陈健, 陈敏, 周长保, 陈彬, 李渝萍[1]2001年在《人雌激素受体相关受体1(hERR1)与乳腺癌关系的初步实验研究》文中研究指明乳腺癌是妇女恶性肿瘤中发病率最高的一种.雌激素和雌激素受体(ER)在乳腺癌的发生、发展中具有 重要作用.孤儿受体雌激素受体相关受体1(hERR1)是核受体超家族中的一员,它是以雌激素受体(ER)的DNA结合域(DBD)为探针,应用低严谨杂交技术筛选cDNA文库而得.核苷酸及蛋白质序列比较分析表明,hERR1与雌激素受体ER有很高的同源性,因而可能作用于相同或相似的靶基因.hERR1还可通过与
陈健[2]2001年在《人雌激素受体相关受体1（hERR1）与乳腺癌关系的初步实验研究》文中指出乳腺癌是妇女恶性肿瘤中发病率最高的一种。雌激素和雌激素受体 （ER）在乳腺癌的发生、发展中具有重要作用。孤儿受体雌激素受体相关受体1(hERR1）是核受体超家族中的一员，它是以雌激素受体（ER）的DND结合域（DBD）为探针，应用低严谨杂交技术筛选cDNA文库而得。核甘酸及蛋白质序列比较分析表明，hERR1与雌激素受体ER有很高的同源性，因而可能作用于相同或相似的靶基因。hERR1还可通过与ER竞争结DNA或以蛋白－蛋白的方式与ER直接相互作用，借此调节许多基因的表达调控。hERR1表达广泛，胚胎期乳腺组织有较高水平hERR1表达，成年体内hERR1 表达于正常及癌变的乳腺组织且癌组织表达量高于正常组织。hERR1可能是继ERα和ERβ外，又一与乳腺癌细胞增生密切相关的重要因素。 为验证这一假设，（1）首先收集了叁十余例乳腺癌患者的临床标本，应用RT-PCR的方法，研究了癌组织及其相应的正常乳腺组织中hERR1的表达情况。（2）采用瞬时转染和CAT活性分析的方法，进一步研究了过表达hERR1与芳香族化酶基因表达调节的关系。芳香族化酶是雌激素体内合成的关键酶，其局部合成与乳腺癌的发生、维持密切相关。（3）构建了一个稳定高表达 hERR1的ER阳性的乳腺癌细胞株。（4）用MTT法，研究了 hERR1高表达细胞株与普通MCF-7细胞生长速率的差异。（5）用瞬时转染的方法，研究局部高水平 hERR1存在下,ER对雌激素效应元件ERE引导下的报告基因活性的影响。 结果：（1）对被检的大部分标本而言，hERR1在癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织（16/26例）。（2）瞬时转染结果表明，hERR1以剂量依赖方式促进芳香族化酶启动子 1．3活性。u）真核表达质粒 PH 6呗eo七 构建正确，转染细胞的hERRI的mRNA和蛋自质水平明显高于空载体转染的普通MCFJ细胞。（4）初步的MTT实验表明，hERRI转染细胞生长速率略慢于普通MCFj细胞。u）转染实验表明，以hERRI、ER表达质粒和报告基因共转染细胞的CAT活性低于仅以ER表达质粒和报告基因共转染的细胞。 结论：乳腺癌组织较正常乳腺组织hERRI表达水平高；hERRI能促进芳香族化酶基因启动子1．3活性，可能与乳腺癌有关；成功构建了hERRI稳定高表达细胞株，为进一步研究hERRI的生物学功能打下良好的基础；初步实验表明局部高表达的hERRI能与ER竞争结合靶基因启动子区的ERE，从而下调靶基因对雌激素的反应性。这可能是转染细胞生长速率略慢于普通细胞的机制之一。有关hERRI在乳腺癌发生、发展中的确切作用，还需更多实验资料的积累。
陈健[3]2004年在《RBP4作为核受体辅活化子新功能的研究》文中研究说明真核生物基因表达调控涉及顺式作用元件与反式作用因子、反式作用因子与反式作用因子之间极其复杂的相互作用。核受体超家族属于反式作用因子，是一类配体依赖性转录因子，其成员广泛介导了真核生物与生长、发育和内环境稳定相关基因的表达。目前，核受体调节基因表达的机制正处于广泛的研究中。许多研究表明，核受体在调节靶基因表达时会与一系列有效转录所必需的辅调节蛋白(coregulator)发生相互作用，这类辅调节蛋白主要包括辅活化子(coactivator)和辅阻遏子(corepressor)，核受体通过辅活化子／辅阻遏子与基础转录机器联系在一起，调节不同靶基因的启动子、配体或细胞类型特异性的表达。迄今已分离鉴定出大量的核受体辅活化子，如RIP140、CBP／P300、SRC／p160家族、CARM-1、TRAP／DRIP等，包括最近发现的SRA(一种有辅活化子功能的RNA)。大多数辅活化子结构上均含有与核受体有效相互作用所必须的重复LXXLL模体(NR盒)，它们对核受体转录功能的调节是一个复杂的多步过程，还涉及了核受体结合DNA时对核受体的酶学修饰。 人雌激素受体相关受体1(human estrogen receptor-related receptorl，hERR1)是核受体超家族中的成员，是最早被克隆的孤儿受体之一，与雌激素受体(estrogen receptor，ER)有很高的同源性，广泛表达于体内各种组织，在骨骼发育与形成、脂肪代谢中有重要作用。hERR1的效应元件(hERR1 response element,ERRE)与ERE(ER response element)和SFRE(steroidogenic factor 1 response element)有很高同源性，因而hERR1与ER和SF1的靶基因也有很多交叉和重迭。许多研究发现，hERR1可通过与ER竞争结合DNA，或与ER直接相互作用，影响ER的转录调控功能。hERR1在调节基因表达过程中，还涉及hERR1与TFⅡB及许多辅活化子如ACTR、GRIP1、SRC-1、PNRC等的相互作用。我们的研究发现，hERR1表达于正常及癌变的乳腺组织，并且在癌组织中的表达量明显高于正常乳腺组织，提示hERR1与乳腺癌密切相关。本研究是在上述工作基础上的深入，主要的研究目标和结果如下： 1．采用酵母双杂交技术筛选了人乳腺组织cDNA表达文库中的hERR1的相互作用蛋白质并对结果进行了序列分析和鉴定。 为深入了解hERR1在乳腺癌发生、发展中可能的作用机理，我们采用酵母双杂交第叁军医大学博士学位论文结合滤膜影印分析，筛选了人乳腺组织cDNA表达文库，以寻找乳腺组织中能与hERRI发生相互作用的蛋白质;采用酵母双杂交分析结合液相p一半乳糖昔酶活性测定，进一步明确了这种相互作用，并通过测序和序列比对分析，确定了所获得的蛋白质的种类。结果发现:1) hERRI可与多种核受体辅活化子(SRC一1、班P14O、们灯P一l)发生相互作用;2)首次筛选到多个能与hERRI相互作用的蛋白质，其中包括RBP4( retinol bindingpfotein)。 2.检测了RBP4与多种核受体间的相互作用及其对核受体AF一(activation function2)结构域的依赖性。 为进一步明确RBP4与hERRI之间的相互作用，并深入探讨这种相互作用的普遍性，我们采用酵母双杂交技术检测了RBP4与hERRI及其它多种核受体间的相互作用，并分析了这种相互作用对核受体特异性配体及AF一2结构域的依赖性。结果发现:1)在酵母细胞中，RBP4能以配体依赖性或非依赖性方式，与包括hERRI和hER在内的多种核受体发生相互作用:2) RBP4与核受体hER和孤儿核受体mERR3的相互作用，有赖于核受体AF一2结构域的完整性。以上实验结果提示，RBP4可能是一个新的功能有待鉴定的核受体转录激活功能的调节因子。 3.研究了RBP4对hER和hERRI转录激活功能的调节作用。 为了解RBP4的转录调节功能，我们采用瞬时转染结合荧光素酶活性分析的方法，研究了RBP4对hER和hERRI转录激活功能的影响。结果发现:l)在HeLa细胞中，RBP4能以浓度依赖和配体非依赖方式，显着增强hERRI的转录激活功能;2)在HeLa细胞中，RBP4能与hER相互作用，且在一定浓度范围内以浓度依赖和配体依赖方式，显着增强hER的转录激活功能。 4.对RBP4与hERRI相互作用的位点进行了初步鉴定。 综合酵母双杂交及瞬时转染的实验结果，我们初步认为，RBP4是一个核受体辅活化子。为探讨RBP4与hERRI相互作用的分子机理及其在hERRI基因表达调控中的作用，我们采用缺失突变和酵母双杂交分析等方法，初步探讨了RBP4与hERRI的相互作用位点。结果发现:1) RBP4的aa19一108是其与hERR.1发生相互作用的主要部位;2)RBP4的aa1Og一199不是RBP4与hERRI相互作用的主要部位，但位于该部分的一些氨基酸残基可能参与了这二者之间的相互作用;3) RBP4的aa133一199未见能与hERRI发生相互作用，而位于RBP4N一末端的信号肤序列(aal一18)，可能干扰RBP4与hERRI的相互作用。 以上研究结果表明:1) hERRI转录调节功能的发挥，有赖于多种蛋白因子包括核受体辅活化子及其它一些功能有待进一步明确的蛋白质的参与;2) RBP4是被筛选到的hERRI相互作用蛋白之一，可能参与了对hERRI转录激活功能的调节过程;3)RBP4第叁军医大学博士学位论文能以配体依赖性、AF一2依赖性方式，与被检测的绝大多数核受体?
李渝萍[4]2004年在《肌钙蛋白I2作为核受体辅活化子的鉴定》文中进行了进一步梳理核受体，又叫核受体超家族(nuclear receptor superfamily)属于配体活化的转录因子，广泛参与了包括胚胎发育、细胞分化和内环境稳定等生理过程。大多数核受体具有相似的结构，其C端含保守的具有重要功能的配体结合结构域(ligand bindingdomain，LBD)，在这一部位还含有配体依赖的激活功能结构域AF-2(activation function2)，在介导受体的二聚化、核定位、与辅活化子的结合方面起着重要的作用。核受体辅活化子(coactivator)是目前核受体研究的热点和重点，它作为核受体和基础转录复合物间的桥梁分子发挥作用并调谐了核受体的转录激活功能。人雌激素受体相关受体α_1(human estrogen receptor-related receptor α 1，hERR α 1)是核受体超家族中的孤儿受体(orphan receptor)成员，目前包括我们在内的多家实验室根据自身的研究成果都推测ERR α 1是一种新发现的与乳腺癌有密切关系的核受体，但目前对其具体的调控机理尚未弄清。 为进一步深入研究“孤儿”受体ERR α 1与乳腺癌的关系，弄清ERR α 1参与基因表达调控的详细机理特别是核受体辅活化子在其中的作用，我们进行了如下的研究： 1、利用基于酵母Ga14转录因子的双杂交系统，以ERR α1的LBD为“诱饵”筛选了人乳腺组织cDNA文库。快速骨骼肌型肌钙蛋白I(fast skeletal muscletroponin I，troponin 12，TNNI2)与包括SRC-1在内的一些已知辅活化子蛋白质一起被筛选出来。 2、应用酵母双杂交技术研究TNNI2与多种核受体的相互作用。结果表明，TNNI2与PR、TR和RXR等多种核受体存在配体依赖的相互作用；与mERR α和hERRα 1等“孤儿”核受体的相互作用为配体非依赖，其中TNNI2与hERRα 1的相互作用最强。并且，TNNI2与核受体的相互作用依赖于核受体AF-2功能性结构域的完整性。 3、在哺乳细胞瞬时共转染实验中，TNNI2显示了对核受体ER、ERRα 1、SF1和ARP1反式激活功能的辅助活化作用，但单独的TNN2并不显着改变虫荧光素酶(1uciferase)报告基因的转录效率。这些结果证实了TNNI2具有核受体辅活化子的功能。第叁军医大学博士学位论文 4.研究体外蛋白质相互作用的GST捕获实验也证实了TNN12与ERR Ql的直接相 互作用。 5.在证实了TNNIZ与核受体存在相互作用并能辅助活化核受体的反式激活作用的 情况下，我们进一步采用缺失突变技术，利用酵母双杂交实验证明了TNN12与 核受体的相互作用定位于TNN12蛋白的1一128氨基酸残基，这一区域包括TNN12 的氨基末端、抑制区和LXXLL模体(motif)即NR盒。哺乳细胞瞬时共转染 实验也证实，TNN121一128缺失突变体能够通过与野生型TNN12竞争核受体的结 合，显示其作为TNN12负显性抑制剂的功能。这一结果进一步证实1一128氨基 酸区域确实是TNN12的核受体结合结构域。 以上的研究充分证明了TNN12与许多其它辅活化子一样，以配体依赖(对类固醇激素受体而言)或非依赖(对孤儿受体而言)的方式与核受体功能性AF一2结构域相互作用，并增强多种核受体介导的转录作用，TNNIZ与核受体的相互作用定位于TNN12蛋白1一128氨基酸。本研究证实，TNNIZ是一种新的通用核受体辅活化子。 我们通过一系列研究首次揭示了INN12除介导和调节脊椎动物横纹肌收缩及参与抑制新血管的形成外，尚存在作为核受体辅活化子参与基因表达调控的新功能。这项研究发掘了INNIZ新的生物学功能，有助于我们对TNN12生物学功能的全面认识，并加深了人们对核受体包括ERR Ql基因表达调控机制的认识。
参考文献：
[1]. 人雌激素受体相关受体1(hERR1)与乳腺癌关系的初步实验研究[C]. 陈健, 陈敏, 周长保, 陈彬, 李渝萍. 中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集. 2001
[2]. 人雌激素受体相关受体1（hERR1）与乳腺癌关系的初步实验研究[D]. 陈健. 第叁军医大学. 2001
[3]. RBP4作为核受体辅活化子新功能的研究[D]. 陈健. 第叁军医大学. 2004
[4]. 肌钙蛋白I2作为核受体辅活化子的鉴定[D]. 李渝萍. 第叁军医大学. 2004