（四川省成都市成都大学附属医院肿瘤科 四川 成都 610082）
【摘要】目的：探讨非肌肉肌球蛋白重链(Nonmuscle myosin heavy chain9,MYH9)在肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织中的表达水平及其与临床参数的相关性。方法：采用免疫组织化学方法、Western Blotting检测60例肝癌组织及其癌旁组织中MYH9蛋白表达情况。Western Blotting检测人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2及人正常肝细胞株LO2中的MYH9蛋白表达情况。结果：MYH9蛋白在肝癌组织中的阳性表达率为63.33%（38/60），明显高于癌旁组织中的表达率41.67%（25/60），P＜0.05；MYH9蛋白在肝癌组织中的表达相对量(1.078±0.130)较癌旁组织（0.775±0.111）明显增高，P＜0.05；MYH9蛋白在SMMC-7721及HepG2细胞株中的表达相对量（分别为1.627±0.107、1.317±0.095）均明显高于LO2（0.925±0.060，P＜0.05）。MYH9蛋白表达与患者肿瘤大小、门静脉侵犯、Edmondson分级及TMN分期有关，P＜0.05，而与性别、年龄、AFP及HBsAg无关，P＞0.05。结论 MYH9蛋白在肝癌组织的表达显著高于癌旁组织，可能为肝癌的治疗带来一个新的方向。
【关键词】非肌肉肌球蛋白重链；肝细胞肝癌；NMⅡA
【中图分类号】R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）13-0242-03
Expression and significance of MYH9 in hepatocellular carcinoma
Zheng Meng ying, Zheng Ling, Jiang ning.
【Abstract】Objective To analyze the expression of nonmuscle myosin heavy chain9 (MYH9) in the human hepatocellular carcinoma HCC and its relationship with clinicopathologic features.Methods Immunohistochemistry and Western Blotting were used to analyze the expression of MYH9 protein in 60 cases of HCC tissues and adjacent tissues. Western Blotting were also used to analyze the expression of MYH9 protein in HCC cell lines SMMC-7721,HepG2 and normal liver cell line LO2. The relationship between MYH9 and clinicopathologic features was studied.Results The level of MYH9 protein expression of HCC tissues(63.33%,38/60）was found to be significantly higher than that of adjacent tissues(41.67%,25/60, P＜0.05). The relative amount of MYH9 protein in the HCC tissues (1.078±0.130 ) was significantly higher than that in the adjacent tissues(0.775±0.111, P＜0.05). The relative amount of MYH9 protein in SMMC-7721 and HepG2 (1.627±0.107,1.317±0.095 respectively ) were significantly higher than that in LO2 (0.925±0.060，P＜0.05 ). The expression of MYH9 protein was not correlated with gender,age,AFP and HBsAg(P＞0.05),but it was correlated with tumor size,portal vein invasion,Edmondson grade and T stages(P＜0.05).Conclusion The expression of MYH9 protein in HCC tissues was significantly higher than that in the adjacent tissues,and MYH9 may contribute to a novel therapeutic approach against HCC.
【Key words】 Nonmuscle myosin heavy chain9; Human hepatocellular carcinoma; NMⅡA
我国是世界上肝癌高发的国家，每年新发病例及死亡病例约占全球的50%[1]。现有的治疗方法主要以肝切除及肝移植为主，然而术后肿瘤复发率高，预后不容乐观。MYH9基因编码的非肌肉肌球蛋白重链ⅡA蛋白(即MYH9蛋白)，非肌肉肌球蛋白ⅡA（nonmuscle myosin，NM ⅡA）是由两条220kDa的重链、两条17kDa的必需轻链和两条20kDa的调节轻链组成的六聚体[2][3]。近年来对MYH9基因及蛋白的研究逐年增多，MYH9在细胞迁移、粘附、机体的免疫应答以及肿瘤的侵袭、转移等过程中所发挥的作用成为热点之一。然而，有关MYH9在肝癌中的研究尚少，因此我们将对MHY9在肝癌中的表达情况及其与临床参数的相关性进行探讨，以期为肝癌的治疗提供新的治疗策略。
1.资料与方法
1.1 一般资料
60例取自重庆医科大学附属第一医院肝胆胰外科2012年9月—2013年3月手术切除术后病检结果证实为肝细胞癌及其相应癌旁组织标本（距癌肿边缘＞3cm），所取组织用4%多聚甲醛固定，剩余部分保留于液氮中。患者术前均未行新辅助化疗等治疗。其中男性47例，女性13例；年龄18～79岁，中位年龄57岁；肿瘤直径大于5cm有40例，小于或等于5cm有20例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ级19例，Ⅲ～Ⅳ级41例；Edmondson标本分级：Ⅰ～Ⅱ级26例，Ⅲ～Ⅳ级34例。所选标本用途均进行术前告知，并获得患者或其家属同意。
1.2 主要试剂
兔抗人MYH9多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体、HRP标记羊抗兔二抗（Proteintech公司）；DAB显色试剂盒、SP试剂盒（北京中衫金桥生物技术公司）；BCA试剂盒、ECL发光试剂盒、全蛋白提取试剂（碧云天生物技术公司）；其余实验材料及试剂取自重庆医科大学附属第一医院实验研究中心。
1.3 免疫组化SP法
4%多聚甲醛溶液固定的标本行常规石蜡包埋，制成4μm厚切片。参照免疫组化试剂盒说明操作：切片经二甲苯脱蜡水化后，枸橼酸微波高温修复抗原，3%过氧化氢10min阻断内源性过氧化物酶，血清37℃封闭20min，MYH9抗体（1:50）4℃孵育过夜，二抗孵育后加入辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育20min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水，封片。用PBS代替MYH9抗体作为空白对照。
1.4 Western Blotting法检测
提取肝癌组织、癌旁组织及LO2、SMMC-7721、HepG2三种细胞株的总蛋白。4℃，12000r/min，离心20min，取上清，﹣20℃保存备用。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，按每孔上样量50μg进行SDS-PAGE电泳，恒流冰浴电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2h，一抗孵育4℃过夜（MYH 91:400，GAPD H1:1000），羊抗兔二抗（1:2000）37℃孵育2h，ECL显色，暗室曝光显影，GAPDH为内参，将目标条带与GAPDH条带吸光度值之比为其蛋白表达水平的相对值，实验重复3次。
1.5 统计学方法
采用SPSS 22.0进行统计学分析，所有均数以x-±s表示。临床组织样本之间率的比较采用χ2检验，各项观察指标符合正态分布，组间均值差异比较采用独立样本的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 肝癌组织中MYH9的表达
免疫组化学结果显示，NM ⅡA阳性表达蛋白主要染成浅黄色、黄褐色或棕黄色，主要定位于细胞质（图1）。阳性表达率分别为63.33%（38/60）及41.67%（25/60），差异有统计学意义，P＜0.05。Western Blotting检测结果如图2所示，MYH9在肝癌组织的表达量为(1.078±0.130)，明显高于癌旁组织的相对表达量（0.775±0.111），两组比较差异有统计学意义，P＜0.05。
3.讨论
近年来，MYH9在肿瘤的发生发展等过程中所发挥的作用成为热点之一，MYH9在胃癌[4]、肺癌[5，6]、乳腺癌[7]、脑肿瘤[8，9]、前列腺癌[10]、结肠癌[11]多种肿瘤中的作用均有相关报道。MYH9的功能包括影响细胞粘附延展、趋化和运动等，这些功能均与MYH9影响应力纤维有关[12，13，14]。有研究发现S100A4的C端发生突变可导致其与MYH9的结合力减弱，使转移能力降低[15]。然而MYH9肝癌中的作用尚未有研究。我们推测MYH9可能在肝癌的发生发展中起到了一定的作用，为此我们进行了相关的研究。
结果发现MYH9蛋白在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，P＜0.05。这与Liu等[4]发现NMIIA蛋白在胃癌中高表达及王翠红等[16]发现MYH9蛋白在肺癌中高表达是一致的。该因子不仅在胃癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤中高表达，我们的结果显示在肝癌组织也呈高表达。同时我们发现MYH9蛋白在人肝癌细胞株SMMC-7721及HepG2中的表达相对量（分别为1.627±0.107、1.317±0.095）均明显高于人正常肝细胞株LO2（0.925±0.060，P＜0.05）。这表明MYH9蛋白不仅在肝癌组织，而且在肝癌细胞株中也高表达。进而我们分析了MYH9蛋白与临床参数的相关性，结果显示MYH9蛋白与肝癌肿瘤直径大小、Edmondson分级、TMN分期及是否门静脉侵犯有关，P＜0.05，而与患者的HBsAg、AFP、年龄及性别无直接相关，P＞0.05。结果说明MYH9可能参与了肝癌细胞的增殖与侵袭转移。
综上所述，本研究表明，MYH9蛋白在肝癌病程进展中可能发挥了一定的作用，但MYH9在肝癌发生发展中的具体作用机制有待进一步研究。
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论文作者:郑梦颖,郑玲,蒋宁
论文发表刊物:《医药前沿》2017年5月第13期
论文发表时间:2017/5/22
标签：肝癌论文; 蛋白论文; 组织论文; 细胞株论文; 肿瘤论文; 球蛋白论文; 高于论文; 《医药前沿》2017年5月第13期论文;