml E2-a组线虫的体长平均为447.6 pixels,明显短于阴性对照组(486.8 pixels)(p<0.01)。E2-a无诱导ROS水平升高的作用。体外MTT实验证明,浓度为1 mg/ml的E2-a作用48 h后,Hep G-2细胞和Chang liver细胞的抑制率分别为29.03%和38.36%,因此低浓度E2-a对肝细胞株Hep G-2和Chang liver细胞的增殖有一定抑制作用。小鼠口服E2-a后检测血清肝肾生化指标,发现反映肝功能的指标谷丙转氨酶(38.333 U/L±4.726 U/L)和谷草转氨酶(150.000 U/L±35.763 U/L)较阴性对照组(谷丙转氨酶和谷草转氨酶分别为33.333 U/L±7.638U/L和139.667 U/L±30.172 U/L)略升高,反映肾功能的的指标肌酐(18.000μM/L±1.000μM/L)较阴性对照组(11.000±7.211μM/L)略升高,但均无统计学差异,其余指标无明显升高或降低,组织学检查未发现肝肾细胞出现明显改变。包虫感染中Treg增多,造成感染持续,故下调Treg是治疗包虫病的策略之一,本课题研究了Ⅲ型干扰素成员IL-28B对Treg的调节作用。结果表明,EAMMH-r Ad-m IL-28B组的Treg比例为0.17%±0.17%,显着低于非特异性对照EAMMH-r Ad-EGFP(0.76%±0.25%)(p<0.05);EAMMH-r Ad-m IL-28B组小鼠分泌IFN-γ的脾细胞数较对照组无明显升高;与EAMMH组比较,EAMMH/r Ad-m IL-28B组的Ig G1水平有增高趋势,而Ig G2c水平降低(p<0.05)。研究结论砂生槐种子生物碱中抗虫活性较强的是低极性的水溶性生物碱E2-a,其主要化学成分为苦参碱和槐果碱(68.5%)。E2-a抗包虫的机制为损伤囊泡、诱导CD4+T细胞增多、下调T细胞表面负调节分子PD-1的表达、调节IFN-γ和IL-4,促进免疫功能。E2-a能够影响秀丽隐杆线虫行为能力,降低生殖能力,缩短寿命,影响发育。E2-a对培养的肝细胞株和小鼠的肝肾细胞有轻微毒性效应。IL-28B可下调Treg细胞,但不增强Th1免疫反应,尚需进一步研究其在包虫治疗中的作用。
张丽[6]2014年在《苦豆碱抑制结肠癌细胞HT29增殖诱导细胞周期阻滞的作用及机制研究》文中研究说明结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是人类高发恶性肿瘤,其发病率一直呈上升趋势,在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第叁位。在我国,结肠癌的发病率仅次于胃癌与食道癌,且有逐年增长趋势。因此对结肠癌的病因病机及治疗方法的深入研究尤显重要。目前结肠癌的治疗主要是以手术为主的综合治疗,手术的切除率可达到60%-70%,结直肠癌根治术后,50%患者复发或转移而死亡,55-80%的复发病例发生在术后2年内,大宗病例报道的术后5年生存率仍然徘徊在50%-60%左右,扩大手术范围则无法提高患者的生存率。化疗可以降低术后复发,提高临床疗效,降低转移发生率,尽可能挽救患者生命及延长生命时间。虽然外科治疗已取得很大进步,但是手术后的复发和转移是结肠癌患者死亡的主要因素,很多抗结肠癌的药物也带来很多的副作用。中药在治疗肿瘤方面,由于其副作用小,病人耐受性好等特点发挥着越来越大的作用。中药治疗结肠癌主要体现在以下几个方面：(1)中药联合手术治疗减少肿瘤复发转移、提高生存质量、增加患者免疫功能：手术切除原发病灶后,中药辅助辨证治疗,口服及灌肠应用于结直肠癌手术前后,可抑制肿瘤生长,提高机体免疫力,改善症状,抗转移及加强手术的成功率。(2)中药联合化疗减轻其不良反应：化疗是大肠癌治疗的主要手段之一,但90%肿瘤患者初次化疗都会出现恶心、呕吐、疲乏等症状。中药可减轻化疗对结肠癌和直肠癌患者造成的肠道损伤,从而间接地辅助了癌症治疗,还可减少化疗后所致的白细胞减少的发生率,降低白细胞下降的程度,可显着改善化疗导致的恶心症状,还可以提高生存质量,改善临床症状,减轻化疗的毒副反应,提高机体对化疗的耐受性,起到增效减毒的作用,提高患者的无瘤生存率。(3)中药灌肠联合化疗延长生存期：中药灌肠是直接通过直肠,药效不受消化系等诸多因素的影响,可直接作用于创面而起到抑瘤、杀瘤、止痛等作用,且操作方便,无创伤、无不良反应,有利于患者康复,故大肠癌经肛门直肠给药治疗越来越被临床所重视。苦豆碱(Aloperine,ALO)是从苦豆子(Sophora Alopecuraides, L)中提取出来的生物碱单体,属于喹诺里西啶类生物碱,但是ALO的结构与其他槐定碱、苦参碱等生物碱四环结果不同,是叁环结果,具有更强的碱性。ALO具有明显的抗炎作用、抗病毒作用,具有清热、止痛、杀虫、镇痛、镇静、降温作用,其对淋球菌的抑制作用与青霉素相近,抑菌活性比苦参碱强,对活性氧自由基和脂质自由基均有清除作用,能有效地缓解结肠炎小鼠的炎症反应。有研究表明ALO有较好的抑制肿瘤增殖效果,对白血病细胞株的作用效果好于肺癌、肝癌和食管癌实体肿瘤细胞株,尤其对HL-60细胞株作用最敏感。ALO抑制结肠癌SW480的增殖,促使细胞凋亡,抑制JAK/Stat3信号通路的活化,抑制肿瘤生长。虽然对ALO抑制肿瘤细胞的增殖做了一些相关研究,但是其作用机制到目前为止还不完全清楚。本研究的目的是为了明确与其他相似类成分比较,ALO对多种细胞株的抑制作用是否具有优势及ALO体内的抗肿瘤作用,了解ALO的毒性,并对其诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的分子机制进行研究,探讨ALO抑制细胞增殖的信号通路,从而为ALO的新药开发及临床应用提供更深入的理论依据和治疗方案。ALO的来源丰富,成本低廉,ALO制剂的开发成功,将极大的有利于资源的充分利用、人民健康、生态环境、经济发展,同时将中药与现代分子生物技术的有机结合,对中药走向世界,弘扬祖国传统医药具有重要的意义。1比较苦豆子总碱和8种生物碱对消化系肿瘤的生长抑制作用比较了苦豆子总碱及所含的8种生物碱单体槐定碱、槐果碱、ALO、苦参碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱、野靛碱和莱曼碱对8种消化系癌细胞株的抑制作用,8种细胞株为人肝癌细胞97H、人胃癌细胞株BGC823及6种人不同类型不同蛋白表达结肠癌细胞株SW480、SW620、HCT116、HT2、LS174t和DLD1。采用MTT法检测不同药物作用癌细胞24、48、72h的抑制率,绘制抑制曲线,用SPSS13.0Probit法计算药物的IC50值。ALO的IC50值低于苦豆子总碱及其他生物碱,与阳性对照药五氟尿嘧啶(5-Fu)相似。采用重复测量方差分析法(药物-时间,浓度-时间)和析因分析法对MTT结果进行了比较,结果ALO对8种肿瘤细胞的抑制率均显着好于其他药物(p<0.001)。ALO对不同细胞的抑制率有显着差异(F=31.767, P=0.000), ALO对SW480和HT29的抑制作用最强,抑制率分别为86.54±22.99%和85.70±16.33%。2ALO诱导结肠癌HT29的细胞凋亡ALO作用于细胞后显微镜下观察可见细胞发生明显的形态变化,与对照组相比,ALO组的细胞变圆,随着给药剂量的增加,死细胞越来越多,贴壁生长的细胞变稀疏,细胞浆中的颗粒物质增多。Hochest33342-PI双染法观察细胞,紫外光下阴性对照组无明显凋亡细胞,ALO组可见早期凋亡细胞,核染色质聚集,出现断裂,胞质浓缩,为明亮的月牙状,不规则圆形、椭圆形亮蓝色荧光。阴性对照组可见少量的坏死细胞,为红色荧光,ALO组坏死细胞较对照组多。流式细胞仪PI/Annexin V-FITC双染色法检测细胞凋亡,采用单向方差分析统计方法,不同浓度组的凋亡率比较有显着性差异(F=28.091, P=0.000)(n=3),同浓度组的早期凋亡率没有显着性差异(F=2.377,P=0.146),晚期凋亡率有显着性差异(F=38.616,P=0.000),随着浓度的增加,晚期凋亡的细胞显着增加。提示ALO对HT29细胞增殖的抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的。细胞克隆试验表明ALO在低浓度下能够长期抑制结肠癌细胞株HT29的增殖,不同浓度的ALO克隆率有显着差异(F=236755,p=0.000)(n=3), ALO在0.05mM浓度对细胞HT29的克隆率为64.11±3.87%,随着药物浓度的增加克隆率降低,0.1、0.2mmM的克隆率分别为41.89±3.91%和19.67±4.25%。Western blot法检测凋亡的相关蛋白,细胞经过ALO作用24h后,随着浓度的增大,Bcl-2蛋白含量显着降低(F=36.436,p=0.000),而Bax蛋白含量升高(F=3.472,p=0.071),都说明了细胞发生了凋亡,而剪切的PARP蛋白含量显着升高(F=14.382,p=0.001)和PARP蛋白含量显着降低(F=10.142,p=0.001),也标志着caspase3的活跃,进一步说明细胞发生了凋亡,说明ALO对细胞的增殖抑制作用可能与细胞凋亡有关。3ALO使细胞阻滞在G2/M期并通过抑制Ras/Raf/Erk通路抑制细胞增殖流式细胞仪检测细胞周期,结果显示ALO使HT29细胞阻滞在G2/M期,qPC滋检测相关基因,ALO浓度对p53和p21的基因水平有显着影响,随着浓度的增加而增加(F=212.157, P=0.000; F=948.613, P=0.000),而Cyclin B1和Cyclin D1则降低(F=180.564, P=0.000;F=133.673, P=0.000).同时采用、vestern blot法检测细胞周期相关蛋白,随着浓度的增加和作用时间的延长,Ras蛋白(F=0.330,p=0.804;F=0.141, p=0.932), Raf1(F=2.395, p=0.144;F=0.288, p=0.833)和Erkl/2(F=1.150, p=0.387;F=0.872,p=0.495)的变化不显着,不同作用时间的磷酸化的Raf蛋白含量(F=11.609,p=0.003)显着降低,而不同浓度的p-Rafl蛋白含量降低不显着(F=3.475,P=0.071),磷酸化的Erkl/2的蛋白含量显着降低(F=27.914, p=0.000;F=9.744,p=0.005),表明可能是通过抑制Ras/Raf/Erk通路抑制细胞增殖。4ALO能够抑制HT29结肠癌移植瘤选用健康BALB/c-nu/nu雄性裸鼠,腋下移植HT29细胞,7-10天形成移植瘤,成功率100%。腹腔注射给药,ALO组按照高中低3个剂量组4、8、16mg/kg体重给药,隔日腹腔注射。每周给药3次,5-Fu为阳性对照药,按照30mg/kg体重给药,隔日腹腔注射,每周给药3次；移植瘤模型成功后开始给药,给药周期4周。实验结果显示ALO能够抑制肿瘤的生长,给药组对肿瘤抑制率有显着差异(F=4.216,P=0.018),组间比较,5-Fu组与ALO低剂量组有显着差异(p=0.003),与ALO中、高剂量组无显着差异(p=0.099,p=0.515),ALO低剂量组和高剂量组有显着差异(p=0.015),和中剂量组无显着差异(p=0.125)。ALO中剂量和高剂量组无显着差异(p=0.299),5-Fu组的抑制率为68.88±1.92%,ALO低剂量组为39.93±7.73%,ALO中剂量组为53.85±10.79%,ALO高剂量组为63.12-13.77%。正常对照组未见任何异常症状。试验过程中裸鼠体重逐渐下降,阴性对照组体重显着降低(F=2.172,P=0.040),阳性对照组5-Fu组的体重也显着降低(F=3.090,P=0.005),空白组体重显着增加(F=2.441,P=0.022),ALO各个给药组体重无显着变化(F=0.377, P=0.941; F=0.322, P=0.964; F=0.230,P=0.989)。试验结束解剖时发现阴性组的全部裸鼠肝脏都有白色斑点,HE染色结果可见肝脏有肿瘤细胞转移,转移率为100%,ALO低剂量、中剂量和5-Fu组为33.33%,高剂量为16.67%,脾、肾、心脏的HE染色未见异常变化。各组肝功的AST和ALT没有显着差异(F=1.439, P=0.239; F=0.396, P=0.847),组间比较,空白组和阴性对照组有显着差异(p=0.027),说明肿瘤对肝脏有一定的影响,ALO对裸鼠的肝功没有影响。Western blot结果显示,ALO能够显着下调ERKl/2的磷酸化水平(F=18.621,p=0.001),与体外试验结果相符,表明ALO可能是通过抑制ERKl/2的磷酸化水平抑制肿瘤的生长。免疫组化结果亦显示了ALO可以抑制ERKl/2的磷酸化水平(F=65.066,p=0.000)。5ALO腹腔注射急性毒性试验为了考察ALO的毒性及毒性反应,进行了ALO腹腔注射急性毒性试验。采用传统的LD50方法,用昆明种小鼠,雌雄各半,根据不同剂量小鼠的死亡率采用spss13.0Probit法计算LD50值,结果ALO的LD50值为200.54mg/kg体重。试验中发现雌鼠的耐受性比雄鼠差,死亡数量比较多,小鼠的中毒时间比较短,中毒症状比较明显,最主要的症状就是抽搐、紫绀,死亡小鼠都是在30min内死亡,超过1h后中毒症状基本减轻,之后再无死亡。ALO的急性毒性结果表明ALO具有一定的毒性。结论综上所述,我们的研究证实了ALO可以抑制结肠癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。1.ALO对8种消化道细胞的抗肿瘤作用好于苦豆子总碱及其所含的7种生物碱单体。其中ALO对结肠癌细胞HT29和SW480最为敏感,抑制效果最好。2.ALO抑制HT29结肠癌胞株增殖并诱导其发生凋亡,流式细胞仪检测凋亡率随着浓度的增加,凋亡率增加,ALO作用于细胞使细胞形态发生变化,并下调了癌基因Bcl-2,上调了抑癌基因Bax的蛋白水平。3.ALO使HT29细胞周期阻滞在G2/M期,上调了p53、p21蛋白和基因水平,下调了cyclin D1和cyclinB1的蛋白和基因水平,并通过抑制RAS/RAF/ERK信号通路的蛋白抑制细胞的增殖。4.ALO腹腔注射的急性毒性试验,LD50为200.54mg/kg体重,95%可信区间为189.59mg/kg体重-211.84mg/kg体重。说明ALO具有一定毒性。ALO的毒性主要表现为神经毒性,小鼠给药后30min死亡,恢复期内小鼠没有死亡,表明ALO的毒性作用时间短。5.ALO的体内抑制移植瘤的结果显示,HT29细胞移植瘤的成功率为100%,ALO对肿瘤的抑制率为63.12%,与5-Fu组没有显着差异。ALO还能够抑制HT29细胞的肝转移,阴性对照组裸鼠全部发生肝转移,而ALO的叁个对照组部分发现肝转移。AST和ALT检测结果显示ALO对肝功能没有显着影响。免疫组化和western blot结果表明ALO能够抑制肿瘤组织的ERK蛋白的磷酸化,ALO可能是通过抑制ERK蛋白磷酸化抑制肿瘤的增殖。
樊利娜[7]2014年在《藏药波棱瓜子总木脂素部位对实验性肝损伤保护作用及其机制探讨》文中进行了进一步梳理目的：波棱瓜子是常见治疗肝病的藏药，疗效确切，前期研究表明，总木脂素部位是抗肝损伤的有效部位，但疗效尚不明确。本研究拟考察藏药波棱瓜子总木脂素部位对实验性肝损伤的保护作用，选取CCl4致小鼠化学性肝损伤及ConA致小鼠免疫性肝损伤两种动物模型，并进一步探讨其对ConA致免疫性肝损伤的作用机制。方法：采用腹腔注射0.1%的CCl4橄榄油溶液20ml/kg，建立急性肝损伤模型，禁食不禁水，16h后取血样，测定血清生化指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP），取部分肝脏进行病理学观察，计算肝脏系数。采用刀豆球蛋白ConA(20mg/kg)一次性尾静脉注射致小鼠免疫性肝损伤，造模8h后取血样和肝脏，计算脏器指数；考察不同剂量的波棱瓜子总木脂素对小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶（NOS）的影响和肝匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响；HE染色对肝组织进行病理检查；免疫组化法检测波棱瓜子总木脂素对小鼠肝脏中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）、核转录因子（NF-κB）的表达。结果：通过上述不同肝损伤模型进行药效学研究，波棱瓜子总木脂素可以降低肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP，显示出保肝作用。同时减弱ConA致免疫性肝损伤小鼠NO、NOS的过度表达；降低肝匀浆中MDA的含量，增强SOD和GSH-Px的活性；抑制相关炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）、核转录因子（NF-κB）的表达，促进抗炎因子白细胞介素-10（IL-10）的表达，从而起到保护肝脏的作用。病理观察结果也表明，波棱瓜子总木脂素能减轻肝脏病变，改善CCl4和ConA对肝组织的损伤。结论：波棱瓜子总木脂素对CCl4致小鼠化学性肝损伤和ConA致小鼠免疫性肝损伤都具有一定的保护作用。波棱瓜子总木脂素对ConA致小鼠免疫性肝损伤的作用机制可能与它增强肝组织自由基清除能力，增强机体抗脂质过氧化能力，减少炎性细胞在炎症和组织损伤区域的聚集，抑制炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）、核转录因子（NF-κB）的释放，促进抗炎细胞因子白细胞介素-10（IL-10）的表达有关。
廖春燕, 梁健, 杨燕, 陈苗苗, 尤俊霞[8]2009年在《苦豆子的药理及应用概述》文中研究表明苦豆(Sophora alope)为豆科槐属有毒灌草,性味苦寒有毒,其化学成分是地上部分含生物碱6.11～9.03%,种子含8.11%,种子有氧化苦参碱、氧化槐果碱、金雀花碱、苦参碱、槐果碱、槐定碱和尼古丁等生物碱。全草叶中还含糖类和蛋白质。苦豆草全株味极苦、性寒、有毒,具有清热解毒、抗菌消炎的作用,民间用根治疗喉痛、咳嗽、痢疾及湿疹等。我国药典1977年版已将"苦豆草片"加以收载,主治痢疾及肠炎,国外早在30年代初苏联开始研究,国内开始于1972年。国内外研究的重点主要在生物碱上,现在在传统医学领域临床常用于治疗赤痢、牙痛、湿疹顽癣、烫伤、妇科湿热带下;现代医疗主要是提取有效成分如苦参素照射液治疗慢性乙肝[1],2%苦豆子总碱乳膏治疗银屑病[2],等等。
黄洁春[9]2011年在《红背叶根总生物碱的提取分离及抗急性肝损伤小鼠的作用研究》文中研究说明研究背景：化学性肝损伤已成为继病毒性肝损伤之后的第二大肝病诱因,目前临床应用的500至1000余种中西药物以及多种化学药品,均可引起不同程度的肝病。据国内外资料报道,有20%的暴发性肝衰竭由化学药物引起。近年来,化学性肝损伤呈增加趋势,严重威胁人们的生命健康。研究肝炎的发生机理及寻找有效的治疗措施是国内外学者共同研究的热门课题,大量研究表明,国内很多专家学者把研究的重点转向我们传统的中药,研究治疗肝炎的中药是目前我国研究领域的一个热点。但目前临床上仍缺乏有效的防治药物,因而加强肝脏损伤保护研究、开展对化学性肝病的防护工作,对于提高人类健康水平具有重要意义。西医用于肝炎的治疗多见于抗病毒药、护肝降酶药及免疫调节类药物,目前临床上常用的品种有干扰素、阿糖胞苷、干扰素诱导剂聚肌胞、无环鸟苷、左旋咪唑、转移因子、辅酶Q、胸腺素、右旋儿茶素、甘草甜素、齐墩果酸、葫芦素B、葫芦素E、联苯双酯、维生素类等。临床治疗结果表明,这些药物多具有良好的抑制病毒复制,恢复正常肝功能,保护肝细胞等作用,并且疗效迅速,不足之处为远期疗效不稳定,易反复,HBsAg转阴率低,有些药品价格昂贵和表现一定的副作用。中医学认为肝损伤的病因多与外感时邪、饮食失常、情志失调或正气虚弱等有关。金实等认为本病的病因主要是外感湿热邪毒和饮食不当,并且与体虚劳倦有关,病机变化主要为湿热邪毒蕴结肝脾,肝胆失疏,脾胃不健,气滞血瘀,脉络失和所致。连粤湘等认为本病的病因病机为湿热外侵或疫毒感染,郁于脾胃,以致湿热熏蒸,脾失健运,肝失疏泄,肝脾不和,胆液外溢而为之。孙江桥等认为本病的病因病机多为湿热毒淤,肝郁气滞,瘀血阻络,脾失健运,肝肾阴虚所致。中医中药具有不良反应较少,可长期服药的特点。近年来,中药治疗肝炎取得了良好的疗效。生物碱(alkaloid)是存在于生物体(主要为植物)中的一类含氮的有机化合物,大多数有复杂的环状结构,氮原子多包含在环内,多呈碱性,可与酸成盐,有显着的生物活性,是中草药中重要的有效成分之一。生物碱是研究得最早的一类有生物活性的天然有机化合物。目前已分离到10000余种,其中80余种已用于临床,如黄连中的小檗碱用于抗菌消炎,麻黄中的麻黄碱用于平喘,萝芙木中的利血平用于降压,喜树中的喜树碱与长春花中的长春新碱用于抗肿瘤等。目前已对数十种生物碱进行了研究,麻黄碱、苦参碱、氧化苦参碱、秋水仙碱、烟碱、毒藜碱、罂粟碱、吐根酚碱、半边莲碱、奎宁、辛可宁、紫堇碱、小檗碱、吗啡、可待因、汉防己碱、延胡索乙素、吴茱萸碱、乌头碱、马钱子碱、士的宁、长春碱、长春新碱、厚朴碱、槟榔碱、槟榔次碱、东莨菪碱、山莨菪碱、木兰碱、蝙蝠葛碱、青藤碱、青风藤碱、莲花氏碱、麦角新碱、利血平、红豆杉醇、贝母碱等。其中许多以应用于临床并取得较好的疗效,如麻黄碱、秋水仙碱、苦参碱、吗啡、麦角新碱、延胡索乙素山莨菪碱等。文献已有报道不少生物碱对肝脏具有保护作用,例如：粗叶悬钩子总生物碱对急性肝损伤大鼠肝组织CYP2E1与CYP3A1酶mRNA表达的影响,岩黄连总碱提取物对小鼠免疫性肝损伤的改善作用,鬼针草提取物对小鼠实验性肝损伤的预防作用,氧化苦参素碱的抗乙型和丙型肝炎病毒效应,延胡索乙素对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用。红背叶根为双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆Alchornea trewioides (Benth.) Muell.-Arg.的根,别名为名红灵丹、红罗裙、红帽顶、红背娘、红骨白颧树根。主要分布于我国中部和东南、华南。其味甘,性凉,根四季可采,载于《广西中草药》。灌木或小乔本,嫩枝有毛,生山坡、荒地的灌丛中。具有清热解毒,祛风除湿,散瘀止血,平喘,杀虫止痒等作用。传统应用于治疗肠炎腹泻。痢疾,黄疸型肝炎,尿路感染和结石,肾炎,小便不利,尿血,血崩,白带,湿疹,荨麻疹,疮痈肿毒,疮疡久不收口等症。同时也用于治疗各型肝炎,是民间常用的保肝治肝药物,但目前国内外对其研究尚未深入报道。现代医学研究表明,红背叶根中含生物碱和酚性物质,具有止咳、祛痰作用,抗乙酰胆碱作用和轻度抑制金黄色与白色葡萄球菌作用。本课题组首次发现其水提物及水提醇沉所得的浸膏具有抗肝炎病毒和阻止肝纤维化的作用,有保肝、降酶、抗肝纤维化作用。体外实验研究表明有一定的抗乙肝病毒的作用。抗鸭乙肝病毒试验表明红背叶根有抑制体内D-HBV复制的作用,作用与剂量和用药时间相关。其作用较拉米夫定弱,但维持时间长、服药安全。课题组研究了红背叶根对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用,结果表明红背叶根可显着改善免疫性损伤小鼠胸腺、肝脏、脾脏系数,降低血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、一氧化氮的活性以及肝组织匀浆中TNF-α、IL-1β的含量,提示红背叶根对免疫性肝损伤具有显着的保护作用。上述实验表明,红背叶根是一个较为理想的多途径、多靶点、多环节治疗乙肝的候选药物。但经文件检索发现目前对红背叶根的研究并不多。研究目的：本课题组通过不同的提取方法对红背叶根进行提取,并比较不同提取方法所得的生物碱的含量,从中找到提取红背叶根生物碱中的最佳提取方法,并从中分离得出生物碱。同时比较不同提取方法的提取物对肝损伤的保护作用,对红背叶根总生物碱对四氯化碳所致的急性肝损伤的作用进行初步研究,以了解红背叶根中的有效成分,进而为其进一步的研究开发奠定理论和实验基础。研究方法：1红背叶根不同成分的提取1.1粉碎：除去泥沙杂质后,将红背叶根粉碎成粗粉,备用。1.2水提：取红背叶根原药材加8倍量水,加热回流2小时,收集提取液。残渣再加8倍量水加热回流2小时,过滤,合并提取液,蒸去多余水份,浓缩,冷藏备用。1.3醇提：取红背叶根原药材加8倍量95%乙醇,加热回流2小时,收集提取液。残渣再加8倍乙醇加热回流2h,过滤,合并提取液,回收乙醇后,冷藏备用。1.4生物碱的提取：采用酸水-碱化-亲脂性溶剂萃取,最终得到总生物碱。按与原药材的比例配置成一定浓度混悬水液。生物碱中、低剂量组分别用混悬液加蒸馏水稀释成1/2、1/4剂量,冷藏备用。2红背叶根不同提取物对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的实验研究2.1实验分组昆明种小鼠96只,体质量18～22 g,雌雄各半(南方医科大学实验动物中心提供)。采用随机分组的方法分为正常组、模型组、联苯双酯组(175mg/kg)、红背叶根水提物(7.8g生药/kg)、红背叶根醇提物(7.8g生药/kg)及红背叶根总生物碱高(7.8g生药/kg)、中(3.9g生药/kg)、低(1.95g生药/kg)剂量组,每组12只,雌雄各半。除正常组小鼠外,其余小鼠在造模的同时灌胃给药,灌胃剂量为0.5m/20g,正常组小鼠给同等剂量生理盐水。2.2造模方法连续灌胃给药5 d,第5天给药后1 h,采用腹腔注射0.12%四氯化碳(用橄榄油配制)0.1 ml/10 g,正常组小鼠腹腔注射相同体积的橄榄油,禁食不禁水16小时。2.3指标检测2.3.1摘眼球采血后,离心获得血清,按试剂盒说明操作检测血清ALT、AST、T.Bili活性。2.3.2肝脏组织病理学检查：处死动物,取出肝脏,用冷生理盐水洗去浮血,拭干。于肝门处及右肝叶取材1块,用10%中性福尔马林溶液固定,70%、80%、90%、95%、100%乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片机作4um切片,常规脱蜡,HE染色,中性树胶封片。用显微镜观察,以及PM-20型显微摄像系统照相。2.4统计处理方法实验结果计量资料用均数±标准差,方差齐性时,组间比较用One-Way ANOVA。采用LSD方法进行组间多重比较；方差不齐时,用Welch法,采用DunnettT3方法进行组间多重比较。用统计软件SPSS13.0进行分析,数据以(X±s)表示,P<0.05定为差异有统计学意义。结果：1采用不同提取方法对红背叶根成分进行提取,并比较所得的生物碱的含量,最终得出的结果为：采用水提法和醇提法所提取得到的生物碱的量约为0.06%,采用醇提法,提取所得生物碱含量稍高些。采用水提法,提取出来的其他非生物碱成分较多,分离生物碱比较麻烦。所以提取生物碱的较佳途径为醇提法。2与正常组比较,模型组血清ALT、AST水平升高(P<0.05),表明本次实验的小鼠急性肝损伤造模成功。红背叶根水提物、醇提物及总生物碱高、中、低剂量组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比较,模型组小鼠血清中胆红素水平升高(P<0.05),各给药组与模型组比较,血清胆红素的活性差异有统计学意义(P<0.05)。3小鼠肝组织形态学观察,镜下观察各组小鼠肝脏的病理变化。模型组小鼠肝细胞改变明显,部分肝小叶失去正常结构,肝细胞有不同程度的坏死灶伴炎症细胞浸润,部分可见体积增大,呈空泡片状病变,与正常组相比有显着性差异,提示造模成功。阳性药联苯双酯组小鼠肝细胞基本正常,仅见部分轻度肿胀,未见坏死灶。红背叶根水提物组、醇提物组、总生物碱高剂量组肝细胞轻度肿胀,未见坏死灶。总生物碱中剂量组肝细胞轻度肿胀,有点状坏死。低剂量组肝细胞肿胀明显,伴有散在点状坏死。红背叶根叁种提取物组与模型组相比较上述病理改变有所减轻。结论：1红背叶根总生物碱的较佳提取方法为：用8倍量的95%乙醇提取红背叶根中的总生物碱,本方法含杂质少,且含量较高。2结果显示红背叶根水提物、醇提物、总生物碱均具有预防四氯化碳所致肝损伤的作用。3红背叶根抗急性肝损伤的有效成分之一是红背叶根总生物碱,为红背叶根的进一步的研究开发奠定理论和实验基础。
沈海容[10]2014年在《红背叶根提取物抗乙肝病毒和抗肝损伤的药效学研究》文中研究说明研究背景：乙肝是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的,以肝脏损害为主的一种严重危害人类健康的传染性疾病,具有传染性强,流行面广和发病率高等特点。HBV感染呈世界性分布,流行区域包括亚洲、南太平洋、澳大利亚、新西兰、南美、中东、亚撒哈拉非洲和北极圈的土着。全世界大约有20亿乙型肝炎病毒感染者,每年由于急慢性HBV感染而死亡的人数高达100万,至2004年全球HBV慢性感染者已达4亿,我国有1.3亿HBV携带者,占世界乙肝感染者的30%。研究发现,“无症状乙肝病毒携带者”中60%-70%肝活检病理报告为慢性迁延性肝炎或慢性活动性肝炎,长期的乙肝病毒感染可发展为肝硬化,甚至肝癌。因此抗乙肝病毒治疗,阻止疾病的进一步发展是关键,而研究开发抗病毒效果好、副作用低的新药是势在必行。目前抗乙肝病毒药物的筛选主要通过体内动物和体外细胞模型实验进行。体内动物模型用得最多的是鸭乙型肝炎病毒(DHBV)模型。因家鸭易于喂养,因此该动物模型已广泛应用。该动物模型分为先天感染模型和后天感染模型两种,国外多采用前者,而国内则多采用后者。DHBV模型主要用于病毒复制试验、免疫学试验以及抗病毒药物的试验等叁方面。在抗乙肝病毒药效学的研究中,DHBV模型一直是较为公认的动物模型。体外实验模型主要是HepG2.2.15细胞。HepG2.2.15细胞株系由美国The Mount Sinai Medical Center于1986年建立,并且已成功地应用于抗HBV药物的筛选,作为抗HBV作用的指标,被中国卫生部收载于治疗肝炎的中药新药药效学研究指南。此模型对中药成分抗病毒研究比较合适,已成功的对叶下株、水芹、大黄等数十种成分进行了实验研究。肝损伤是肝病的病理基础。肝损伤的发生机制颇为复杂,可分为化学性和免疫性。化学机制主要通过细胞色素P450及结合反应产生的中间代谢产物产生损伤,如改变质膜的完整性、线粒体功能失调细胞内离子浓度变化、降解酶的活性和自由基的作用等；免疫机制则通过细胞因子、一氧化氮、补体及免疫变态反应等产生损伤。肝炎病毒是最为常见的致肝损伤原因。目前,多数学者认为乙型肝炎病毒感染引起的肝损伤主要与机体免疫应答有关。同时自身免疫性刺激、病毒或寄生虫感染也是肝损伤特别是肝炎的主要的原因。四氯化碳、D-氨基半乳糖或硫代乙酰胺诱导的急性化学肝损伤,以及慢性模型所造成肝损伤已广泛应用于筛选保肝药。然而,这些损伤显然是外部化学因素而不是由人类的宿主防御而诱导的肝炎,因此不适用于评价肝免疫调节剂。研究肝损伤的发病机制和保肝药物的作用原理需要建立合适的实验性肝损伤动物模型。因此,在抗肝炎药物研究中可采取损伤机制不同的多个模型上观察药物的保护作用,以综合判断药物疗效和作用机制。Con-A诱导肝损伤模型是近年来发展起来的由T淋巴细胞介导肝损伤模型。刀豆蛋白a(Concanavalin-A, Con-A)是一种在体内对肝细胞具有特异性毒性作用的植物凝集素,它进入循环后,引起CD4+T淋巴细胞为主的炎症细胞浸润肝细胞实质,继而激活TNF-a和白介素等细胞因子,引发炎症反应,通过肝细胞凋亡等多种途径损害肝细胞,造成免疫性肝损伤。该模型只需一次性尾静脉注射Con-A,最主要特点是发病迅速,肝脏损害明显。其病理生理过程,与人类慢性乙型肝炎中T淋巴细胞介导的肝细胞损伤极为相似,具有肝脏依赖性、剂量依赖性等特点。这一实验模型很好地模拟了人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病,是筛选急性肝损伤和暴发性肝衰竭治疗药物比较理想的动物模型。我国是乙肝发生率较高的国家之一,寻找和研究既具有抗病毒又具有保肝作用的有效天然药物,一直是中医药科研工作的重要方向。西医用于肝炎的治疗多见于抗病毒药、免疫调节药及护肝降酶类等药物。临床治疗结果表明,这些药物多具有良好的抑制病毒复制,恢复正常肝功能,保护肝细胞等作用,并且疗效迅速,不足之处为远期疗效不稳定,易反复,HBsAg转阴率低,有些药品价格昂贵和表现一定的副作用。另一方面,现代医学在干预肝损伤的治疗方面并无特异性药物,多采用休息加强营养补充维生素和对症治疗等,严重者甚至被迫终止用药。中医中药运用整体观念,辨证论治的特色,发挥中药的多途径、多层次、多靶点,价格低廉、副作用少的优势,在抗乙肝病毒和抗肝损伤治疗中取得了不错的疗效,越来越为广大医务工作者所重视。红背叶根是岭南地区常用的中草药之一,为双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆Alchornea trewioides(Benth.)Muell.-Arg.的根。功效清热解毒,祛风除湿,散瘀止血,平喘,杀虫止痒。在民间保肝应用历史悠久,疗效确切。本课题组的前期研究结果首次表明红背叶根具有保肝、降酶、抗肝纤维化的作用,并申请了专利保护。为进一步探讨筛选红背叶根抗病毒及保肝作用的有效部位,我们提取了4种红背叶根提取物,然后对它们进行实验研究,为其抗病毒、保肝作用提供确切的依据。研究目的：通过使用HepG2.2.15细胞模型,先天感染DHBV的鸭乙肝模型和Con-A致小鼠肝损伤模型,对红背叶根水提物(WE),石油醚提取物(PE),乙酸乙酯提取物(EE),正丁醇提取物(BE)等4种提取物进行抗乙肝病毒(HBV)和抗急性免疫性肝损伤及其免疫调节机制的实验研究,探讨其抗病毒和抗免疫性肝损伤及免疫调节的作用机制,为红背叶根的进一步开发利用奠定实验基础。研究方法：第一部分红背叶根4种提取物抗乙肝病毒的实验研究实验一：红背叶根不同提取物体外抑制HBsAg和IBeAg的实验研究方法：通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察红背叶根不同提取物对HepG2.2.15细胞的影响,采用ELISA法检测分析红背叶根不同提取物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用。实验二：红背叶根提取物体外对乙肝病毒复制的影响方法：采用荧光定量PCR-探针法检测分析红背叶根4种提取物对HepG2.2.15细胞分泌HBV-DNA的抑制作用。实验叁：红背叶根提取物体内抗鸭乙肝病毒的实验研究方法：常规PCR法筛选先天性感染的DHBV雏鸭。将筛选出的先天感染鸭随机分组。给药组每天一次性灌胃,共灌胃14d。对照组未做任何处理。每组动物分别于给药前1d、给药后7d、给药后14d、停药后5d自胫静脉采血,离心后收集血清。运用斑点杂交法对鸭血清进行DHBV-DNA检测。第二部分红背叶根4种提取物对Con-A致小鼠急性肝损伤的保护作用研究实验四：红背叶根提取物对Con-A致小鼠急性肝损伤的转氨酶和肝组织形态学的影响方法：随机分组后,模型组和正常对照组每天灌胃同体积生理盐水；各给药组连续给药3d,末次给药1h后,模型组及各给药组尾静脉注射Con-A溶液,诱导小鼠急性免疫性肝损伤,正常对照组注射等量的无菌生理盐水,禁食,不禁水,8h后摘眼球采血,处死小鼠后取肝脏同一部位,10%福尔马林固定。所采集的血液经离心后收集血清,待测血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶；固定好的肝组织进行病理学检查,经HE染色后,观察小鼠肝脏组织结构变化情况。实验五：红背叶根提取物对Con-A致小鼠急性肝损伤的免疫调节作用研究方法：采用WST-1法检测肝组织SOD活力；TBA法检测肝组织MDA含量,比色法测定肝组织GSH-PX活力；ELISA法检测血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ;流式细胞术检测脾巨噬细胞上TLR4、Tim-4表达百分比。统计处理以上各实验结果用均数±标准差(mean±SD)表示,多个样本比较用one-way ANOVA进行分析处理；重复测量数据采用重复测量方差分析,多组等级／频数表资料用非参数检验中的K Independent Samples Tests进行数据处理。两个变量之间的相关关系采用双变量相关分析(Bivariate)。采用统计软件SPSS13.0进行分析,以P<0.05定为差异有统计学意义。结果1、BE在无毒浓度下对HepG2.2.15分泌的HBsAg、HBeAg的抑制率分别达65.2%、94.4%,治疗指数分别为>9.8和>67.1；EE对HBeAg抑制率达53.4%,治疗指数>2,而对HBsAg的无抑制作用；其他两种提取物种对HBsAg、HBeAg则无抑制效果。2、结果显示,F=9.479,P=-0.000。与细胞对照组相比,WE、PE、EE以及BE对HepG2.2.15分泌的HBV-DNA的病毒载量均有明显的抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05)。3、结果显示,总体上,不同时间点DHBV-DNA变化无显着性差异(F=2.296,P=0.110)；各组间DHBV-DNA却存在显着差异(F=12.416,P=0.000)；时间与分组间存在交互效应(F=6.393,P=0.000)。红背叶根4种提取物只有PE高剂量组在治疗14d后血清DHBV-DNA有下降趋势,差异有统计学意义(P<0.01),停药5天后仍保持下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05),其他组无抑制血清DHBV-DNA的作用。4、结果显示,ALT方面,F=34.616,P=0.000；AST方面,F=37.658,P=0.000。肝细胞变性方面,X2=57.935,P=0.000；肝细胞坏死方面,X2=41.751,P=0.000；表明各组疗效存在显着性差异。红背叶根4种提取物都可显着降低血清中谷丙转氨酯、谷草转氨酶,差异有统计学意义(P<0.01)。在肝脏组织形态学方面,与正常组相比较,模型组肝脏变性及坏死等病理变化特别显着(P<0.05/14),动物模型建立成功。在肝细胞变性方面,各给药组改善肝脏变性的效果无显着差异。在肝细胞坏死方面,PE的中剂量组,EE的高剂量组、BE的低、中剂量组以及甘利欣组减轻肝细胞坏死的效果差异显着(P<0.05/14)；镜下观察结果见表4-2和图4-(1-15)(HE染色×200)。5、结果显示,SOD的F=34.961,P＝0.000:MDA的F=23.613,P=0.000；GSH-PX的F=37.089,P=0.000。IL-6的F=74.279,P,=0.000:TNF-α的F=28.023,P=0.000；IFN-γ的F＝374.800,P＝0.000.TLR4的F=4.552,P=0.015:Tim-4的F=6.763,P=0.003。红背叶根4种提取物不仅都可以显着降低肝脏MDA含量(P<0.01),而且还可以显着提高肝脏SOD活力,差异均有统计学意义(P<0.01)；至于GSH-PX,除了EE之外,其他叁种提取物都可以显着提高肝脏GSH-PX活力,差异均有统计学意义(P<0.05)。同时,红背叶根4种提取物既可显着抑制炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ,差异有统计学意义(P<0.05)；又可提高脾巨噬细胞上的TLR4和Tim-4的表达百分率,差异有统计学意义(P<0.05),提示4种提取物可上调脾巨噬细胞上的TLR4和Tim-4的水平。TLR4和Tim-4呈正相关关系(r=0.538,P=0.021)(P<0.05)。结论在乙肝病毒方面,体外研究结果显示只有EE和BE可以抑制HBV抗原,而BE的效果较EE好；4种红背叶根提取物都可以抑制HBV-DNA；体内研究结果显示只有PE高剂量组在治疗14d后血清DHBV-DNA有下降趋势,停药5天后仍保持下降趋势,其他组无抑制血清DHBV-DNA的作用。由此可见HBV抗原和HBV-DNA是红背叶根抗HBV的两个作用靶点。研究结果表明,红背叶根4种提取物中正丁醇提取物既可以抑制HBV两个抗原,又可抑带HBVDNA,因此红背叶根正丁醇提取物抗乙肝病毒效果最好的。在急性肝损伤方面,红背叶根提取物可以降低转氨酶,改善肝脏组织变性坏死形态,还可以降低肝脏MDA含量,提高肝脏SOD和GSH-PX活力。同时,红背叶根4种提取物不仅都可显着抑制炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ,而且还上调了脾巨噬细胞上TLR4和Tim-4的表达水平,TLR4和Tim-4呈显着正相关关系,由此可见降低转氨酶,改善肝脏组织形态,抑制脂质过氧化反应,抑制炎性细胞因子,上调TLR4和Tim-4的表达是红背叶根4种提取物保肝的几种可能机制；另外,TLR4和Tim-4在免疫调节方面发挥着重要的作用,我们发现两者存在正相关关系,可推断脾巨噬细胞上的TLR4和Tim-4表达的上调可能与抗乙肝病毒和抗肝损伤有关。可见,红背叶根对急性肝损伤具有较好的免疫调节作用。4种红背叶根提取物中,以BE抗乙肝病毒和抗肝损伤的作用最好,我们推测BE通过免疫调控作用,上调了TLR4和Tim-4水平,一方面,BE可能做为TLR4的激动剂,进而抑制HBsAg、HBeAg和HBVDNA,从而起到抗乙肝病毒的作用,另一方面,Tim-4水平的上调,抑制了脂质过氧化反应和炎性细胞因子,进而降低转氨酶,改善肝脏组织变性坏死形态,从而起到抗肝损伤的作用。
参考文献：
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