【摘要】目的：建立HPLC-DAD法同时测定葛根汤片中葛根素、甘草酸铵和芍药苷。方法：样品提取后，在Hypersil? GOLD HPLC C18色谱柱上以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱色谱分离；流速1.0ml?min-1；柱温：30℃，进样量10?L；检测波长：250nm（葛根素、甘草酸铵），230nm（芍药苷）。结果：葛根素、甘草酸铵与芍药苷的浓度与峰面积均呈良好的线性关系（r≥0.9994)。平均回收率分别为95.91%～99.73%，RSD 0.78%～1.89%。结论：该方法简便、灵敏、准确、重复性好，可用于葛根汤片的质量控制。
【关键词】葛根素；甘草酸铵；芍药苷；HPLC
【中图分类号】R286.0 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2017）33-0334-02
葛根汤片由葛根、麻黄、白芍、桂枝、甘草、大枣、生姜这七味药组成的中药复方制剂，具有发汗解表、升津舒经的功效，常用于治疗风寒感冒[1]。到目前为止，有HPLC法测单一有效成分含量的相关报道[2-4]，但还没有同时测两种以上有效成分含量的相关报道，为了完善葛根汤制剂质量控制体系，现采用高效液相色谱双波长梯度洗脱法同时测定葛根素、芍药苷和甘草酸铵的含量，以便更好的控制葛根汤片的质量。
1.仪器与试药
1.1 仪器
赛默飞世尔U 3000高效液相色谱仪，ME204E/02型电子天平(梅特勒-托利多)，必能信CPX880H-C型超声波清洗器，Micra-Flex2超纯水机（英国ELGA）。
1.2 试药
葛根素对照品（批号:110752-20154）、甘草酸铵对照品（批号：110731-201418）和芍药苷对照品（批号：110736-201539），均购自中国食品药品检定研究院；葛根汤片（瑞阳制药有限公司，0.4g/片）；甲醇、乙腈（购自Fisher chemical）；所用水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2.方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil? GOLD-C18（250mm×4.6mm，5?m）；流动相：乙腈（A）-0.1％磷酸水溶液(B)梯度洗脱（0～15min，10%～19%A；15～20min，19%A；20～25min，19%～25%A；25～40min，25%～70%A；40～50min，70%～90%A；50～60min，90%～10%A）；流速：1.0mL?min-1；测定波长230nm（芍药苷），250nm（葛根素、甘草酸铵）；柱温：30℃；进样量：10?L。
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2.2 溶液的制备
2.2.1对照品储备液 精密称取对照品葛根素、甘草酸铵和芍药苷各约15mg，分别置于25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得各自的储备液。
2.2.2对照品溶液的制备 分别精密量取上述葛根素及芍药苷对照品储备液各5mL和甘草酸铵对照品储备液10mL置于同一50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(每1mL中含葛根素55.54?g，甘草酸铵135.18?g，芍药苷68.06?g)。
2.2.3供试品溶液的制备 取供试品葛根汤片20片，精密称定，研细混匀，精密称取约0.5g的粉末，置于50mL量瓶中，加甲醇约40mL，密塞，超声处理（功率280W，频率40kHz）30min，取出放冷，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取续滤液5 mL，置于50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
2.3 系统适应性考察
分别取混合对照品溶液、葛根汤片剂及空白试剂，按照2.1项下色谱条件进样分析。各峰在相应保留时间内无杂峰干扰，专属性良好。
2.4 线性关系考察
分别精密吸取混合对照品溶液0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00mL，分别置于25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度对照品混合溶液。按照“2.1”项下色谱条件分别进样10?L，以峰面积Y对对照品浓度X进行线性拟合，得回归方程：Y葛根素=0.5392X-0.1135r=0.9995（0.5554～22.216?g/mL）；Y甘草酸铵=0.1466X-0.0590r=0.9999（1.3518～54.072?g/mL）；Y芍药苷=0.2185X+0.0245r=0.9994（0.6806～27.224?g/mL）。结果表明，三种成分浓度与峰面积在相应浓度范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度和重复性试验
按照“2.1”项下色谱条件，取2.4项下的同一溶液，重复进样6次，测得葛根素、甘草酸铵和芍药苷保留时间的RSD分别为0.13%，0.01%；0.10%；峰面积的RSD分别为：1.16％，0.74％、1.45％（n=6）。表明仪器精密度良好。取同一样品6份，分别测定葛根素、甘草酸铵和芍药苷含量，RSD分别为0.97%，1.39%，1.15%。
2.6 加样回收率试验
称取已知含量的葛根汤片（0.1g）供试品6份，分别精密加入2.2.1项下对照品储备液各1.00mL，按“2.2.3”项下的供试品溶液方法制备，按“2.1”项色谱条件进样分析。计算各成分平均回收率和RSD，考察方法准确度。结果平均加样回收率在95.91%～99.73%，RSD 0.78%～1.89%，表明方法准确度良好。
2.7 样品含量测定
取样品6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，按照外标法计算含量。结果：葛根素为15.36mg/g，甘草酸铵为2.54mg/g，芍药苷为7.56mg/g。
3.讨论
3.1 样品提取方法的选择
用C18过柱会影响组分的量，使得结果偏低，而且对除杂的作用也不明显，所以选择直接超声提取供试品后稀释测定，方法简便，梯度洗脱效果良好。
3.2 流动相的选择
本文采用乙腈-0.05％磷酸水溶液，乙腈-0.1％磷酸溶液2种流动相，结果发现，采用乙腈-0.05％磷酸水溶液为流动相时，甘草酸铵不能良好分离，采用乙腈-0.1％磷酸溶液时，三种组分都能很好分开，三组分峰形对称且分离度良好。故最终选用乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相。
3.3 检测波长的选择
取上述3个对照品，在200～400nm范围内进行扫描，结果葛根素与甘草酸铵在250nm波长处有最大吸收，芍药苷在230nm波长处最大吸收。故选择在250nm 测定葛根素与甘草酸铵，在230nm测定芍药苷。
4.结语
为了更好地控制本制剂的质量，本研究采用超声提取样品，HPLC-DAD梯度洗脱法同时测定葛根汤制剂中的3种成分（葛根素、甘草酸铵和芍药苷）的含量，可以为葛根汤制剂建立简单、快捷、准确的定量分析方法，为全面控制该药品提供科学依据。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.6：1579-1581.
[2]赵昌军，刘宏明.HPLC测定葛根汤颗粒中葛根素的含量[J].食品与药品，2010：330-332.
[3]宋丽军，谭晓梅，罗佳波.HPLC法同时测定甘草中甘草苷、甘草酸、甘草次酸含量[J].中药材，2009.32(3)：378-379.
[4]齐广才，吴江瑞，崔生飞，刘珍叶，杨晓军.固相萃取-高效液相色谱法测定泻痢固肠片中芍药苷、甘草苷、橙皮苷的含量[J].中南药学，2016.14（4）：418-421.
论文作者:陈睿彦,何玲
论文发表刊物:《医药前沿》2017年11月第33期
论文发表时间:2018/1/4
标签：葛根论文; 芍药论文; 溶液论文; 甘草酸论文; 色谱论文; 葛根素论文; 含量论文; 《医药前沿》2017年11月第33期论文;