万升标[1]2001年在《法呢基蛋白转移酶抑制剂的设计、合成和活性评价》文中研究表明近十几年来研究发现许多肿瘤细胞中存在ras癌基因，其表达产物为变异了的Ras蛋白，Ras蛋白在细胞生长和增殖过程中起信号转导作用，其首要步骤是在法呢基蛋白转移酶(FTase)催化下，法呢基焦磷酸酯(FPP)的法呢基与Ras蛋白末端四肽CAAX中的半胱氨酸巯基结合，增加了Ras蛋白的亲脂性，利于移行到细胞膜上进行信号转导。FTase在肿瘤细胞中的活性较正常细胞高，因此针对其配体CAAX或FPP设计和合成FTase抑制剂成为抗癌研究的重要课题。 本论文以计算机为辅助手段设计了两类FTase抑制剂。 1，连有咪唑基的苯并二氮杂(艹卓)化合物，以苯并二氮杂(艹卓)-2-酮为分子骨架，7位连接含有咪唑基的侧链，1位或3位连接含羧基或酯基的侧链。此类化合物模拟了CAAX配体。 2，苯甲酸硫醇酯化合物，苯基对位或连接线型取代基或连接含羧基的苯并二氮杂(艹卓)。硫原子接有不同长度的直链烷基，当与甲基或乙基相连时为CAAX模拟物，当与长链烷基相连时认为是CAAX和FPP双底物模拟物。 从已报道FTase、CAAX和FPP的叁元复合物单晶结构中剥离出CAAX利FPP，分别与所设计的构象能量最低优化后的代选分子进行迭合，选择重迭较佳的分子进行合成。 1，4-苯并二氮杂(艹卓)-2-酮类化合物的合成过程中分别对其1、3、4和7位进行了基团变化，在1和3位连接不同长度含羧基或酯基的侧链，在7位连接不同取代的咪唑丙酰氨基。在苯甲酸硫醇酯化合物合成过程中，建立了一种硫原子连有不同长度碳链的苯甲酸硫醇酯的合成方法。 本论文共合成化合物93个，新化合物73个，目标化合物48个。所有目标化合物都经核磁鉴定，其中21个经高分辨质谱验证，18个经元素分析验证，两个化合物经单晶X衍射光谱确证。
吴静[2]2009年在《筛选PKCζ特异性抑制剂PKCzI257.3抑制EGF诱导的乳腺癌细胞趋化运动》文中研究说明研究内容:肿瘤发生转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因。近年来的研究发现,器官特异性表达的趋化因子及癌细胞表达的受体介导的趋化运动在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥着重要的作用。许多组织和器官可以分泌一系列趋化因子如表皮生长因子(EGF)和CXCL12,研究发现它们通过表皮生长因子受体(EGFR)和CXCR4可以有效地介导癌细胞的趋化运动,而EGF更是一个有效的乳腺癌细胞趋化运动的趋化因子。尽管癌细胞趋化运动的复杂分子机制至今还不清楚,然而近年来一些研究发现,在所有PKC亚型中,PKCζ是EGFR和CXCR4介导的乳腺癌和非小细胞肺癌细胞趋化信号途径重要的汇聚点,常被激活或过表达。我们课题组的前期工作也证实了利用siRNA技术降低细胞中PKCζ的表达,能够明显抑制癌细胞在体内的扩散和转移,显示PKCζ可以作为一个抗癌药物靶标。基于此,本研究应用美国Invitrogen公司的药物筛选试剂盒针对小分子化合物库筛选PKCζ激酶特异性的抑制剂,并探讨抑制剂对癌细胞趋化运动的影响,以揭示肿瘤发生转移的分子机制,以便进一步寻找更有效的肿瘤转移抑制剂。方法:第一部分:应用美国药物筛选试剂盒Z'-LYTE~(TM) KINASE Kit,针对含有180种小分子化合物的化合物库筛选PKCζ激酶特异性的抑制剂。第二部分:以乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象,采用MTT实验检测筛选出的小分子化合物的细胞毒性;通过细胞趋化实验和伤口愈合实验来检测它对MDA-MB-231细胞迁移的影响;通过肌动蛋白聚合实验、粘附实验和cofilin蛋白的western blotting实验探讨其对抑制癌细胞趋化运动和迁移的分子机制。结果:第一部分:通过试剂盒筛选得到PKCζ和PKCα的最佳激酶浓度分别为125、9ng/ml;.小分子化合物PKCzI257.3(分子式:C_(15)H_(19)N_3O)可以特异性地显着抑制PKCζ激酶的活性(IC_(50)=28μM),对PKCα没有明显的抑制作用(IC_(50)=200μM);商品化的PKC抑制剂G_(o|¨)6850既可以抑制PKCζ激酶的活性(IC_(50)=4.8μM),又可以抑制PKCα的活性(IC_(50)=0.04μM)。第二部分:通过MTT实验检测,结果发现PKCzI257.3对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖没有明显的影响;趋化和伤口愈合实验检测得到PKCzI257.3显着抑制了EGF诱导的乳腺癌细胞的趋化运动和迁移;通过细胞粘附实验发现PKCzI257.3显着抑制了癌细胞对纤维连接蛋白的粘附;通过F-actin聚合实验和Westernblotting实验证实了PKCzI257.3能够抑制cofilin的活化和肌动蛋白的聚合。结论:1.小分子化合物PKCzI257.3可以特异性抑制PKCζ激酶的活性,并且没有明显的细胞毒性;一系列细胞功能实验显示:PKCzI257.3可以有效地抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的趋化运动和迁移、粘附,其分子机制可能是PKCzI257.3通过阻断EGF诱导的cofilin活化和肌动蛋白的聚合从而抑制了癌细胞的运动。2.初步的分析显示了PKCzI257.3是一个PKCζ激酶特异性抑制剂,有望成为治疗癌症转移的一种靶向性药物。
方毅林[3]2016年在《2-(1H)-喹啉酮衍生物的设计合成和生物活性研究》文中研究表明本研究以具有多种生物和药理活性的2(1H)-喹啉酮为母核,利用计算机辅助药物设计和活性迭加原理,合理地引入活性药效团氨基膦酸酯、芳氨基噻唑、苄(亚)氨基噻唑和苄亚肼基噻唑,设计合成了5个系列抗肿瘤新化合物和2个系列抗流感神经氨酸酶(NA)抑制剂。由中间体2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-甲醛(G)合成了目标化合物A,以3-(4,4-二甲基-3-氧代-2-溴戊基)-2(1H)-喹啉酮(J)合成了目标化合物B、C、D和E。分别测试了化合物A、B、C、D和E对3~4种肿瘤细胞的体外细胞毒活性,化合物C和E对流感病毒神经氨酸酶的抑制活性。(1)[(芳氨基)(2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-基)甲基]膦酸二乙酯(A)的合成与抗肿瘤活性以2-(1H)-喹啉酮为母核,在3位上引入抗癌活性基团芳氨基膦酸酯,设计和合成了30个新颖的[(芳氨基)(2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-基)甲基]膦酸二乙酯;抗肿瘤活性测试显示,氨基膦酸酯的引入能有效地改善母核的抗肿瘤活性,其中化合物A21和A24对A549、MCF-7和U2OS细胞株具有很好的抑制活性,IC50值均小于10μM。利用Hoechst33342单染色法和AO/EB双染色法检测化合物A21对宫颈癌细胞HeLa的诱导凋亡作用,结果表明化合物A21对肿瘤细胞具有较好的诱导凋亡作用;细胞凋亡与周期实验表明,化合物A21能阻滞细胞有丝分裂于G2/M和S期。(2)3-[(4-叔丁基-2-(芳氨基)噻唑-5-基)甲基]-2(1H)-喹啉酮(B)的合成与抗肿瘤活性以2-(1H)-喹啉酮为母核,引入具有优良生物活性的噻唑环,设计和合成了29个3-[(4-叔丁基-2-(芳氨基)噻唑-5-基)甲基]-2(1H)-喹啉酮;抗肿瘤活性测试结果显示化合物B3、B7和B28对MCF-7细胞株表现出很好的抑制活性,IC50为0.4±0.1μM、1.1±0.1μM和1.8±0.6μM。利用Hoechst33342单染色法和AO/EB双染色法检测化合物B7对宫颈癌细胞HeLa的诱导凋亡作用,结果表明化合物B7对肿瘤细胞具有较好的诱导凋亡作用;细胞凋亡与周期实验表明,化合物B7能阻滞细胞有丝分裂于G1期,随着浓度的增加亦能对G2期发生阻滞。(3)(E)-3-[[4-叔丁基-2-(2-羟基苄(亚)氨基)噻唑-5-基]甲基]喹啉-2(1H)-酮(C)和(D)的合成与生物活性以2-(1H)-喹啉酮为母核,保留活性基团氨基噻唑,利用缩合反应引入具有优良生物活性的取代水杨醛衍生物。设计和合成了10个(E)-3-[[4-叔丁基-2-(2-羟基苄亚氨基)噻唑-5-基]甲基]喹啉-2(1H)-酮(C),研究了其抗肿瘤活性和神经氨酸酶抑制活性。为了克服希夫碱不稳定性,在不限制其它结构的平面性的基础上,将碳氮双键还原为更加稳定的碳氮单键,得到了9个3-[[4-叔丁基-2-(2-羟基苄氨基)噻唑-5-基]甲基]喹啉-2(1H)-酮(D),并对比了其还原前后抗肿瘤活性的差异。抗肿瘤活性结果表明化合物C对叁种肿瘤细胞均有较好的抑制活性,其中化合物C3和C5的对HeLa细胞表现出良好的抑制活性,IC50值分别为8.2±0.9μM和11.1±1.5μM;将C=N还原为稳定的C-N后,大部分的化合物D对HeLa和MCF-7细胞株的抑制活性增强,但还原后的化合物D却由于柔性的增加对A549细胞株的抑制活性比亚胺差。利用Hoechst33342单染色法和AO/EB双染色法检测化合物D1对宫颈癌细胞HeLa的诱导凋亡作用,结果表明化合物D1对肿瘤细胞具有较好的诱导凋亡作用;细胞凋亡与周期实验表明,化合物D1能阻滞细胞有丝分裂于G2期。神经氨酸酶(NA)抑制活性测试结果显示化合物C对NA具有一定的抑制作用。分子对接分析表明,化合物C是一个双位点抑制剂,有进一步结构改造的价值。(4)(E)3-[(4-叔丁基-2-(苄亚肼基)噻唑-5-基)甲基]-2(1H)-喹啉酮(E)的合成与生物活性以2-(1H)-喹啉酮为母核,通过合理设计延长侧链,合成了26个3-[(4-叔丁基-2-(苄亚肼基)噻唑-5-基)甲基]-2(1H)-喹啉酮(E)。抗肿瘤测试结果表明化合物E对3种肿瘤细胞均有较好的抑制活性:化合物E1、E10和E11对HeLa细胞表现出很好的抑制活性,IC50值均小于5μM;化合物E9、E11、E14、E15和E21对A549细胞表现出较好的抑制活性,IC50均小于10μM。利用Hoechst33342单染色法和AO/EB双染色法检测化合物E对宫颈癌细胞HeLa的诱导凋亡作用,结果表明化合物E10对肿瘤细胞具有较好的诱导凋亡作用;细胞凋亡与周期实验表明,化合物E10阻滞细胞有丝分裂主要在G2期。NA抑制活性测试结果显示,化合物E对NA具有较好的抑制活性,其中化合物E12的抑制活性最好,IC50值为44.66μM。通过分子对接发现化合物E12能同时作用于NA的SA-Cavity和430-Cavity,是一个新颖的双位点NA抑制剂。
洪卉[4]2010年在《氮杂吲哚螺环化合物库的设计、合成及抗肿瘤活性研究》文中进行了进一步梳理氮杂吲哚螺环化合物是一类重要的杂螺环化合物,具有抗肿瘤、抗焦虑、消炎、解热及镇痛、降压和杀虫等生物活性,引起了药物学家和化学家的广泛关注。为探索发现新的抗肿瘤先导化合物,本课题设计合成了螺[哌啶-4,3’-吡咯[2,3.b]吡啶]-2’(1’H)-酮,并以其为母核设计合成了化合物库,并对化合物库的抗肿瘤活性进行了初步研究。通过反合成分析法设计了螺[哌啶-4,3’-吡咯[2,3_b]吡啶]-2’(1’H)-酮的合成路线。以廉价易得的烟酸为原料,经过氧化、氯化、还原得到2-氯-3-羟基吡啶;经氯化、氰基取代得到2-氯-3-氰甲基吡啶;通过双烷基化、水解、环化和脱Boc反应合成了螺[哌啶-4,3’-吡咯【2,3-b】吡啶]-2’(1,H)-酮化合物。并通过路线改进合成1’,2’-二氢螺[哌啶-4,3’-吡咯【2,3-b】吡啶化合物。通过反应条件进行优化,得到了最佳反应条件。此合成路线原料廉价易得,反应条件温和,操作简单。以烟酸为原料,经9步反应得到氮杂吲哚螺环化合物,总收率为15%。为氮杂吲哚类螺环化合物的合成提供了新的高效合成方法。根据文献中药物类似化合物的信息,设计了氮杂吲哚螺环化合物库,并选择12种具有代表性的取代基,通过还原胺化反应得到了螺[哌啶-4,3’-吡咯[2,3-b]吡啶]-2’(1’H)-酮衍生物氧化氮杂螺环化合物库,其衍生物种类多样涵盖了脂肪族、芳香族和杂环族取代基团。以合成的系列氮杂吲哚螺环化合物进行了抗肿瘤活性研究,发现氮杂吲哚螺环化合物对人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL7402、人结肠癌细胞HcT-8均有一定的抑制作用,化合物对人肺腺癌细胞A549抗肿瘤活性明显。对人肝癌细胞BEL7402和人结肠癌细胞HCT-8也有一定的抑制活性。初步探讨了此系列化合物的构效关系,带有叁氟氧基取代的苯环、呋喃基团、噻吩基团、3-氟基-4-甲基取代的苯环和环己烷基团的氧化氮杂吲哚螺环化合物能较好的抑制肿瘤细胞的增殖,这一工作为研究药物诱导癌细胞凋亡的作用机制,进一步设计合成更多结构新颖药效显着的抗肿瘤吲哚螺环类化合物打下了基础。对于发现药物前体和药物作用靶体具有重要的理论和应用意义。
赵雪艳[5]2016年在《基于转录组测序对UV-B辐射下甘遂乳汁的比较蛋白质组学研究》文中研究表明甘遂(Euphorbia kansui L.)是大戟科(Euphorbiaceae)大戟属(Euphorbia)的多年生草本植物,为中国特有植物。其干燥块根是传统中药,历代《中国药典》皆有收载。甘遂全株含有白色乳汁,乳汁是乳汁管的原生质体。乳汁中含有许多具有生理活性的蛋白质,这些蛋白质与乳汁管的发育和乳汁管中次生代谢产物的合成密切相关。我们先前研究了甘遂乳汁管的分布、发育、乳汁管的超微结构变化以及初步的乳汁蛋白质组学,但是,甘遂基因组信息的缺乏限制了其乳汁蛋白质的鉴定及其分子生物学的研究。第二代转录组测序以及蛋白质组学技术的发展,极大的推动了非模式生物以及缺乏基因组参考数据的植物的分子生物学研究。本研究采用Illumina双端测序技术对甘遂转录组进行测序,得到大量的独立基因。并且在转录组数据库的基础上,利用iTRAQ标记以及质谱技术研究甘遂乳汁全蛋白以及UV-B辐射对甘遂乳汁蛋白质的影响,为深入探讨甘遂乳汁管细胞的发育过程以及萜类物质的合成和调控提供理论基础。主要研究结果如下：1.甘遂转录组测序以及开发SSR标记1.1甘遂转录组序列组装及数据分析在本研究中,采用Illumina双端测序技术对甘遂进行转录组测序,共获得43211690个高质量的reads。.将得到的reads进行组装得到58362个unigenes,且unigenes的平均长度和N50长度均为1683 bp。将得到的unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库中进行比对和注释,其中36396(62.36%)个unigenes成功注释。其中有36318个unigenes注释到Nr数据库中,26640个注释到Swiss-Prot数据库中,13528个注释到COG数据库中,9562个注释到KEGG数据库中,15506个注释到GO数据库中。1.2甘遂萜类化合物合成相关基因的鉴定及分析萜类化合物是甘遂主要的生物活性成分。基于KEGG数据库分析,在甘遂转录组中鉴定出了萜类骨架合成相关酶的nigenes,包括3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶以及甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶等的unigenes。此外,还发现了催化其活性成分二萜类化合物合成的重要酶——蓖麻烯合酶的unigene。1.3 SSR位点的检测和验证为了开发分子标记,在6150个unigenes中检测到7016个候选的SSR位点并随机选取40对引物在两个居群中进行多态性检测,28对引物成功地扩增出预期大小的条带并且23对引物存在多态性,5对引物存在单态性。多态性SSR位点的等位基因有2-8个,平均等位基因数为3.391。期望杂合度和实际杂合度分别为0.099至0.809及0.100至1.000。2.甘遂乳汁蛋白质的鉴定基于甘遂转录组数据库和大戟科蛋白数据库,利用iTRAQ标记和质谱技术在甘遂乳汁中共鉴定出584个蛋白质。2.1甘遂乳汁管发育相关的蛋白质本研究中,营养生长时期的乳汁管处于乳汁管发育后期以前的阶段,而生殖生长时期的乳汁管多为发育末期和成熟的乳汁管。对处于营养生长时期和生殖生长时期乳汁管的乳汁进行差异蛋白质组学分析,发现蛋白酶体蛋白的丰度下调,即其在营养生长时期的乳汁管中的含量较高。抗泛素抗体的免疫印迹结果也发现营养生长时期的乳汁管的乳汁中泛素化蛋白的含量较生殖生长时期稍多,尤其是分子量约为35 kDa处的条带。在乳汁管发育过程中,降解错误折迭蛋白质的内质网相关降解途径中的一些蛋白质的含量也发生改变。这表明在乳汁管发育过程中泛素-蛋白酶体途径参与了乳汁管细胞中细胞质以及内质网上相关蛋白的调控或降解。此外,在甘遂乳汁中鉴定到了一些溶酶体酶,其中,随着甘遂乳汁管的发育V-ATPase的含量下调,故推测自噬途径也可能参与了甘遂乳汁管的发育过程。2.2乳汁管中萜类化合物骨架合成相关的蛋白质在甘遂乳汁中鉴定到了萜类化合物骨架合成相关的蛋白质,蛋白质定量分析发现,异戊烯焦磷酸异构酶及法呢基焦磷酸合酶在营养生长时期的乳汁管的乳汁中的含量较高。随着乳汁管细胞的生长发育,这些酶的含量下调。2.3 UV-B辐射下的差异表达蛋白分析通过差异蛋白质组学研究发现UV-B辐射处理后,乳汁中14-3-3蛋白、V-ATPase、溶酶体酶和cathepsin B的含量上调,UV-B辐射可能影响甘遂乳汁管的发育。此外,UV-B处理后,乳汁中甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的含量上调,并得到western blot结果的验证,表明UV-B辐射也影响乳汁管中萜类化合物的合成。综上所述,本研究首先利用第二代高通量测序技术对甘遂进行大规模转录组测序,得到大量独立基因,并对得到的独立基因进行注释和分析。此外,还鉴定到了参与萜类骨架合成以及二萜类化合物合成的候选基因,并且开发和验证一些SSR引物。在转录组数据库的基础上,利用iTRAQ标记和质谱技术鉴定甘遂乳汁蛋白。通过差异蛋白质组学分析,鉴定到多个参与甘遂乳汁管细胞发育和乳汁管中萜类化合物合成相关的蛋白,为进一步探讨乳汁管细胞的发育及萜类化合物的合成和调控提供理论基础。
张浩[6]2014年在《棉蚜类异戊二烯通路两个关键酶基因的克隆与功能分析》文中进行了进一步梳理棉蚜(Aphis gossypii Glover),属半翅目Hemiptera、蚜科Aphididae、蚜属Aphis,是一种世界性的农业害虫,主要通过刺吸植物汁液和传播病毒病对棉花、瓜果蔬菜等造成严重危害。类异戊二烯通路是棉蚜体内一个重要的代谢途径,此通路上的多种类异戊二烯代谢产物对棉蚜的生长发育、生理活动都有重要的作用,因此对此通路上的一些关键酶进行深入的分析和研究具有重要的意义。异戊二烯基焦磷酸合成酶(又称为异戊二烯基转移酶)就是这样一类关键酶,其催化产物是多种类异戊二烯化合物的前体物质。本研究对其中的两个关键酶——十聚异戊二烯焦磷酸合成酶(DPPS)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)的编码基因进行了克隆、重组表达和功能分析。十聚异戊二烯焦磷酸合成酶(DPPS)属于长链异戊二烯基焦磷酸合成酶,是辅酶Q异戊二烯侧链合成过程中的关键酶。辅酶Q在生物体中发挥着重要的生理作用。长链异戊二烯基焦磷酸合成酶在细菌、酵母、植物和哺乳动物中已得到广泛研究,但在昆虫中研究得很少。本研究克隆了编码棉蚜十聚异戊二烯焦磷酸合成酶(AgDPPS)两个亚基的基因(AgDPPS1和AgDPPS2, GenBank登录号：KC431243和KC431244)。它们分别包含1230bp和1275bp的开放阅读框,编码409个和424个氨基酸。序列比对和系统进化分析表明,AgDPPS与人类的DPPS类似,是由两个异源亚基构成的。重组表达和体外的酶促分析结果表明,这两个亚基对该酶的催化活性是缺一不可的,形成的主要中间产物是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。在大肠杆菌DH5α的体内表达分析表明,AgDPPS是棉蚜合成辅酶Q10的关键酶。我们的研究表明,AgDPPS的催化过程包含两个主要步骤,其催化过程以GGPP作为主要中间产物,以十聚异戊二烯焦磷酸(DPP)作为最终产物。我们的研究是昆虫中首次对合成辅酶Q10侧链的关键酶的研究。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)是短链异戊烯转移酶,其催化产物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)在蚜虫体内最重要的作用是蛋白质的异戊烯基化。这种修饰对于蛋白质在膜结构或胞质中的特异性定位、细胞骨架组装、细胞间信号传导有重要意义。GGPPS在植物、真细菌、古细菌、酵母和哺乳动物中已被广泛研究,但对昆虫中GGPPS的研究仍然非常少。本研究克隆了编码棉蚜牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(AgGGPPS)的基因(GenBank登录号KF220654),其具有930bp的开放阅读框,编码309个氨基酸,理论等电点是6.21。序列分析和系统进化分析表明,AgGGPPS的氨基酸序列包含所有异戊二烯基转移酶具有的富含天冬氨酸的保守区域,AgGGPPS作为昆虫的GGPPS被归类为Ⅲ型GGPPS.本研究对AgGGPPS的原核重组表达、亲和层析纯化以及体外酶活性的测定,发现了AgGGPPS能催化DMAPP、GPP或FPP作为烯丙基底物与IPP反应形成GGPP。虽然在不同的底物情况下AgGGPPS的酶活性有所不同,但与其他只接受FPP为烯丙基底物的Ⅲ型GGPPS是不同的。本研究首次鉴定了棉蚜类异戊二烯通路两个关键酶,并对其生化特性进行了深入研究,所获得的结果有助于利用棉蚜类异戊二烯通路调控蚜虫的发育,从而为蚜虫的防控提供科学依据。
唐章勇, 唐灿[7]2007年在《酶抑制剂筛选的研究进展》文中研究指明20世纪60年代初,Umezawa提出了酶抑制的概念,从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。酶抑制剂新药发现的途径:一是来源于天然化合物,包括动植物和各种微生物等,二是化学合成物。在目前上市的药物中,以受体为作用靶点的药物占52%,以酶为靶点的药物占
许晓双[8]2016年在《远志皂苷生物合成中CYP450s、UGTs的筛选及远志对hDDC酶抑制作用初探》文中研究表明选题依据:远志皂苷作为远志药材中重要的次生代谢产物之一,属于齐墩果烷型五环叁萜类化合物,具有安神益智、镇静祛痰、抗抑郁、抗衰老、抗老年痴呆等药理作用。远志皂苷药理活性的多样性使其特别适合开发成为具有抗衰老和脑保护作用新药的先导化合物,但其从药材中的提取率极低,且尚未建立人工合成方法,这已严重制约了相关药物的开发。因此阐明远志皂苷生物合成途径,将对于在体外生物合成大量远志皂苷具有重要意义。本课题组前期研究已证明远志皂苷生物合成上游是通过甲羟戊酸(MVA)途径完成的,中游的鲨烯合成酶(SQS)和角鲨烯环氧酶(SQE)与下游合成远志皂苷的前体的β-香树脂合酶(β-AS)密切相关,但后期还需经过植物细胞色素单加氧酶P450(CYP450s)与糖基转移酶(UGTs)的修饰生成远志皂苷。由于CYP450s、UGTs是较大的酶家族,所以目前远志皂苷下游途径仍不清晰,因此筛选远志皂苷下游途径中的CYP450s、UGTs酶基因是阐明远志皂苷整条生物合成途径的关键所在。目前,已有研究证明远志对于帕金森病(PD)有一定的治疗作用,但上述对远志抗PD的研究是基于动物体内及细胞水平上,具有造模周期长、影响因素多、经济成本高等缺点,并且缺少在蛋白水平上的相关研究。因此,建立一种体外多巴脱羧酶(hDDC)特异抑制剂的筛选模型将有助于远志抗PD药理作用的深入研究。目的:1.获得远志根与叶的转录组数据,进一步丰富远志基因资源,筛选远志皂苷的生物合成下游途径中关键酶基因—CYP450s与UGTs。2.复制并建立一种体外hDDC特异抑制剂的筛选模型,用于探讨远志的抗PD的药理作用。方法:1.应用数字基因表达谱(DGE)测序技术分别对远志皂苷含量差异较大的根与叶组织,平行叁次进行测序,得到远志根与叶中的差异表达基因,筛选出远志根中上调的酶基因。2.基于远志根与叶的DGE数据,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对涉及远志叁萜皂苷生物合成途径的22条基因(17条CYP450s与5条UGTs)在远志根与叶中表达水平进行分析,通过相关性分析得到参与远志皂苷生物合成下游途径的关键CYP450s和UGTs酶基因。3.采用hDDC与PEPC联合酶活测定体系建立hDDC特异抑制剂的筛选模型,对远志的不同提取物(95%乙醇提取物与水提物)和不同萃取部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、氯仿部位、正丁醇部位、萃取水部位)进行了初步活性筛选。结果:1.本研究通过远志根与叶平行叁次的DGE测序,分别得到了远志根与叶的转录组数据库。远志根与叶中分别得到高质量Reads数目为60,437,865与61,926,272,通过拼接共得到 494,113 条 contigs、298,586 条 transcripts、64,171 条unigene,对前期远志的测序数据进行了补充和完善。2.构建了远志根与叶的DGE数据库,远志根与叶叁次测序平行性较好,远志根与叶中差异表达的Unigene共6943条,占总数的10.88%;根中上调的差异表达基因通过KEGG注释到叁萜皂苷生物合成途径中的分别是PMK、FPPS和β-AS;筛选出参与远志皂苷合成下游途径的共有22个酶基因(17条CYP450s与5条UGTs)。3.基于远志根与叶的DGE数据,采用RT-qPCR法对远志皂苷生物合成途径涉及的22条基因在远志根与叶中的表达水平进行分析,并结合相关性分析进一步筛选出 6 个酶基因,CYP71A1、CYP94A2、CYP714C2、CYP78A9、CYP734A6(CYP734A1)、UGT73C4与远志皂苷生物合成下游途径紧密相关,DGE测序结合RT-qPCR技术可以有效的筛选远志皂苷生物合成途径中的关键酶基因以及发现新基因。4.通过复制并建立hDDC特异抑制剂的筛选模型,对远志的不同提取物和不同萃取部位进行了初步活性筛选,结果发现远志氯仿萃取部位对hDDC表现出一定的抑制作用,提示上述提取物与萃取部位可能具有抗PD的作用,体外hDDC特异抑制剂的筛选模型可以用于后续的高通量活性筛选。结论:CYP71A1、CYP94A2、CYP714C2、CYP78A9、CYP734A6(CYP734A1)和UGT73C4与远志皂苷生物合成下游途径紧密相关,这对远志皂苷生物合成途径的阐明提供了科学依据。此外,通过体外hDDC特异抑制剂的筛选模型得到远志氯仿萃取部位可能具有抗PD的作用,这不仅为上述部位中有效化学成分的分离及结构鉴定奠定了科学基础,也为远志发挥抗PD的药理作用及机制的研究提供了一种新思路。
徐凯成[9]2006年在《利用RNA干扰抑制人肝癌细胞N-ras表达的研究》文中研究指明目的:寻找人肝癌细胞N-ras基因的RNA干涉有效靶点;建立装载靶向N-RAS基因干扰RNA质粒表达载体;利用RNA干扰技术抑制人肝癌细胞Bel-7402细胞株N-ras基因的表达,达到抑制人肝癌细胞细胞增殖、促进其凋亡的目的,为肿瘤基因治疗奠定基础并开拓新思路。方法:利用计算机网络资源及Oligo6.0、Blast Research等生物学软件在N-RAS基因编码区寻找RNAi有效靶点;以体内转录的方法构建Psilencer1.0-U6-siRNA-N-ras质粒;应用真核细胞转染技术转染人肝癌细胞Bel-7402细胞株,以转染带有不相关shRNA结构的载体的Bel-7402细胞为对照排除非特异性抑制作用;通过RT-PCR检测N-ras基因mRNA水平的表达;Western-blot检测N-ras基因蛋白水平的表达;MTT法检测转染后细胞增殖受抑制情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:成功找到RNA干涉的有效序列1个;酶切法证明构建Psilencer1.0-U6-siRNA-N-ras质粒成功;RT-PCR和Western-blot分析表明:Psilencer1.0-U6-siRNA-N-ras-2在mRNA水平和蛋白水平特异性抑制了N-ras基因的表达;MTT结果显示:Psilencerl.0-U6-N-ras-2转染的肝癌细胞与其他叁组比较细胞增殖明显受抑制;流式细胞仪证实转染Psilencerl.0-U6-N-ras-2能诱导肝癌细胞凋亡。结论:RNA干涉是抑制基因表达的有效策略;脂质体介导法可以有效转染Bel-7402细胞,是进行肝癌基因治疗的有效转染方法;Bel-7402细胞是N-ras高表达细胞株;N-ras-2序列(AAGACCAGACAGGGTGTTGAA)是抑制人肝癌细胞株Bel-7402的N-ras基因表达的RNA干涉有效靶点,而N-ras-1(GTGCCATGAGAGACCAATA)序列则不是;利用脂质体介导针对N-ras的短发夹结构RNA可以有效地抑制肝癌细胞中N-ras的表达及肝癌细胞增殖,诱导其凋亡。
刘继梅[10]2016年在《第一部分 内生真菌Periconia sp. F-31次级代谢产物研究 第二部分 Stachybotrys chartarum中杂萜Stachybocin A生物合成研究》文中提出本博士学位论文由两部分构成,第一部分为内生真菌Periconiasp.F-31次级代谢产物研究,第二部分为Stachybotrys chartarum中杂萜Stachybocin A生物合成研究。第一部分:内生真菌Periconia sp.F-31次级代谢产物研究Periconia sp.F-31为从刺果番荔枝(Annona muricata)中分离得到的一株乙酸乙酯提取物具有较强体外细胞毒活性的内生真菌,为黑团孢霉属的一个新种(Periconiasp.)。课题组前期对其次级代谢产物进行了较为系统的研究,已从中分离鉴定了 9/6/5叁元环系细胞松弛素Periconiasins A-H,新颖结构的PKS-NRPS杂合物Pericoannosins A和B及新骨架结构的倍半萜Periconianone A,其中Periconiasins A和B对人结肠癌细胞HCT-8和人胃癌细胞BGC-823均具有较强的细胞毒活性,Periconianone A具有很强的神经抗炎活性。为进一步获得更多结构新颖及活性显着的次级代谢产物,本论文继续对Periconia sp.F-31次级代谢产物进行研究。结合各种色谱技术(硅胶柱色谱、C18柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、MCI柱色谱及正/反相半制备HPLC等)对剩余的Periconia sp.F-31提取物进行分离纯化,采用各种波谱技术(UV、IR、MS、NMR、CD)及X-ray对化合物进行结构鉴定。本研究共分离鉴定了 63个单体化合物,其中27个为新化合物,包括11个高度氧化的艾里莫烷型倍半萜Periconianones C-M(1-11);4个聚酮-氨基酸杂合物 Periconiasins I-L(12-15);4 个异戊烯基化聚酮 PericononesB-E(16-19);4个单萜[2-蒈烯-5,8-二醇(20)、2-蒈烯-8,10-二醇(21)、2-蒈烯-8-乙酰胺(22)、8-羟基-1,7-环氧-2-薄荷烯(23)];2个内酯[5-羟基-4-(1,2-二羟己基)-氧杂环庚二烯-1(6H)-酮(24)和5-羟基-4-(1-羟己基)-氧杂环庚二烯-1(6H)-酮(25)];1个甾醇化合物麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3α-腺嘌呤(26)及1个核黄素衍生物6,7-二甲基-1-(1'-D-核糖醇基)-喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮(27)。化合物Periconianone(1)为首个C-8/C-11连接的异艾里莫烷型倍半萜。在新化合物绝对构型的确定中,除常规ECD光谱手段外,还运用了 Rh2(OCOCF3)4-螯合CD、Mo2(ACO)4-诱导CD、计算ECD以及X-ray单晶衍射等方法,并对新化合物生物合成途径进行合理的推测。此外,对所分离鉴定的27个新化合物进行了体外细胞毒、抗HIV和神经抗炎等药理活性评价,发现化合物 Periconianone E(3)、Periconiasin I(12)和 Periconone E(19)对人乳腺癌细胞MCF-7具有细胞毒活性,IC50值分别为17.9、4.8和4.2μM;化合物Periconianone H(6)对Hela细胞具有中等的细胞毒活性,IC50值为16.5μM;化合物 PericonianoneH(6)、Periconiasin J(13)和 Periconone B(16)均具有一定的抗 HIV 活性,其 IC50值分别为 11.0、25.0 和 18.0 μM;化合物 Periconianone D(2)、G(5)、K(9)、Periconiasin(14)、L(15)、Periconone E(19)对由脂多糖诱导的BV2细胞激活时所分泌的NO具有很强的抑制作用,抑制率分别为10.2%、18.3%、16.1%、50.0%、18.3%和25.8%(阳性对照药,姜黄素抑制率为12.9%),显示出很强的神经保护活性。综上所述,本论文通过对内生真菌Periconia sp.F-31次级代谢产物的系统研究,共分离鉴定63个单体化合物,其中27个为新化合物,多个化合物表现出良好的药理活性。这些结果不仅丰富了内生真菌Periconia sp.F-31次级代谢产物的结构类型,也为后续生物合成研究奠定了基础,同时也为创新药物发现提供了新颖结构的先导化合物。第二部分:Stachybotrys chartarum中杂萜Stachybocin A生物合成研究Stachybocin A为聚酮-异戊二烯混源杂萜二聚体,其分子母核是由两个完全相同的苯基螺环补身烷单聚体分子通过C5烷基链连接而成,具有内皮素受体拮抗、细胞毒、抗HIV活性,还具有很强的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗活性,是一个很有前景的治疗炎症性疼痛的药物先导化合物。然而Stachybocin A天然产量低,化学合成步骤繁琐且反应条件苛刻,导致其作为创新药物分子的深入系统研究受到限制。因此,阐明Stachybocin A生物合成途径将对实现其高效生物合成、解决Stachybocin A的来源问题以及生物合成其结构类似物奠定基础。本论文以Stachybocin A生产菌株黑葡萄穗霉(S.chartarum CGMCC 3.5365)为研究对象,基于基因组挖掘策略,通过基因敲除、突变株代谢产物分离鉴定、蛋白外源表达及催化功能鉴定等技术手段,阐明Stachybocin A生物合成途径。本研究取得的结果为:(1)确定了 Stachybocin A生物合成基因簇;(2)建立了S.chartarum遗传转化体系;(3)通过基因敲除确定了参与Stachybocin A生物合成的4个关键基因,并通过外源表达鉴定了其中两个基因的功能,即:苔藓酸3位异戊烯基转移酶和羧酸还原酶。本研究为Stachybocin A生物合成研究奠定了基础。
参考文献：
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[6]. 棉蚜类异戊二烯通路两个关键酶基因的克隆与功能分析[D]. 张浩. 中国农业大学. 2014
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[9]. 利用RNA干扰抑制人肝癌细胞N-ras表达的研究[D]. 徐凯成. 吉林大学. 2006
[10]. 第一部分 内生真菌Periconia sp. F-31次级代谢产物研究 第二部分 Stachybotrys chartarum中杂萜Stachybocin A生物合成研究[D]. 刘继梅. 北京协和医学院. 2016