毛希琴[1]2002年在《固定化脂质体色谱固定相的制备及其应用》文中指出生物膜色谱是近些年发展起来的一种新的液相色谱模式。作为一种研究生物分子与生物膜相互作用的有力工具，生物膜色谱技术已引起越来越多的关注。固定化脂质体色谱是生物膜色谱的一个重要分支，也是近年来生物色谱领域的一个研究热点。 本文以硅胶作为色谱基质，发展了涂敷法和共价键合法两种固定化脂质体的方法，并以此作为生物膜色谱固定相用于液相色谱研究。同时对这两种方法制备的色谱固定相的稳定性和选择性进行了考察和比较。 药物的小肠表面透皮系数是表征药物活性的重要指标。研究表明，药物在固定化脂质体色谱固定相上的色谱保留值与药物的小肠透皮系数间有很好的线性相关性，因而可以用于药物小肠吸收的预测。同时，研究表明药物在几种pH下色谱保留值的迭加结果可以提高预测的准确性。 药物在固定化脂质体色谱上的保留值可以用于体外模拟药物穿透细胞膜的能力，基于药物与生物膜相互作用的强度进行中药中活性成分的筛选是中药研究的新思路。本文对固定化脂质体色谱固定相在当归活性成分筛选中的应用进行了有益的尝试。同时，将固定化脂质体色谱与固定化载体蛋白色谱联用，对中药川芎中的活性成分进行了分析。由于药物的细胞膜的穿透能力和它与载体蛋白的结合能力对药物的生物活性的表达起着至关重要的作用，因而两种色谱模式联用可以提高体外筛选过程与体内活性表达过程的相关性。 用固定化脂质体色谱固定相还可以进行蛋白与生物膜相互作用的研究。研究表明流动相的pH、离子强度、Ca~(2+)浓度以及固定相表面的电荷数都会对蛋白与生物膜的作用产生影响。
张维农[2]2004年在《天然磷脂的置换色谱分离纯化及其脂质体色谱研究》文中认为天然磷脂具有许多重要的生理作用，是一种保健、药用价值较高的生物活性物质。除此之外，磷脂亦是一种理想的天然表面活性剂，已广泛用于医药、营养及化妆品等领域。这些领域所需均为高纯的磷脂分级产品。尤其是近年来，磷脂形成的脂质体作为药物载体，用于抗肿瘤药物和基因治疗药物的研究和应用不断增多，对于高纯磷脂分级产品的需求量也愈来愈大。由于目前高纯磷脂分级产品的价格高昂，已成为制约磷脂在医药等领域大量应用的瓶颈。高纯磷脂的分离纯化难度大是造成其价格昂贵的主要原因。在磷脂的分级产品中，除卵磷脂能采用相对较简便的柱色谱法制备外，其他种类的磷脂产品均需HPLC法制备。由于传统的HPLC法为淋洗模式，具有样品上样量小、耗用溶剂量大、产物浓度低、峰拖尾严重等特点，因而生产成本高导致价格昂贵。如何降低生产成本一直是人们期待解决的难题，同时也是高纯磷脂能否满足生物、医药学发展需求的关键所在。 本论文针对目前磷脂利用的现状，为降低成本，研究简单淋洗剂体系的柱色谱法和适合于制备分离的高效置换色谱法分离纯化磷脂产品。为促进和拓宽磷脂在医药学领域的应用，进行了锆镁基质脂质体色谱固定相制备及药物与脂质膜相互作用研究。主要研究内容如下： 1．磷脂色谱定性及定量分析方法的建立。TLC法简便、快捷，且能几个样同时展开，是一种高效快速的磷脂定性分析方法。展开剂为氯仿—甲醇—水(65：25：4，V／V)时，在2.5cm×7.5cm硅胶G薄层板上，卵磷脂(PC)、脑磷脂(PE)、肌醇磷脂(PI)、磷脂酸(PA)和丝氨酸磷脂(PS)能完全分离。HPLC法精度高、易于在线检测。在150mm×4.6mm硅胶柱上，采用乙腈—甲醇—85％磷酸(180：3：1，V／V)为流动相，流速为0.5mL／min，上述五种磷脂混合物能获得较好的分离效果。保留时间、峰高重现性及回收率测定结果显示此方法用于五种磷脂的定性和PC、PE及PI的定量测定，具有较高的精确度。 2．溶剂萃取法与柱色谱法相结合从大豆油脚中分离纯化卵磷脂和脑磷脂研究。大豆油脚先经脱水、脱油，再经95％乙醇浸提后粗分为粗卵磷脂和粗脑磷脂，以硅胶为吸附介质，分别进行柱色谱分离。粗卵磷脂为原料用无水甲醇作为洗脱剂等度淋洗，可获得纯度大于90％的卵磷脂产品；粗脑磷脂为原料用氯仿—甲醇(2：1，V／V)～无水甲醇的梯度淋洗模式洗脱，可获得纯度大于75％的脑磷脂产品。 3．首次研究卵磷脂和脑磷脂二元混合物的置换色谱分离纯化技术。利用简便易行的薄层色谱(TLC)方法筛选出二氯甲烷—甲醇(9：1，V／V)和乙醇胺分别作为流 相和置换剂，在巧0恤x4.6Inln硅胶(3一spm微球，自制)分析柱上成功地对 卵磷脂和脑磷脂两元混合物进行了置换色谱分离。考察了置换剂浓度，流动相 流速，进样量及样品组成等因素对置换分离效果的影响。在置换剂浓度为83咖， 流动相流速为0.lmL/min条件下，84mg的两元混合物(PE:陀为l:1 .16)得到 了很好的置换分离，纯脑磷脂和卵磷脂的得率分别高达94.8%和87.9%。同样 是175mg的两元混合物，当其中脑磷脂和卵磷脂的比例由1:1 .16调至1:4时， 纯脑磷脂和卵磷脂的回收率分别由31 .4%和16.9%上升至56.0%和77.6%，因 此最大允许进样量的确定需结合实际被分离样品中的组成情况来进行实验才具 有实用意义。4.首次建立大豆等天然磷脂的置换色谱分离纯化方法。从制备分离的角度出发， 以产率和回收率为衡量分离效率的指标，考察了置换剂浓度、置换剂流速及进 样量等色谱条件对分离效率的影响;并在此基础上设计了正交试验，通过统计 学方法，对色谱条件进行了优化。在最佳条件下，即:置换剂浓度为167耐，置 换剂流速为0.2毗/min，样品浓度为Znmg/ml.(实际进样为Znlng/InLXO.7mL二 148Ing)，获得脑磷脂和卵磷脂产品的纯度、产率和回收率分别为80.2%， 65.7Ing/h，70.9%和90.5%，272.6Ing/h，88.3%。此外，通过对再生效率的考 察，寻找到二氯甲烷一甲醇一乙酸(60:30:10，V/V)为再生剂及合适的再生条件。5.首次采用涂覆法制备错镁基质脂质体色谱固定相，并考察了其基本色谱性能。 与相同方法制备的硅胶基质脂质体色谱固定相相比，在耐受有机改性剂等方面， 此新型固定相较为稳定。溶质在此固定相上的保留以疏水作用为主，此外，静 电作用也有一定的贡献。通过对错镁基质脂质体色谱固定相上溶质的 1。gk，(ZrOZ书脚与硅胶脂质体色谱柱上的logk:(51助以及文献报道的反映药物- 脂质膜间相互作用数据的比较可知，它们之间存在着较好的线性关系。此结果 表明错镁基质脂质体色谱可以用于药物的筛选。由于错镁与硅胶基质的性质不 同且具有很好的互补性，因此两种基质脂质体色谱联合使用进行药物的筛选能 降低漏选率、提高准确性，在成分复杂的天然活性物质如中草药的筛选方面具 有极大的应用潜力。
毛希琴, 邹汉法, 罗权舟, 孔亮, 厉欣[3]2001年在《卵磷脂涂敷生物膜色谱固定相的制备及其稳定性的考察》文中提出将卵磷脂涂敷的硅胶作为生物膜固定相 ,并以此研究了药物与生物膜的相互作用。实验发现 ,卵磷脂涂敷的硅胶固定相的适宜使用温度为 2 0℃～ 30℃ ,而且卵磷脂中合适的胆固醇含量会使制备的生物膜固定相的稳定性有所增加。对药物在这种生物膜色谱固定相上的保留行为的研究表明 ,胆固醇含量、缓冲试剂组成、流动相中盐浓度及pH值等都会影响色谱柱对药物的选择性。卵磷脂涂敷生物膜色谱固定相的制备方法简便 ,通过固定相及流动相的改变可以很方便地模拟人体的生理环境 ,因而可以用于研究药物在体内的吸收和分布状况以及药物的初步筛选。
胡志雄, 张维农, 何海波, 冯钰锜, 达世禄[4]2008年在《锆镁磷脂膜色谱固定相的制备及其在评价药物-膜相互作用中的应用》文中研究表明基于锆基质与磷脂之间强烈的路易斯酸碱作用,制备了锆镁磷脂膜色谱固定相,并使用红外光谱、X射线光电子能谱对该色谱固定相进行了表征;使用与体内环境类似的生理缓冲液体系为流动相,评价了该模拟生物膜色谱固定相预测药物膜渗透性的能力,结果表明药物在锆镁磷脂膜色谱中的保留(logKmbm)与表观渗透率(logPapp)在预测药物的膜渗透性、跨膜吸收等方面具有非常好的相关性,相关系数为0.970,斜率接近1。通过理论推导,引入了直观、方便的热力学指标吉布斯自由能差值(Δ(ΔG°))对药物-膜之间的相互作用强弱进行了评价。
刘红妮[5]2004年在《弱阳离子交换色谱固定相对还原变性溶菌酶的折迭贡献》文中研究说明通过对8种不同种类弱阳离子交换色谱(WCX)填料对还原变性溶菌酶(Lys)复性的考察，选出了配基为3-硝基邻苯二甲酸酐柱为最佳复性的色谱柱，在此基础上，对WCX固定相对还原变性Lys折迭的贡献及其影响复性的各个条件进行研究。 全文包括四个部分： 1．文献综述：蛋白折迭的研究具有重大的理论意义和使用价值，液相色谱法(LC)是近年来发展最快的方法之一。本文仅对LC固定相对蛋白折迭的贡献以及二硫键折迭的研究进展进行了全面地综述。 2．为了减少不可逆吸附，在硅胶表面先键合了一层聚乙二醇(PEG)，以使硅胶表面变成亲水性，然后再对其表面进行化学改性使其成为弱阳离子交换(WCX)介质。亲水性的增强能够减少和避免生物大分子的不可逆吸附，并且可以维持其足够高的生物活性回收率。为了比较PEG对蛋白质复性的影响，本文用键合了不同分子量PEG的PEG200、PEG400、PEG600、PEG1000四种柱子，分别比较了它们对还原变性Lys复性的影响。结果表明从对还原变性Lys复性以及柱子稳定性方面考虑，键合PEG400的柱子效果最好。 3．由于在WCX中，在弱的离子交换剂上配体结构或组成的稍微变化就会对蛋白折迭产生较大的影响。研究了四种不同配基(3-硝基邻苯二甲酸酐、丁二酸酐、邻苯二甲酸酐、苯基丁二酸酐)的弱阳离子交换色谱填料对还原变性的Lys复性效率的影响。结果表明配基为3-硝基邻苯二甲酸酐的WCX柱复性效果最好。指出一个新概念，活性回收率(RB)与质量回收率(RM)之比R_((B／M))，通过实验检验，R_((B／M))可以很好的反映复性条件的好坏。 4．用WCX对还原变性Lys的复性进行了研究。考察了流动相中脲浓度及盐种类对用WCX对Lys复性的影响，结果表明当流动相中含有3.Omol.L一’的脉及l.Omol·L一’硫酸钱时能提高其生物活性回收率。在此wCX柱上，Lys的保留呈现离子交换和疏水双保留机理。发现在硅胶基质的wex柱上，当蛋白浓度为1 5.omg·mL一’到so.omg·mL一’时，用WCX折迭的复性产率均高于用稀释法的复性产率;在蛋白浓度为20.omg’mL一’时活性回收率达到最高，为95.4%。同时还考察了流动相组成、脉浓度、pH值、流速、温度和复性时间等对复性的影响。
周恺[6]2009年在《新型胍基蛋白折迭色谱固定相的合成及其对rhG-CSF的复性纯化研究》文中进行了进一步梳理蛋白质复性技术是生物工程下游的热门技术之一。本实验合成了以精氨酸和肌酸为端基的两种新型胍基蛋白折迭色谱固定相,深入研究了精氨酸型胍基蛋白折迭色谱固定相的色谱性能,并将其应用于含有两对二硫键的重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)的复性纯化研究中。本文主要包括以下4个部分:1文献综述:简要介绍了蛋白质复性的意义及一般过程,详细论述了蛋白折迭液相色谱法,总结了色谱固定相及精氨酸对于蛋白折迭的作用,综述了rhG-CSF复性纯化的研究进展。包括58篇文献。2以硅胶为基质,合成了以精氨酸和肌酸为末端的两种新型胍基蛋白折迭色谱固定相。用5种标准酸性蛋白比较了其色谱分离性能,发现精氨酸型色谱固定相的色谱性能更好。3探讨了在不同pH值,不同流速条件下5种酸性蛋白在精氨酸型胍基色谱固定相上的分离情况;测定蛋白在柱上的质量回收率大于95%;在选用BSA为模型蛋白时测定柱填料的最大吸附量大于46.1mg/g。实验结果表明,该种精氨酸型胍基蛋白折迭色谱固定相具有典型的阴离子交换性质,对标准蛋白具有很好的分离效果,柱容量大,非特异性吸附小。4利用合成的精氨酸型胍基蛋白折迭色谱固定相对在大肠杆菌中表达的rhG-CSF进行了复性纯化,研究了不同的梯度、pH值、脲浓度及流速对rhG-CSF复性的影响。在最优条件下,30分钟内通过一步复性纯化得到了纯度为95.24%,质量回收率为68%的rhG-CSF。损失的rhG-CSF一部分在进样时不保留直接洗脱出来(10%);另一部分沉淀在柱上而无法洗脱,即使在低流速下用0.5mol/L NaCl、8mol/L脲和20mmol/L DTT的强变性剂(4mL)冲洗色谱柱仍然无法很好的将其洗脱下来。
参考文献：
[1]. 固定化脂质体色谱固定相的制备及其应用[D]. 毛希琴. 中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）. 2002
[2]. 天然磷脂的置换色谱分离纯化及其脂质体色谱研究[D]. 张维农. 武汉大学. 2004
[3]. 卵磷脂涂敷生物膜色谱固定相的制备及其稳定性的考察[J]. 毛希琴, 邹汉法, 罗权舟, 孔亮, 厉欣. 色谱. 2001
[4]. 锆镁磷脂膜色谱固定相的制备及其在评价药物-膜相互作用中的应用[J]. 胡志雄, 张维农, 何海波, 冯钰锜, 达世禄. 色谱. 2008
[5]. 弱阳离子交换色谱固定相对还原变性溶菌酶的折迭贡献[D]. 刘红妮. 西北大学. 2004
[6]. 新型胍基蛋白折迭色谱固定相的合成及其对rhG-CSF的复性纯化研究[D]. 周恺. 西北大学. 2009
标签：化学论文; 脂质体论文; 色谱论文; 生物膜论文; 回收率论文; 色谱分离技术论文; 蛋白质纯化论文; 制备色谱论文; 卵磷脂论文; 磷脂论文; 药品论文;