李树盛
深圳赛动生物自动化有限公司
摘要：污染性气体是指人类在生产和生活过程中排出的有毒有害的气体。其严重污染环境和影响人体健康。污染性气体中含有污染物种类很多，其物理和化学性质非常复杂，毒性也不尽相同。污染性气体中有毒有害物质可通过呼吸道和皮肤进入人体后，长期低浓度或短期高浓度接触可造成人体的呼吸、血液、肝脏等系统和器官暂时性和永久性病变，尤其是苯并芘类多环芳烃能使人体直接致癌以引起人类的高度重视。干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞，由于其自我出色的更新和分化潜能，应用广泛且逐步产业化。随着干细胞研究和行业的规范，干细胞培养的的规模也不断扩大。干细胞在培养过程中会产生含有生物废气，在设备灭菌阶段会产生含有过氧化氢气体、甲醛等的废气。含有过氧化氢气体、甲醛等的废气会于对人体的皮肤、眼睛、呼吸系统产生直接性的伤害。因此，研究干细胞培养过程中废气的控制及处理方法，对于保证产品安全、减少环境污染和微生物交叉感染、保护操作人员安全具有极大的意义。本文详细介绍了干细胞培养过程中废气产生的原因，目前主要的处理方法，及我们在干细胞培养过程中废气的控制及处理方法。
关键词：干细胞制备排放气体污染性控制方法
2.干细胞培养过程中产生的废气
干细胞即为起源细胞。干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力（Self-renewing），能够产生高度分化的功能细胞。
干细胞培养过程中能产生含细胞、微生物、过氧化氢、甲醛等危害性气体；干细胞培养是一种无菌操作技术,要求培养环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。可能产生废气的主要阶段有两个：
2.1.细胞培养阶段
干细胞培养的原料有种子细胞、培养基、胰酶、生理盐水等。培养过程中，空气经过高效层流系统净化后进入A级环境的操作仓，流速为0.36-0.54米/秒，操作仓的换气次数是300次/小时。干细胞培养过程中仅产生少量的CO2和氮气，这部分气体跟A级操作仓的空间的气体一起往外排。由于新产生CO2和氮气占A级操作仓中的气体比率过低，所以这部分气体几乎不需要另外处理。这阶段主要产生的是含有细胞及微生物的废气。
2.2.设备灭菌阶段
细胞培养需要在无菌条件下操作，每一批次细胞培养完后，培养的仓体需要灭菌处理，这阶段主要产生的是含有消毒药剂的废气。早前医疗器诫和设备大多使用汽化甲醛消毒、灭菌，但由于甲醛灭菌有以下缺点：
消毒灭菌作用时间长，影响生产。消毒时间12 h，静置4 h，排风8 h，消毒1次最少需要24 h。消毒1次要停产2～5天;
易产生二次污染。如甲醛熏蒸会出现多聚甲醛聚合物（白色粉末），附着在洁净室内的维护结构和设备管道表面上，在消毒后几天内，其悬浮离子数会增加，甲醛聚合物也逐渐解聚成甲醛，对生产操作人员的危害很大;
甲醛有强烈的刺激性气味，消毒灭菌后去除残留气味时间长，对生产操作人员身体有害，有致癌作用。
如果甲醛消毒剂残留如果去除不干净则有可能对产品带来二次污染的风险。由于甲醛灭菌在干细胞培养的场合有致命缺点，所以现在采用了更为安全和高效的过氧化氢(VHP)消毒、灭菌方法。
在每批次细胞培养的间隙，细胞培养操作仓采用经过汽化过氧化氢(VHP)消毒。消毒时候，过氧化氢干雾灭菌法是利用物理手段将液体转变成气溶胶状态的干雾，让其弥散在需要灭菌的空间。过氧化氢在常温下的气体状态比液体状态具有更强的杀孢子能力，经生成游离的氢氧基，用于进攻细胞成分；整个消毒过程仓内的空气中的过氧化氢浓度需要达到200ppm，并保持这个浓度持续50分钟的时间。整个操作仓内消毒完后，部分过氧化氢分解成水和氧气，仓体内的过氧化氢浓度下降到100ppm，这时就产生了含过氧化氢气体的废气了。
3.目前干细胞培养废气的控制方法
干细胞培养过程中和设备灭菌阶段都有废气产生，不同阶段产生的废气成分也不相同，目前有相应的针对性处理方法。
3.1.培养阶段
干细胞培养时，操作的环境是A级洁净区。洁净区内有多种环境监测感应器，包括悬浮粒子、风速、风压、氧气浓度、CO2浓度、H2O2浓度等；因为这部分气体成分跟洁净空气相差不大，所以排放时需要通过HEPA生物滤网，截取PM2.5、细菌和真菌等，就可以排放到大气中。HEPA滤网在使用过程中，需要有紫外线灯照射，实现灭菌目的。HEPA滤网在使用了一段时间后，也需要更换。
3.2.设备灭菌阶段
在设备灭菌时候，需要防止过氧化氢泄露对操作人员产生伤害人，吸入过氧化氢气体会造成眼睛、鼻子及喉咙刺激感；皮肤接触会造成刺痛及暂时性变白，残留会造成红肿及起泡；眼睛接触会造成严重的伤害及有目盲之可能性。为了有效检测过氧化氢是否泄露，这时候需要在设备周围1米范围内安装过氧化氢气体检测传感器，一旦检测到设备周围过氧化氢气体浓度超出安全范围，需要立刻报警，停止灭菌操作，疏散人员，保持室内通风顺畅。
设备灭菌完后，需要引入新的洁净空气，加速仓体内含过氧化氢气体的稀释，把设备舱体的含过氧化氢的气体进行降解处理，然后才能排出到大气，根据降解方式的不同，可以分两种方法：
3.2.1.水淋吸收塔吸收法
过氧化氢降解装置如下，含过氧化氢气体的空气通过水淋塔，排出的气体在塔内从下往上升的过程中，与水接触，由于过氧化氢气体有水溶性，所以气体中的过氧化氢会溶解在水中。溶解在水中过氧化氢经过UV光照射，会自然分解成水和O2，水可以留在水淋塔的槽中，O2直接排放到大气。
这种方法处理会是操作仓的气体在最短的时间内使过氧化氢经降到符合细胞生产的条件，但需要在室外安装水淋吸收塔处理设备。
3.2.2.催化剂过滤器吸收
催化剂过滤器吸收过氧化氢方法是操作仓与催化剂过滤器连通，当含有过氧化氢的气体循环经过催化剂过滤器，这时过氧化氢被分解成氧气和水分，在气体中过氧化氢浓度低到符合细胞培养的条件时，可以直接排放到大气中。
这种方法处理过氧化氢的好处是简单，缺点是过氧化氢的气体循环经过催化剂过滤器降解需要占用一定时间，影响生产效率。
3.2.3.两种过氧化氢气体降解优缺点对比
图10 两种工艺对比图
经过对效率，空间利用率及维护性的对比，催化降解具有比较明显的优势。因此在自动化生产实现中，优先选择催化降解的方式。
4.各舱室之间的气体排放及压力控制
在舱室较多，工作区域大的地方，不同舱室在细胞培养时所产生的气体也有区别，这种不同气体会对其它舱室的气体环境要求形成影响，相对于其他舱室即为污染性气体，因此在细胞培养时必须满足气流稳定性和阻隔交叉污染的要求。
4.1.整体气流均匀形态及稳点性
细胞培养过程中，气流形态及舱室内气压需保持稳定，整体系统设计必须满足每个舱室的气流形态与标准的生物安全柜一致；气流通过层流送入舱室后，均匀的从底部排出，避免气体涡流的形成。均匀稳定的气流形态保证了污染性气体排放的安全及高效。
层流下的风速传感器用于测量每个舱室的的进风量，用于反馈和稳定气流大小，工作平台底部具有均匀的污染性气体排出通道，通道出口对污染性气体进行统一处理。
4.2.防止交叉污染
每个舱室所处的环境不一样，为防止交叉污染的产生，舱室都配备独立的层流系统，各舱室压力监控及单独的出风口流速反馈控制，保证舱室内稳定的气流形态；出风口流量反馈控制确保每个舱室所需压值的稳点性及各舱室之间的压差，A级>B级>C级。
5.污染性气体排放监测
气体排放必须满足大气污染物排放标准，高于排放标准时通过监测控制系统提示警报，形成气体排放的闭环控制，确保系统的密闭性及降解及过滤系统的可靠性。
5.1.细胞培养内部环境及实验室环境检测
细胞培养内部环境及实验室空气污染的实时多点检测，包括CO2、N2、H2O2浓度的检测，细胞及微生物浓度的检测，气体温湿度及压强的监测。实验室的多点检测确保没有浓度梯度。
5.2.消毒处理过后排放的气体检测
灭菌空间内的过氧化氢气体催化降解后排出到大气，为满足污染性气体的排放要求，对出风口的过氧化氢浓度进行监测，直至监测到的过氧化氢浓度低于1 ppm。当浓度高于规定值，系统将进行提示，并控制出风量或对设备检测检修及维护。
6.安全性验证方法
整体的气体控制及排放系统安全性将参考生物安全柜标准。NSF/ANSI49和EN12469是目前最通用的安全认证，这两种标准对系统性能分级、安全性能检测都有详细的说明和要求。这两种安全标准对规范安全柜市场，保护研究人员起到重要的作用。在设计气体排放系统时，除了了解各项性能指标，还可以前期进行相应的测试判断气体排放系统否获得过以上两项最主要安全认证。
以上两种最主要的安全认证中，最重要的是测试保护性能的微生物测试，就是使用细菌芽孢的微生物测试，包括以下四个方面：
a.人员保护：细菌芽孢放置在细胞培养工作区域，它们将不允许从窗口逃逸（包证人员安全，防止对实验室的污染）；
b.产品保护：从细胞培养工作区域外向窗口开口处释放细菌芽孢，通过测试的气体排放系统将可以防止细菌芽孢进入细胞培养工作区域污染试验品（保证细胞培养的安全性）；
c.交叉感染：细菌芽孢在安全柜内从一个位置释放，它们将不允许落到超过20cm的临近区域（防止交叉污染）；
d.大气污染：在舱室中过氧化氢浓度高于260ppm时，对外排出风口的过氧化氢浓度检测值小于1ppm（防止大气污染）；
被测系统在流速为0.36-0.54米/秒，操作仓的换气次数是300次/小时的工作条件下运行10min，对进出料窗口，维护窗口及各舱室设置5各检测计数点，对外大气排放口设置1个检测点和H2O2浓度检测点，在微生物测试后，各检测点的芽孢粒子检测数都需处在于正常的范围，消毒后的过氧化氢检测点的浓度<1ppm。以确定气体排放系统的安全性。
7.日常维护
鉴于气体排放系统危险的使用环境，在安装时以及以后每隔一定时间，要由国家设备质量监督检验中心的专业人员按照规定对每一台生物安全柜的整体运行性能进行性能检测，以检查其是否符合国家及国际的性能标准保证使用者的安全。气体排放系统检测主要包括物理学检测和生物学检测两个方面，根据检测性质可分为首次检测、后续检测。 除气体排放系统的一年一度的常规检测外，下列情况之一时，如安装后、移动后、检修后、更换过滤器后，也必须进行现场气体排放系统检测。
检测到异常，需对整体的污染性气体排放系统其进行升级及维护，更换密封机构，过滤网，催化剂及进行多级过滤等相关措施。
8.结语
目前全自动细胞培养设备内部机构复杂（培养箱，离心机，移液器，机器人，开盖器等子设备及子部件）影响整体的污染性气体的排放及控制。合理的过污染性气体传输及排放方案较为重要。安全稳定的污染性气体排放系统，有利于细胞培养，保证人员安全和防止大气污染。使用多点检测能较全面地对该系统进行验证和评估。经过实际的反复测及试验证，取得了理想的成果。
总之，规范的的污染性气体排放控制、科学有效的控制效果检测和验证将对细胞培全自动培养行业的发展提供更多有利的条件及经验。
参考：YY 0569-2011中华人民共和国医药行业标准《生物安全柜》
GB 16297-1996 大气污染物综合排放标准.过氧化氢．Chemical Book[引用日期2018-12-6]
论文作者:李树盛
论文发表刊物:《中国西部科技》2019年第22期
论文发表时间:2019/11/26
标签：过氧化氢论文; 气体论文; 舱室论文; 性气论文; 干细胞论文; 浓度论文; 废气论文; 《中国西部科技》2019年第22期论文;