（1牡丹江医学院；2牡丹江医学院第二附属医院神经内科；黑龙江牡丹江157000）
摘要：目的:探讨补骨脂异黄酮对Aβ25-35损伤的神经干细胞增殖及线粒体凋亡的影响。方法:取神经干细胞细胞悬液，分为阿尔茨海默病模型组（AD组）、实验组（M组）、空白对照组（S组）。在12,24,48 h采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium MTT)法检测神经干细胞增殖的影响，在24，48,72h用Western blot法检测神经干细胞Bcl-2/Bax比值的变化。结果:MTT法显示，实验组细胞增殖明显高于AD模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组细胞Bcl-2/Bax比值的表达在各时间点均明显高于AD模型组，差异均有统计学意义(P<0. O5 )。结论:补骨脂异黄酮经抗线粒体凋亡途径对Aβ25-35损伤大鼠海马神经干细胞发挥保护作用。
关键词：补骨脂异黄酮; β淀粉样肽;神经干细胞;雌激素受体;阿尔茨海默病
1．材料
1.1大鼠神经干细胞由基础医学研究所免疫室保存。
1. 2仪器与试剂
补骨脂异黄酮由牡丹江学院分析测试中心提供（纯度＞９６％）；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium ) MTT（Ｓｉｇｍａ公司）；β淀粉样肽 (Biosouxee公司);巢蛋自(Nestin)(北京博奥森生物技术有限公司);一抗(中杉金桥); 羊抗兔二抗购自武汉三鹰生物科技有限公司；Bｃｌ－２、Ｂａｘ抗体（ Cell Signaling Technology公司）；酶标计数仪E1X800 (BioTEK公司);凝胶成像系统(Ge1Doe2000型，Bio-Rad公司)。
2．方法
2.1 细胞培养
神经干细胞加入培养液（DMEM/F12 1:1,2%B27，Bfgf 20μg/L,表皮生长因子20μg/L）,放置于37℃,5%CO2培养箱中每7天传代，进行Nestin免疫化学检测，染色阳性细胞为主，证明培养成功。
2.2 实验分组
根据既往实验数据选择加入Aβ25-35 5μmol / L制成阿尔茨海默病神经干细胞模型为模型组（AD组）;加入 Aβ25-35 5 μmol / L 和补骨脂异黄酮0.1μmol / L为实验组（M组）；加入培养液为空白对照组（S组）。
2.3 MTT实验检测
以上分组细胞接种于在96孔板中，在37℃ ,5% CO2条件下培养24和48 h后，每孔加入MTT溶液10 pI,二甲基亚枫150 pI/孔，震荡溶解细胞，酶标仪(Bio-Rad550)测定490 nm波长吸光度，每组复测3次取平均值。计算各组的吸光度数值。
2.4 Western blot法检测Bax和Bcl-2蛋白表达
取各组细胞PBS洗涤，加入细胞裂解液，冰浴20 min,12 000 r/min离心15 min(r=8 cm)，取上清液测定细胞总蛋白。Bradford法测定蛋白浓度。进行凝胶电泳，转膜，5%牛奶室温封闭1h，分别加入兔抗人Bax和Bcl-2抗体，4℃孵育过夜。TBS漂洗3次，加入羊抗兔HRP标记二抗，室温孵育1 h , TBS漂洗，ELL显色后用化学发光仪定量并拍照。
2.6统计学方法
统计学处理采用 SPSS 19.0 统计软件包进行数据处理，P<0.05表示差异有统计学意义。
3.结果
3．１ 补骨脂异黄酮对Aβ损伤神经干细胞增殖保护作用
MTT 法结果显示，在 12、24、48 h时，实验组细胞的吸光度均明显高于 AD 模型组，AD 模型组、实验组细胞的吸光度均明显低于空白对照组，差异均有统计学意义( P ＜ 0. 05) 见表 1。
讨论：
补骨脂异黄酮是一种来自补益中药补骨脂的具有雌激素样活性的代谢组分［1］。本实验结果显示其具有保护Aβ25-35致伤神经干细胞的活性,能减少Aβ25-35引起细胞凋亡,提高细胞生存率。线粒体在细胞凋亡过程中发挥重要作用,补骨脂异黄酮可能通过阻断线粒体凋亡通路发挥神经保护作用［2］。
在这一通路中Bcl-2家族是调节细胞凋亡途径中一组作用相反的蛋白质［3］，主要包括促进凋亡的Bax、Bad、Bid等以及抑制凋亡发生的Bcl-2和Bcl-xl等。抑制凋亡蛋白执行抑制因子的作用,阻止细胞色素的释放。Bcl-2/Bax比值调控着线粒体膜的通透性,对细胞色素C的释放及凋亡下游通路起调控作用。通常情况下Bax位于胞质中，但在死亡刺激下，Bax构象改变，引起跨膜并插入线粒体外膜，使线粒体外膜透化，释放促凋亡蛋白［４］。研究表明，Bcl-2蛋白可保护细胞免受凋亡刺激，对细胞存活起重要作用，Bcl-2的过表达可阻止Bax迁移和活化［５］。Aβ25-35致伤神经干细胞中的Bcl-2/Bax比值下用,Aβ25-35能降低Bcl-2表达，增加Bax的表达，导致Bcl-2/Bax降低，这一变化有一定的时间依赖性。本试验中，处理24 h差异最为显著。补骨脂异黄酮诱导的Bcl-2蛋白的上调大大提高了该比值,Bcl-2具有抗Aβ25-35所致神经细胞损伤的作用,该作用与阻断线粒体凋亡通路有关。
参考文献：
[1]孙秀玉,刘立亚,吴宥熹,黄秀兰. Bcl-2家族对线粒体质量控制的调控研究[J/OL]. 中国药理学通报,2015,31(12):1633-1636.
[2]任玉伟,宿华威. Bcl-2基因家族研究进展[J]. 大连医科大学学报,2015,37(02):202-205.
[3]朱迪娜,王磊,王思彤,张文生. 植物雌激素的研究进展[J]. 中草药,2012,43(07):1422-1429.
[4]朱玉山,卢铁元,王蕊,黄理,马淇,赵丽霞,高平,雷晓波,倪碧云,林家凌,郝小江,陈佺. Bcl-2家族蛋白调控线粒体膜通透性和细胞色素C释放的新机制[J]. 生命科学,2011,23(11):1076-1080
[5]邱蓉丽,李璘,乐巍. 补骨脂的化学成分与药理作用研究进展[J]. 中药材,2010,33(10):1656-1659.
牡丹江医学院ZS201521，黑龙江省教育厅2016-KYYWF-0681，大学生创新创业训练201710229028
论文作者:朱来强1,肖韩艳2通讯作者
论文发表刊物:《医师在线》2017年9月下第18期
论文发表时间:2017/12/6
标签：补骨脂论文; 干细胞论文; 细胞论文; 线粒体论文; 异黄酮论文; 神经论文; 实验组论文; 《医师在线》2017年9月下第18期论文;