湖南省宁远县人民医院 湖南永州 425600
摘要：目的：基于益气活血法研究通脉保心汤对慢性心竭大鼠AngII及I、III型胶原的影响。方法：选取12周龄雄性SD大鼠60只，随机选出15只为假手术组，其余45只造模后随机分为模型组，西药组，中药组。假手术组大鼠冠脉挂线但不结扎，其余组大鼠冠脉结扎，术后给予减食和力竭式游泳。超声检测大鼠左心室射血分数（EF），造模成功后西药组给予卡托普利，中药组给予通脉保心汤，假手术组和模型组均给予同等剂量蒸馏水。用药4周后，放射免疫法检测肾脏组织AngII表达，实时荧光定量PCR法及免疫组化法检测心肌组织I、III型胶原表达。结果：造模结束时，模型组大鼠EF值≤50%,说明造模成功；用药4周后，与模型组比较，中药组及西药组大鼠肾脏AngII表达降低，心肌组织中I、III型胶原表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与西药组比较，中药组大鼠肾脏AngII、心肌组织I、III型胶原数值相近，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：通脉保心汤可下调心衰大鼠肾脏AngII表达，增强心肌组织I、III型蛋白表达，改善心衰大鼠心功能。
关键词：通脉保心；慢性心衰；AngII；I型胶原；III型胶原
The effection of Tongmai Baoxin decoction on AngII, Type I collagen and Type III collagen in Chronic heart failure under the method of invigorating qi and activating blood circulation
[Abstract] Objective: To observe the the effection of Tongmai Baoxin decoction on AngII, type I collagen and type III collagen in rats with Chronic heart failure. Methods: We collected 60 SD rats and 15 SD rats were divided into sham operation group randomly, other rats were divided into model group, western medicine group and Chinese medicine group randomly after modeling. The coronary artery of the sham operation group was not ligated, and the other three groups of rats had the coronary artery ligation, and the four groups of rats were given diet and inexhaustible swimming after the operation. Left ventricular ejection fraction of rats was defected by ultrasonic machine. After the success of the rat model，the western medicine group were given captopril lavage therapy, the Chinese medicine group were treated with Tongmai Baoxin decoction, the sham operation group and model group were given the same dose of distilled water to fill the stomach. After 4 weeks treatment, the AngII level in renal tissue was determined by radioimmunoassay, type I, III collagen levels in heart tissue were determined by real time PCR and Immunohistochemistry. Results: At the end of modeling, EF of model group was ≤50%, indicating that model was successful. After 4 weeks treatment, compared with the model group, the AngII in rat kidney tissues of the western and Chinese medicine groups were significantly lower, with an obvious increase in type I, III collagen levels in heart tissue, the difference was statistically significant (P < 0.01). Compared with western medicine group, the expression level of AngII, type I, III collagen in Chinese medicine group was similar, the difference was not statistically significant (P>0.05). Conclusion: Tongmai Baoxin decoction can reduce the expression of AngII in rat kidney tissues, raise type I, III collagen levels in heart tissue and improve cardiac function of rats.
Key Words: Invigorating qi and activating blood circulation; Chronic heart failure; Angiotensin II; Type I collagen; Type III collagen
慢性心衰是由于心室结构改变而引起左室充盈和心室射血功能降低的临床疾病，是各种心血管疾病的最终归宿和主要死因，是21世纪主要解决难题之一，给社会带来巨大经济负担[1]。慢性心衰主要病理基础是心室重构，而I、III型胶原是构成心肌胶原网支架的主要蛋白，其在心肌内的含量直接决定了心室的形态以及心衰的进展程度[2]。目前有研究显示，AngII可通过干预基质金属蛋白酶（MMP）和转化生长因子β（TGF-β）的表达调控心肌I、III型胶原含量，影响心室重构[3]。中医药对慢性心衰的治疗颇有成效。本实验通过观察通脉保心汤对慢性心衰大鼠模型肾脏组织AngII、心肌组织I、III型胶原表达水平的影响，探讨通脉保心汤治疗慢性心衰机理，为中医治疗慢性心衰提供新思路。
1．材料
1.1动物 SPF级雄性Wister大鼠80只，体重200±20g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。
1.2药物 通脉保心汤，主要成分为：黄芪30g、红参15g、丹参30g、红花12g、益母草30g、苏木10g、茯苓20g、桂枝10g、白术10g、葶苈子12g、麦冬10g，由宁远县中医院药剂中心生产。卡托普利片：25mg*100片，上海旭东海普药业有限公司生产（国药准字H31020564）。
1.3试剂盒与仪器设备
设备：自动组织脱水机（河北慧采科技开发有限公司，型号RL078536KD-TS3D1），切片机（日本日立公司，型号Leica RM2015），摊烤片一体机（德国SLEE医疗有限公司，型号Slidetec WATER/HETA），电热恒温箱（北京市永光明医疗仪器有限公司），PCR仪（美国BIO-RAD公司，型号ABI 9700）等；
试剂：免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），RIPA裂解液（碧云天生物技术公司），RNA提取剂（美国Invitrogen公司），聚合酶链反应试剂盒（日本Takara公司），AngII抗体（英国abcam公司），酒精，苏木素，PBS等。
2方法
2.1慢性心衰大鼠造模
2.1.1造模方法
大鼠适应性喂养1周后，随机选出20只为假手术组，剩余60只进行造模。假手术组大鼠冠脉挂线但不结扎，其余大鼠进行冠脉结扎手术。对手术存活大鼠给予腹腔注射青霉素钠5万单位/天，持续1周，防止伤口感染。术后常规喂养大鼠1周，从第2周开始，饲料减至常规喂养量1/2，同时进行力竭式游泳，每天一次，一共持续4周。造模结束后对大鼠行心脏彩超检查，筛选造模合格的大鼠，并将大鼠随机分为模型组、中药组、西药组。
2.1.2慢性心衰判定标准
造模结束后对大鼠行心脏彩超检查，射血分数≤50%或心脏指数≤180ml/min·kg则属于造模成功[4-5]。本次实验造模结束时，与假手术组比较，模型组大鼠EF降低，且EF值≤50%，说明造模成功（见表1，图1、2）。
2.2分组与药物治疗
假手术组大鼠经术后死亡4只，剩余11只。剩余45只大鼠中，最终造模成功27只，将成模大鼠随机分为模型组、中药组、西药组，数量分别为9、9、9。西药组大鼠给予卡托普利片灌胃，12.5mg/kg·d；中药组大鼠给予通脉补血汤药制剂灌胃，剂量为9.2g/kg·d，假手术组和模型组大鼠每日给予常规等容积蒸馏水灌胃，3ml/次，1次/d；，持续给药4周。
2.3标本采集
用药4周后，麻醉大鼠开胸取心脏组织，开腹取肾脏组织。大鼠肾脏组织放入加有酶抑制剂的匀浆器中，加入生理盐水后匀浆，离心取上清液，加入AngII抗体后检测浓度；每只大鼠心脏处理后分为两份，一份用4%多聚甲醛固定保存，经脱水、包埋、染色等步骤行免疫组化检测（采用Image-Pro plus4.0图像分析软分析结果），另一部分液氮冷冻，经RNA提取、cDNA转录、观察结果等步骤行荧光定量PCR检测（具体按试剂盒说明步骤操作）。
2.4统计方法
应用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析（one-way AONVA）比较，组间比较采用t检验， P<0.05为差异有统计学意义。
3.实验结果
3.1各组大鼠肾脏组织AngII 浓度比较
与假手术组相比，模型组肾脏AngII表达水平明显升高（P＜0.05），说明心衰时RASS系统的激活；与模型组相比，中药组、西药组肾脏AngII表达水平明显降低（P<0.05），补肾活血中药和卡托普利均起到抑制AngII的作用；与西药组相比，中药组血清BNP表达水平变化不显著（P＞0.05）。（见表2）
3.2各组大鼠心肌组织I、III型胶原mRNA表达水平比较
与假手术组相比，模型组心肌组织中I、III型胶原mRNA表达水平明显降低（P<0.05），说明心衰时心肌胶原受到破坏；与模型组相比，中药组、西药组心肌组织中I、III型胶原mRNA表达水平明显升高（P<0.01），在基因表达方面，补肾活血中药和卡托普利可上调I、III型胶原表达。（见表3，图3-6）
3.3各组大鼠心脏组织I、III型胶原免疫组化水平比较
I、III型胶原在心肌组织中免疫组化阳性结果为棕色颗粒，颗粒占比面积越高代表其表达量越高。据图9、10可知，与假手术组相比，模型组心肌组织中I、III型胶原表达水平明显降低（P<0.05）；与模型组相比，中药组、西药组心肌组织中I、III型胶原表达水平明显升高（P<0.05）；与西药组相比，中药组心肌组织中I、III型胶原表达水平变化不显著（P＞0.05）。（见表5，图7、8）
4.讨论
慢性心衰是一种临床常见疾病，其发病率、致死率高，五年生存率与恶性肿瘤相当，是我国亟待解决的医学难题[6]。心室重构是慢性心衰发生发展的基础，心肌结构改变最终导心脏致功能障碍。
心肌结构改变源于细胞外基质的改变。心脏细胞包括实质细胞和间质细胞，间质细胞可合成、分泌细胞外基质[7]。I、III型胶原皆属于细胞外基质，二者约占胶原蛋白总量的91%，在心肌间质构成立体三维网状结构[8]，成为支撑心脏的骨架，维持心脏结构稳定[9]。I、III型胶原在心肌中含量的变化会直接影响心肌重塑，影响心衰进展，而AngII可通过多种机制调控I、III型胶原表达。
AngII是由血管紧张素I转化而来，是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的核心因子。研究显示，AngII可通过转录因子核因子—kb（NF-κB）调控MMPs基因，增强MMPs活性和表达。MMP-1属于MMPs家族，是一种胶原酶，可水解I、III型胶原，破坏胶原结构[10]，胶原含量减少可引起心肌细胞退化，进而细胞内在结构紊乱，心肌纤维抗性降低甚至断裂，导致心室舒张功能减退，影响心功能[11-12]。
慢性心衰属 “水肿”、“喘证”等范畴，其病位在心。关于心衰病机，目前多数学者认为，本病循气虚-血瘀-水停-气阳虚模式演变，整个疾病为本虚标实证，以心气虚为主，血瘀、痰湿、水停为标。疾病初起，患者仅有气虚，以心气虚为主，心气虚不能推动血液，血液瘀滞脉道则形成淤血，淤血日久，血不利则为水，化生水湿，停聚体内，进一步加重病情。依据中医辨证论治原则，应以补气活血利水法治疗心衰。
本次实验旨在探究通脉保心汤对AngII及心肌I、III型胶原的干预，为中医治疗慢性心衰提供新思路。实验显示，通脉保心汤可降低AngII在肾脏中的表达，降低其对I、III胶原的作用。在心肌组织中，通脉保心汤可使心肌中I、III型含量增加，维持了心肌骨架的完整，防止心室重塑，有效治疗慢性心衰。
参考文献：
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注：1.本论文为2014年度湖南省中医药科研计划项目。2.作者：王洪春，男，39岁，硕士研究生，中西医结合内科副主任医师，宁远县人民医院心血管内科科主任。2.课题编号：湘中医药[2014]13号201448
论文作者:王洪春,欧阳德群
论文发表刊物:《总装备部医学学报》2019年第05期
论文发表时间:2019/8/6
标签：胶原论文; 心肌论文; 大鼠论文; 心衰论文; 组织论文; 心室论文; 模型论文; 《总装备部医学学报》2019年第05期论文;