李裕强[1]2001年在《绵羊-牛种间体细胞核移植研究》文中研究指明种间细胞核移植的研究可以揭示不同动物之间细胞核质互作的特征和规律，在实践上可以使珍稀濒危动物的快速繁育变得可行。本试验在建立了牛卵母细胞去核、激活及细胞核直接注射法构建牛核移植胚胎等方法的基础上，以供核细胞的处理为重点研究了绵羊皮肤成纤维细胞和牛卵母细胞之间细胞核移植胚胎的早期发育，结果表明：1．组织块贴附培养可以获得良好的原代绵羊皮肤成纤维细胞。发现大卵泡液以20％添加进M199培 养液，可完全取代FBS用于细胞培养，而且细胞贴附和增值效果更好。发现培养细胞的接触抑制 只是一种相对的现象，在保持培养液新鲜的情况下长期培养细胞，会出现复层生长；复层生长的 细胞不展开变形，而是相互集结成团；冷冻保存后复层生长的细胞相互集结成团的特性似乎失去， 呈分散单细胞附着于底层细胞上。复层生长的细胞接种后仍可进行良好的生长增殖。室温条件下 （20-22℃）振荡消化5min，收集脱落悬浮的细胞用于接种传代，可以明显提高细胞的存活率和增 殖能力，是收取供核细胞的适宜方法。冷冻保存的细胞解冻后平衡两次，每次30min或一次平衡 10h可显着提高细胞接种后的贴壁能力。M199培养液添加ITS，可支持细胞缓慢增殖，但不支持 细胞贴壁，配合添加BSA可以提高培养液支持细胞贴壁和增殖能力，但达不到10％FBS的效果。2．当地屠宰场采集的牛卵巢，平均可采集7枚左右的卵丘卵母细胞复合体（COC），其中可用于成熟 培养的不足5枚；只有那些外周卵丘细胞包裹致密、卵母细胞胞质均一的卵母细胞（A、B级）才 能获得较好的成熟率和胚胎发育率。采集COC中，A、B级所占的比率越高，该批A、B级卵母 细胞的成熟率和发育能力也越高。自制发情牛血清（ECS）代替FBS和激素培养牛卵母细胞，卵 丘的扩散情况较差，卵母细胞的成熟率没有显着差异，但成熟卵母细胞的孤雌发育能力显着下降。 不管是成熟率还是孤雌发育率，mBECMaa+BSA难以取得与M199相同的效果，添加胰岛素可提 高mBECMaa+BSA成熟培养牛卵母细胞的质量。在血清存在的情况下，胰岛素添加进M199液培 养牛卵母细胞，对卵母细胞成熟率和成熟质量没有显着影响。CHX可对卵母细胞的成熟可逆性抑 制，但延迟成熟培养不能提高成熟率和发育率。3．Ionomycin+6DMAP或乙醇+6DMAP/CHX激活牛卵母细胞的效率明显高于单独使用Ionomycin或 乙醇；Ionomycin+6DMAP比乙醇+6DMAP/CHX激活的牛孤雌胚发育更为稳定，主要表现为8/16 细胞胚到囊胚的发育率明显升高。4．随着成熟培养时间的延长，牛卵母细胞第一极体与染色质的相对距离拉大，牛卵母细胞的去核在 成熟培养20h进行效果较好，此时有超过60％的卵中极体与染色质相连。牛卵母细胞末期去核的 成功率远大于中期去核，二者核移植胚的发育能力基本相同。牛卵母细胞在不含细胞松弛素B的 操作液中可以进行去核，但加入细胞松弛素B能明显保护核移植胚的发育能力，这种保护主要表 现在8/16细胞胚前的发育。5．牛皮肤成纤维细胞是否进行G1/G0期同期化处理对核移植胚发育的影响不大。细胞核注射前，对 供体细胞作低渗处理能明显提高注射成功率和核移植胚的发育能力。发现供体细胞悬浮饥饿处理3 绵羊－牛种间体细胞核移植研究 天后，无需再作低渗处理即可用于注射操作，核移植胚的发育能力也有所提高，囊胚率为 15刀％。 牛体细胞核移植胚在细胞核注射前激活，还是在细胞核注射完成后激活，对其早期发育的影响不 大。 6．发现复层生长的绵羊皮肤成纤维细胞与牛卵母细胞所构建种间核移植胚的早期发育能力与贴壁生 长的细胞作供体基本相同，囊胚率分别为 10．7％、9．8％；发现绵羊皮肤成纤维细胞经含牛卵泡液 的培养液培养后，能明显提高种间核移植胚的发育能力，囊胚率 12．2％；发现牛卵母细胞内培养 增殖的绵羊皮肤成纤维细胞的种间核移植胚发育能力也明显提高，可取得 13I％的囊胚发育率。 7．还原性谷眺甘肽能明显提高 mSOFaa支持牛孤雌胚发育的能力，其效果明显优于 MI 99，也比 mBECMaa更稳定。发现FGF4也能促进牛胚胎的发育。无血清mSOFaa中加入胰岛素或FGF4能 明显提高牛核移植胚的发育能力。对mSOFaa修正后组成两组培养液ECM！、ECMZ，分步培养牛 核移植胚，可明显提高牛核移植胚的体外发育率。 8．发现卵母细胞和绵羊皮肤细胞经适宜的处理后，多枚体细胞注射进牛卵母细胞可以分裂增殖。 结论：绵羊．牛种间体细胞核移植胚在体外可以发育到囊胚；绵羊皮肤细胞用含牛卵泡液的培养液培养 或经牛卵母细胞内培养增殖后，对种间核移植胚的发育有促进作用：悬浮饥饿是卵胞质内注射用 供体细胞的适宜处理方法：＊＊MI厄＊＊2分步培养能更好的促进牛胚胎的体外发育；在适当的卵 母细胞和体细胞处理前提
杨贵忠[2]2002年在《大鼠—小鼠和大鼠—牛种间体细胞核移植研究》文中提出本研究运用体细胞核移植的原理和技术，以成年大鼠的成纤维细胞为供体，去核小鼠和牛成熟卵母细胞为受体，构建种间核移植重组胚胎，研究种间体细胞核移植胚胎的构建方法和重组胚胎的体内外发育潜能及其影响因素。并重点讨论影响种间核移植重组胚胎发育的主要因素。主要内容和结果如下： (一) SD大鼠成纤维细胞系的建立 将单细胞显微法改进为单细胞集落克隆纯化，能快速、有效建立细胞系，并可获得92.71％克隆率。 (二) SD大鼠成纤维细胞的同步化处理和核型分析 利用流式细胞仪检测可知，经血清饥饿法同步处理的大鼠成纤维细胞，G_0+G_1期细胞百分比提高到74.5±4.4％；而用nocodazole法能使45.9±5.21％的细胞同步于G_2／M期，两种方法均显着(P<0.05)。核型分析显示大鼠原代和传代成纤维细胞染色体数目(2n=42)和形态一致。 (叁) 大鼠-小鼠种间体细胞核移植研究主要结果 1．直接注射法和融合法构建的重组胚桑椹胚发育率分别可达9.84％、9.48％。1500～M800V／cm,30ms脉冲条件可使70％以上的重构胚融合，低场强、大脉冲(1000V／cm,100～200ms)也能使60.0～78.24％的重构胚胎融合。 2．改良CZB培养基能更好地支持重组胚的发育，桑椹胚发育率可达10.93％。 3．未经处理、血清饥饿3-5d、10±5μg／ml nocodazole处理的大鼠成纤 第四军医大学硕士学位论文 雏细胞做供体构建重组胚胎，分别得到 4．14％、6．45％、2．94％的囊肚发育率。 4．研究发现 10土5 u g／ml的 CCB有利于去核（去核率为 88．23％L 6－DMAP＋乙醇＋CCB能有效地激活种间核移植重构胚。 5．将255枚2－细胞以上的核移植重构肚，移植给46只SD假孕鼠，均未 妊娠。 （四）大鼠－牛种间体细胞核移植研究的主要结果 牛卵母细胞在含8－10％发情牛血清（OCS）的成熟培养基培养22－24h，能 使60．86％－61．41％的卵母细胞达到成熟：在1500－1800V／cm，30－40sin条件下， 大鼠－牛核移植重构胚能达到 50厂0－55．08％融合率：血请饥饿法和 nocodazole 法处理的供体细胞构建的重组胚胎，经6－DMAP＋乙醇＋CCB激活，分别获得 17．33O和 17．02O的卵裂率以及6．60O和8．50o的桑堪胚发育；重组胚胎在 MI 99和改良的 CZB中培养，分别获得 16．41O和 17．41o的卵裂率以及 7．46o 和 6．7 4O的囊胚率。 结论：本研究在国内首次进行大鼠－小鼠和大鼠－牛种问体细胞核移植探 索，初步建立种间体细胞核移植重组胚的构建方法，并获得发育至桑堪胚的大 鼠－小鼠和大鼠－牛胚胎，但没有得到囊胚。重组肚移植给受体动物均未妊娠。 说明小鼠和牛的去核成熟卵母细胞质能支持大鼠成纤维细胞进行发育程序重 编，但不能维持重组胚胎的囊胚发育和妊娠。此外，重组胚胎的构建、卵母细 胞的质量、供体细胞的预处理、激活方法、培养体系等回素都影响异种核移植 胚胎的发育。
赛务加甫[3]2007年在《提高绵羊体细胞核移植效率的研究》文中研究指明本研究对绵羊卵母细胞体外成熟、卵母细胞冷冻保存、卵母细胞孤雌激活、绵羊同种和异种体细胞核移植及重构胚胎体外培养等关键技术进行了试验分析,以期提高绵羊体细胞核移植的效率,建立完善的核移植技术体系,为进一步获得体细胞克隆绵羊和异种克隆个体提供技术支撑。本研究内容包括以下几个方面:(1)在绵羊卵母细胞成熟培养液中添加孕酮等某些影响体外成熟的成份,确定绵羊卵母细胞的最佳成熟方案。(2)并通过对比不同冷冻保护剂对卵母细胞的冷冻保存效果,为核移植操作批量提供成熟的卵母细胞。(3)采用胞质注射法,建立精子提取物激活卵母细胞的方法,并且与离子霉素结合6-DMAP激活法和电激活法进行了比较,筛选出适宜激活方法。(4)体外分离培养得到道赛特绵羊和莎能奶山羊的耳皮肤成纤维样细胞,对绵羊皮肤成纤维细胞的生物学特性和不同细胞因子对其生长增殖的影响进行了研究,并对绵羊成纤维细胞和山羊成纤维细胞分别进行体外传代及冻存,为绵羊体细胞核移植和绵羊-山羊种间核移植试验提供了供体细胞。(5)绵羊孤雌激活胚、绵羊重构胚和绵羊-山羊种间重构胚分别置于不同的培养系统中培养,优化绵羊胚胎体外体系,增加胚胎的体外发育潜力。主要研究结果如下:1.绵羊卵母细胞体外成熟基础液中分别添加5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%发情牛血清(OCS)、5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%胎牛血清(FBS)、0.075 IU/mL HMG+OCS和0.075 IU/mL HMG+10% FBS,结果表明成熟液中添加OCS更有利于卵母细胞的成熟;添加5%～10%的BFF能够提高卵母细胞的成熟率,但20%BFF卵母细胞的体外成熟率下降;培养液中分别添加0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和2.0μg/mL孕酮,结果表明孕酮的最适添加剂量为0.5μg/mL。结果表明绵羊卵母细胞的体外成熟培养液组成为M199+10 mmol/L Hepes+0.38 mmol/L丙酮酸钠+ 25 mmol/L谷氨酰胺+1μg/mL 17β雌二醇(17β-E2)+5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%OCS+0.5μg/mL孕酮时其体外成熟培养效果最好。2.采用程序冷冻法对处于不同发育时期的绵羊卵母细胞进行冷冻保存,冷冻液Ⅰ～冷冻液Ⅳ对同一时期卵母细胞冷冻解冻后的形态正常率、卵裂率和桑囊胚发育率均无显着影响,而冷冻液Ⅳ体外成熟24 h冷冻解冻后的卵母细胞发育率显着高于GV期和体外成熟10 h的卵母细胞,说明用乙二醇(EG)作为冷冻保护剂,添加0.1 mol/L海藻糖较合适对成熟培养24 h的绵羊卵母细胞进行冷冻保存;-6.5℃植冰时冷冻卵母细胞囊胚发育率显着高于其他组。采用玻璃化冷冻方法对绵羊GV期到体外成熟培养24 h卵母细胞进行冷冻保存试验证实,以玻璃化冷冻液Ⅱ作为冷冻剂,体外成熟培养24 h卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率最好,不经过成熟培养的卵母细胞玻璃化冷冻效果最差,认为添加0.1 mol/ L海藻糖来进行卵母细胞的玻璃化冷冻可以起到保护作用,卵母细胞冷冻解冻后可以用作受体胞质进行核移植,重构胚的发育能力受冷冻处理的影响不显着。3.对绵羊卵母细胞以连续3次120 v/mm的直流脉冲进行电激活获得最佳激活效果,囊胚发育率显着高于脉冲1次和2次(P<0.05);用分别注射不同剂量的精子提取物,对绵羊卵母细胞进行孤雌激活,结果表明最佳注射剂量为向每个卵母细胞注入精子提取物3 pL;分别用电激活法,离子霉素联合6-DMAP法和精子提取物胞质内注射法对绵羊卵母细胞进行激活,结果表明电脉冲的激活效果显着低于后二者的效果,且差异显着,精子提取物和离子霉素联合6-DMAP法的囊胚率差异不显着,均可以用于绵羊卵母细胞的激活。4.高糖DMEM较适宜于绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养和继代培养。以DMEM+50% NCS(new - born calf serum),添加10% DMSO为冻存保护剂,进行冷冻保存的无角道赛特绵羊皮肤成纤维细胞,解冻细胞经体外5~6次传代培养,细胞形态维持在初始状况,保持了良好的遗传特性;添加EGF和胰岛素对绵羊皮肤成纤维细胞的生长均有促生长作用。5.卵母细胞体外成熟培养时间分别为15~17 h、19~21 h与23~25 h时,随着培养时间的增加成熟率也增加,卵母细胞去核成功率随着成熟时间的延长而下降,试验认为卵母细胞体外成熟19~21 h,既可以保证高的去核成功率,又可以保证卵母细胞较高的成功率,有利于提供充足的卵源;不经血清饥饿处理的供体细胞采用胞质注射法构建克隆胚,其胚胎发育率略高于血清饥饿处理组,但差异不显着。试验认为体外成熟培养19~21 h的卵母细胞可以作为核移植受体细胞,未经血清饥饿处理的成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,可以获得较高的重构胚胎发育率。6.采用胞质内注射法构建绵羊皮肤纤维细胞重组胚,胚胎经离子霉素联合6-DMAP激活后,其细胞融合率、卵裂率和囊胚发育率均高于电融合法,同时结果表明重构胚用离子霉素联合6-DMAP或精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率相近,其中精子提取物的激活效果优于离子霉素激活法;激活间隔时间研究结果证实,卵母细胞注核后经体外培养3～4 h后再激活,可以获得较高的激活率。7.用冷冻的山羊成纤维细胞可以成功构建山羊-绵羊异种体细胞核移植胚,种间体细胞核移植胚能够进行正常的早期发育,种间重构胚经离子霉素联合6-DMAP或者胞质注射精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率差异不显着(P>0.05);用电脉冲融合法构建异种核移植胚胎时,其融合率、卵裂率和囊胚发育率均低于胞质注射法;不同山羊供体细胞进行山羊-绵羊异种核移植胚胎构建时,血清饥饿处理与否对种间核移植囊胚率无显着影响,表明山羊皮肤成纤维细胞可以不经过血清饥饿处理直接进行核移植。8.联合使用培养液能改善绵羊同种和异种重构胚的发育。即使用CR1aa+BSA培养重构胚3 d,再用SOFaa+5%FBS继续培养,获得的重构胚囊胚发育率较高。在胚胎培养液中添加孕酮可在一定程度上提高重构胚的卵裂率和囊胚率。其中以2.0和4.0μg/mL孕酮组的囊胚率最高,与对照组和其他孕酮浓度组差异显着。发现共培养体系对绵羊同种核移植重构胚的发育有显着的影响,而且在3 d更换1次新的饲养细胞单层对重构胚的发育有明显的促进作用。
张锐[4]2007年在《波尔山羊—牛种间体细胞核移植的研究》文中进行了进一步梳理本试验以体外培养的波尔山羊耳成纤维细胞为供核细胞,牛体外成熟的卵母细胞为受体胞质,研究了波尔山羊-牛异种体细胞核移植中的重要技术环节,旨在初步建立波尔山羊-牛异种体细胞核移植技术平台。论文包括6个相对独立的试验,首先研究了牛卵巢运输中保存温度和运输时间对卵母细胞体外核成熟的影响,结果发现卵巢历经10～12 h运输至实验室,26～30℃保存时卵母细胞体外核成熟率显着高于16～20℃和21～25℃时(78.94±4.5 vs.72.08±5.9 vs.68.70±3.3,P＜0.05);卵巢保存在20～25℃时,运输时间4～6 h组和10～12 h组的卵母细胞体外核成熟率之间无显着差异(P＞0.05)。研究了卵丘细胞对卵母细胞体外核成熟和孤雌发育的影响,结果发现卵母细胞周围卵丘细胞存在时,卵母细胞的核成熟、孤雌胚囊胚发育率均显着高于机械脱除卵丘细胞的卵母细胞组(71.49±5.5 vs.39.12±10.3,P＜0.05;35.24±5.6 vs.22.60±2.7,P＜0.05);根据卵丘细胞层数和是否附带卵泡壁颗粒细胞层(FSP)将COCs分类后进行成熟培养和孤雌激活,结果发现附带不同层数卵丘细胞和附带FSP的卵母细胞体外核成熟率之间无显着差异(P＞0.05),孤雌胚卵裂率上附带5层以上卵丘细胞的卵母细胞组显着高于附带FSP的COCs组(79.90±16.7 vs.66.94±11.4,P＜0.05),但囊胚发育率上附带5层以上卵丘细胞的卵母细胞组和附带卵泡壁颗粒细胞层(FSP)的COCs组显着高于附带4层以下卵丘细胞的卵母细胞组(27.60±5.1 vs.30.06±4.0 vs.20.36±4.3,P＜0.05)。探索了不同融合电压对异种重构卵的融合率和死亡率的影响,结果发现230v/10μs组的重构卵融合率显着高于200v/mm,10μs组和250v/mm,10μs组(53.16±5.9 vs.26.97±3.8 vs.33.07±8.1,P＜0.05),并且230v/mm,10μs组的重构卵死亡率较低。比较了不同重构卵构建方法(透明带下注射法和全细胞胞质内注射法)的构建率及对重构胚胎后期发育的影响,结果发现两种构建方法在构建率、重构胚胎卵裂率和囊胚发育率之间均无显着差异(P＞0.05)。采用了不同卵丘细胞共培养对重构胚胎发育的影响,结果发现卵丘细胞共培养组的重构胚胎囊胚发育率显着高于非共培养组(24.66±5.1 vs.24.21±4.9vs.17.64±1.4,P＜0.05),而原代卵丘细胞共培养组与传代(3代)卵丘细胞共培养组的重构胚胎囊胚发育率之间无显着差异(P＞0.05)。尝试了50 nM TSA处理对山羊-牛异种克隆胚胎发育的影响,结果发现对异种克隆胚胎进行TSA处理48h的囊胚发育率显着高于处理0 h和24 h(33.85±2.8 vs.19.07±3.7 vs.23.82±3.2,P＜0.05)。总之,本研究初步建立了山羊-牛异种体细胞核移植技术平台。通过26～30℃保存牛卵巢至实验室,选择附带5层以上卵丘细胞或FSP的卵母细胞体外成熟后作为受体细胞,将山羊体细胞经透明带下注射(电融合法)或胞质内注射与受体细胞构建重构卵,经化学激活后采用卵丘细胞共培养或50 nM TSA处理48h,异种克隆胚胎体外培养可发育至囊胚期。
武浩[5]2004年在《小鼠-山羊交互异种核移植研究》文中指出本实验在对小鼠卵母细胞激活及孤雌胚体外发育, 山羊卵母细胞体外成熟培养、激活及孤雌胚体外发育条件进行研究的基础上，分别以小鼠(山羊)颗粒细胞作为供核细胞，以山羊(小鼠)MⅡ去核卵母细胞作为受核细胞进行了异种核移植研究。得到如下结果与结论：小鼠卵母细胞孤雌激活以7%乙醇激活（6min,7min和8min）成熟的小鼠卵母细胞,将激活后的卵母细胞分别置入预平衡的培养液中（CZB、KSOM、M199）培养。结果发现：卵母细胞激活率随着激活时间的延长而提高,同时卵母细胞的碎裂率亦随之提高。7min和8min组卵母细胞激活率显着高于6min组(P<0.05)，而7min和8min处理组差异不显着。因此小鼠卵母细胞激活时间以7min为宜。离子霉素（5min）联合6-DMAP(3h,4h和5h)进行卵母细胞孤雌激活，将激活后的卵母细胞分别放入预平衡的培养液中（CZB、KSOM、M199）培养。结果发现:离子霉素联合6-DMAP可显着提高小鼠卵母细胞的激活率。随着激活时间的延长，碎裂率亦增加，说明激活时间以4h为宜。用7%乙醇激活（7min）的卵母细胞在叁种培养液（CZB，KSOM，M199）进行培养。结果表明，CZB中卵裂率最高（71.2%），其次为KSOM（65.4%）, M199(53.3%)最低,其中CZB与M199组间存在显着差异(P<0.05)。在囊胚率发育方面，CZB组最高（23.8%）,而M199组(7.0%)最低,两者间存在显着差异(P<0.05)。而KSOM组(17.1%)结果则介于二者之间。说明CZB作为小鼠激活胚培养液较为理想。用离子霉素+6-DMAP激活(4h)的卵母细胞在叁种培养液（CZB，KSOM，M199）进行培养，结果表明:在KSOM中卵裂率最高（82%）,其次为CZB（80%），M199(75.4%)最低，叁组间无显着差异(P>0.05)。在囊胚率发育方面，以CZB组为最高（32.5%）,而M199组(12.3%)最低,两者间存在显着差异(P<0.05)。而KSOM组结果则介于二者之间(27.2%)。说明在离子霉素+6-DMAP激活条件下，CZB和KSOM均可用于小鼠激活胚体外培养。山羊卵母细胞体外成熟培养在基础培养液中（M199）添加5%、10% FBS或5%、10% EGS后，山羊卵母细胞的体外培养成熟率均得到显着提高，分别为66.2%,72.2%和68.8%,71.5%。说明添加血清对卵母细胞体外成熟有一定影响。以M199+10%FBS为基础液，添加不同激素和因子(FBS,FSH,LH,EGF,HMG)后，山羊卵母细胞体外成熟率有所提高。说明添加激素和因子对卵母细胞体外成熟有利。山羊卵母细胞孤雌激活<WP=8>在室温下(25℃)对山羊卵母细胞进行激活处理(3h,4h,5h),结果卵裂率分别为2.5%,4.2%和2.9%,无囊胚发育。说明温度激活不宜作为山羊卵母细胞激活的方法。7％乙醇联合6-DMAP/6-DMAP-CB尽管可部分激活山羊卵母细胞，但囊胚发育率较低(0%～5.2%),因此, 亦不宜作为山羊卵母细胞激活的方法。 离子霉素(5min)联合 6-DMAP/6-DMAP-CB处理3～5h,可以获得较高的卵裂率和囊胚发育率, 尤其以离子霉素(5min)+ 6-DMAP-CB(4h)程序囊胚发育率最高(43.0%)。小鼠-山羊异种核移植研究在离子霉素+ 6-DMAP-CB激活程序中，激活时间对鼠-羊核移胚的卵裂率和囊胚率有很大影响。在卵裂率上，激活4小时效果最好，卵裂率最高(67.5%)，但与其它组间无差异显着性。在囊胚率发育上，激活3h(16.4%)和4h组(22.2%)显着高于5h组(8.6%)(P<0.05)。说明，核移胚的最适激活时间以4h为宜。将激活后的鼠-羊核移胚在含5%FBS mCR1aa或5%FBS mCR1aa + 颗粒细胞单层的培养液中培养，卵裂率(79.5%和77.4%)和囊胚发育率(15.3%和19.2%)均高于mCR1aa组的卵裂率(64.5%)和囊胚发育率(7.1%)。说明共培养系统对核移胚体外发育有利。以小鼠颗粒细胞为供核细胞,山羊去核卵母细胞为受核细胞进行核移植。结果发现,鼠-羊胚的卵裂率为67.5%，囊胚发育率为24.1%,均低于羊-羊核移植的卵裂率(75%)和囊胚发育率(46.7%)。说明异种动物核移植并不完全等同于同种动物核移植。山羊-小鼠异种核移植研究以山羊颗粒细胞为供核细胞,小鼠去核卵母细胞为受核细胞进行核移植,结果发现,羊-鼠胚的卵裂率为52.5%，囊胚发育率为11.9%,但均低于鼠-鼠核移植的卵裂率(71.3%)和囊胚发育率(35.1%)。说明异种动物核移植并不完全等同于同种动物核移植。不同培养液(CZB,CZB+GC;KSOM,KSOM+GC;M199,M199+GC)中,核移胚的卵裂率相似，但在囊胚发育率上存在显着差异，以CZB+GC组发育率最高(13.3%),M199最低(2.4%)。说明CZB+GC是山羊-小鼠胚体外发育的适宜培养系统。
侯新高[6]2009年在《大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成效果观察》文中指出异种体细胞核移植(interspecies somatic cell nuclear transfer,ISCNT)又称种间核移植,是指体细胞核移植构建克隆胚所用的供体细胞利受体卵母细胞来源于不同物种,即将某一物种动物的体细胞核通过显微操作移植到另一物种动物的去核卵母细胞中获得重编程,构建成异种核质复合体,并使之发育的过程,所形成的重构胚发育至正常的囊胚或棳椹胚阶段,可以将它们移植到受体母畜或供体母畜体内继续发育(异种妊娠),直至最后产生新生个体,其后代主要表现为供体核物质的遗传性状。种间核移植技术在濒危动物保护、新品种培育、人类胚胎干细胞及生物基础学科研究等方面已经展现出美好的前景。近年来随着多莉羊的成功克隆,人们尝试了黄牛和水牛间、小鼠一家兔、小鼠一猪、小鼠一牛、大鼠一小鼠、大鼠一牛、绵羊一黄牛、猪一牛、羚羊一牛、人一牛、人一山羊、人一兔、人一猪等动物种间体细胞核移植的研究,除了野生北山羊一山羊、野生盘羊一绵羊获得个体,野生大熊猫一家兔种间发生早期妊娠以外,其他动物间也都分别得到了体外发育阶段不同的早期的胚胎,尤其是人一牛、人一山羊、人一兔和人一猪等人核胚胎均有报道发育至囊胚阶段。显然,异种重组胚对于受体母畜来说都具有一定程度的异质性,也即重组胚细胞核和细胞质中遗传物质的来源不可能同时与受体母畜的完全一致,异种妊娠的免疫排斥问题目前阶段仅依靠异种重组胚与受体母亲的自然亲和而维持其妊娠、产生出后代的结果是难以实现的,而且动物间亲缘关系越远这种自然亲和就会越困难,因此有人将力图克隆出大熊猫个体的研究抨击为违背自然科学规律的“伪科学”。然而,已知胚胎干细胞主要来源于囊胚,利用多种动物的去核卵母细胞生成人核囊胚用于人类胚胎干细胞建系的研究能够为异种体细胞核移植技术开辟新的意义重大的研究方向。利用这种异种核移植技术获得人的多潜能干细胞系后,再结合组织工程技术的应用,理论上能够形成治疗和修复人类疾病与所需要的各种组织和器官,有望解决目前因组织和器官来源短缺,许多患者未能得到很好治疗的难题。在人类利用克隆性治疗途径进行组织工程和细胞替代疗法的研究中,治疗血癌病人将是最迫切的研究内容之一。大量研究表明,脐血干细胞具有比骨髓及外周血更好的移植优势,但由于每份脐血所含的造血细胞数量较少,主要用于治疗体重小于45kg的患者,故而脐血移植用于成人受到了较大的限制。为了使脐血移植用于成人,探求体外扩增脐血干细胞的方法就显得尤为迫切,异种核移植途径不失为未来最值得探索的、并有望能够解决这一根本问题的一个重要研究课题。然而,目前尚未见到选择血液细胞进行异种核移植的报道,选择白血细胞作为异种核移植的核供体不但在人医上临床意义比较大,而且白血细胞易于采集获得,胞核比较大,有望代替其他终端分化细胞成为囊胚生成效率比较高的用于异种核移植的核供体细胞。大鼠和小鼠同科而不同属,亲缘关系较近,但在自然条件下,种间公母畜不会进行交配。已经证明大鼠.小鼠的重构胚可以发育到囊胚阶段,这种囊胚不能在对方的子宫中与粘膜建立正常的接触而导致受妊困难。我们实验室在设计用于治疗性克隆胚胎干细胞的囊胚生成途径时将异种核移植作为一个新的研究方向,利用体细胞核移植技术路线,在本实验室以大鼠卵丘颗粒细胞为核供体建立了大鼠-小鼠种间核移植技术研究平台,并对大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成途径进行了初步的探索。本研究旨在通过实验动物模型探索白血细胞作为核供体细胞进行异种核移植的可能性及其囊胚生成的效率,为进一步应用人的白血细胞进行异种核移植生产囊胚实验、探索用于治疗血癌病人脐血干细胞体外诱导生成新途径奠定基础。试验总结如下:1小鼠卵母细胞快速去核方法的研究本实验采用蔗糖预处理去核法、显微荧光染色、蔗糖预处理+显微荧光染色去核法对小鼠卵母细胞进行去核处理,统计利用每种去核方法进行核移植后重构胚的卵裂率(2-细胞率),旨在确定一种有效的去核方法。结果表明:利用蔗糖预处理-显微荧光染色去核法进行核移植所得到的2-细胞率最高,达到了为41.86%,与其他两组差异显着(P＜0.05)。由此可知,在对卵母细胞进行去核时采用蔗糖预处理.显微荧光染色去核法会达到较好的去核效果。2不同激活剂对大鼠卵丘颗粒细胞.小鼠去核卵母细胞重构胚激活效果的观察本实验采用了四种化学激活方法,对大鼠颗粒细胞—小鼠去核卵母细胞重构胚进行激活处理,观察统计利用每种激活方法进行激活处理所得到的卵裂率(2-细胞率),旨在寻找一种比较合理的激活方式。处理组1:含7%乙醇的mM16对卵母细胞激活处理5min;处理组2:含10mmol/L放线菌酮的mM16对卵母细胞激活处理4h;处理组3:含7%的乙醇对卵母细胞激活处理5min后,再用2.5 mmol/L 6-DMAP处理4h;处理组4:含10mmol/L SrC12的mM16对卵母细胞激活处理处理4h后,再用2.5mmol/L 6-DMAP处理4h。结果表明:在几中激活方案中,处理组4的激活效果最好,达到了40.42%,与其他组差异均显着(P＜0.05)。因此,在对重构胚进行激活时以乙醇(7%,5min)+CB(5μg/ml)+6-DMAP(2.5mmol/L,4h)进行处理会得到较好的激活效果。3不同培养液对大鼠卵丘颗粒细胞-小鼠去核卵母细胞重构胚的体外培养的影响根据2.2.2中实验结果,在确定比较合理的激活方式后,试验分1、2、3、4组,重新构建一定数量大鼠颗粒细胞—小鼠去核卵母细胞重构胚,激活的2-细胞进行体外培养,培养液分别为KSOM、M16、mM16、mCZB,观察过2-细胞阻滞发育到囊胚的情况,以探讨重构胚的体外培养条件。结果表明:在2-细胞胚的几中培养方案中,在mCZB培养液培养囊胚的发育率最高,为4.34%,与其他组差异显着(P＜0.05)。由此可知在对异种核移植2-细胞胚进行体外培养时以采mCZB较为合适。4大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成效果观察采用蔗糖预处理-显微荧光染色去核法对小鼠卵母细胞进行去核处理,然后用显微注射法将白血细胞进行注核处理,对形成的重构胚采用乙醇(7%,5 min)+CB(5μg/ml)+6-DMAP(2.5mmol/L,4h进行激活处理,然后对激活胚采用mCZB进行体外培养,观察重构胚的体外发育情况,同时与以大鼠颗粒细胞为核供体、小鼠去核卵母细胞为核受体的重构胚发育情况做比较,旨在以大鼠卵丘颗粒细胞为核供体建立的大鼠-小鼠种间核移植技术研究平台的基础上,对大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成途径进行探索性的研究。结果表明:在以大鼠卵丘颗粒细胞为核供体建立的大鼠-小鼠种间核移植技术研究平台的基础上,对以大鼠白血细胞为核供体进行异种体细胞核移植,可以获得囊胚,囊胚率为2.04%,比以大鼠颗粒细胞为核供体进行异种核移植所得到的囊胚率(4.34%)低,且差异显着(P＜0.05)。结论:(1)本实验中大鼠的供核细胞无论是卵丘细胞还是白血细胞,其核受体异种小鼠卯母细胞的去核方法以采用蔗糖预处理-显微荧光染色去核法去核效果较好。(2)在对重构胚进行激活时以乙醇(7%,5min)+CB(5μg/ml)+6-DMAP(2.5 mmol/L,4h)联合激活方法效果较好。(3)在对异种核移植重构胚进行体外培养时以采用mCZB作为胚胎体外培养基较为合适。(4)与大鼠卵丘颗粒细胞为核供体的试验结果相比,大鼠白血细胞为核供体进行异种体细胞核移植的效果比较差,但是可以获得囊胚,囊胚率为2.04%,与对照组4.34%的囊胚生成率相比差异显着(P＜0.05)。
刘志春[7]2003年在《黑熊—家猫种间体细胞核移植研究》文中指出本研究运用体细胞核移植的原理和技术，以六月龄雌性黑熊的成纤维细胞为供核体，去核未受精家猫成熟卵母细胞为受体，构建种间核移植重组胚胎，研究种问体细胞核移植胚胎的构建方法和重组胚胎的体内外发育潜能及其影响因素。并重点讨论影响种间核移植重组胚胎发育的主要因素。主要内容和结果如下： (一) 黑熊成纤维细胞的分离培养和纯化 从黑熊耳缘皮肤和颈部皮肤取材，采用组织块培养法分离培养黑熊皮肤成纤维细胞，在DMEM和RPMI1640两种培养基中分别添加10％的胎牛血清，均可满足黑熊皮肤成纤维细胞的体外生长和传代。通过单细胞集落显微法纯化细胞，可克服单细胞克隆中因细胞密度太低，难以形成克隆的缺点，而且操作简单，效率高，速度快，其克隆率可达93.75％。 (二) 黑熊成纤维细胞的同步化处理和流式细胞仪分析 分离培养黑熊皮肤成纤维细胞，连传3代，分别经血清饥饿2d、3d、4d、5d、6d处理和10μg／ml Nocodazole处理24h。流式细胞仪分析结果表明，血清饥饿处理能较好地使黑熊成纤维细胞同步于G_0和G_1期，其中饥饿3d时，G_0+G_1期的细胞所占百分率最高，达到(85.05±7.0)％；而Nocodazole处理 第四军医大学硕士学位论文则使细胞较大程度同步于 G。和 M期，达到（46．3024卫0）％。两种同步化处理与未处理组细胞周期有显着差异T＜0刀引。 （叁）超数排卵获取家猫成熟卵母细胞的研究 用促卵泡素（FSH），聚乙烯毗咯烷酮（PVP）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）建立家猫的超数排卵方法。结果表明，FSH＋HCG组与田H＋30％PVP＋HCG组收集成熟卵母细胞数（FSH 100单位／只剂量时）分别为 旧．8t3．71枚、19．liZ，77枚；可用卵数分别为IZ．4t2．88枚、12．7t2．41枚，比非激素处理的对照组高出3倍以上，与对照组有显着差异T＜0刀1）。但两组超排效果在同一剂量无显着差异（P为刀5），1m单位”H／只的剂量超排效果最好，最多者可达 25枚成熟卵母细胞，可用卵数为 12．5522石5枚。 （四）黑熊－家猫种间体细胞核移植研究主要结果 1．经血清饥饿3d、4d、sd同步化处理构建的重组胚，其桑堪胚发育率分别为20．22％、18．31％、门石5％，明显高于对照组6．89％和Nocodazole处理组 9．76％（P＜0刀5）；NoCodazole处理组与对照组卵裂率差异显着（P＜0刀5），而桑堪胚发育率无显着差异T＞O刀引；经川、叩、扣血清饥饿处理构建的重构胚，卵裂率和桑堪胚发育率无显着差异o＞0刀引。对照组和同步化处理组构建的重组胚均不能发育到囊胚，其机理有待进一步的研究。 2．研究表明，10 u g／ml的 CCB有利于去核，去核率为 87刀6％。 3．用乙醇＋6－DMAP＋CCB、乙醇＋CHX＋CCB、Sr’”＋CCB等3种方法激活重组胚胎，结果表明，3种激活方法对黑熊－家猫的核移植胚胎都有激活作用，其中乙醇＋6－DMAP＋CCB的激活效果最好，在 TCM 99成熟培养液中培养 36 h后，卯裂率达到 66．09％，桑褡胚发育率达到 26．95％。 4．直接注射法构建的核移植重组胚胎的桑堪胚发育率（25．95％）高于电融合法（16．07％），统计学分析差异显着（P＜0．05）。当电场强度为 1800V／CC，脉冲宽度为 30ms时，融合率最高，达到引．38％；当电场强度为 2400 V／cm，脉冲宽度为 40ms时，重组胚胎崩解。 －3－一 5．重组胚在3种培养液中的发育能力有差异T＜0刀引，＊＊M199成熟培养液比DMEM12、M16更能支待重组胚胎的卵裂和桑棋胚发育，卵裂率和桑堪胚发育率分别为 63．39％、25．89％；DMEM／F12、M16对黑熊－家猫种间核移植重组胚的体外培养无显着差异T劝刀引。重组胚胎在3种培养液中没有得到囊胚期的胚胎。 6．将体外发育到2一胞至桑褡胚时期的194枚重组胚，分别移植给同期发情的 20只假孕雌猫的输卵管伞、输卵管和子宫角。结果表明，2一胞至桑堪胚时期的重组胚未能妊娠和产子，其原因有待进一步的研究和探索。 结论：本研究在国内外首次进行黑熊－家猫种间体细胞核移植研究，初步建立了种间体细胞核移植重组胚的构建方法，并获得发育至桑棋胚的黑熊－家猫胚胎，但没有得到囊胚，2＞胞至桑堪胚的重组胚移植给受体动物（雌猫），均未妊娠。说明家猫的去核成熟卵母细胞质能支持黑熊成纤维细胞进行发育程序重编，尚不能维持重组胚胎的囊胚发育和妊娠，其机理还有待进一步的研究。另外，供体细胞的同步化处理、卵母细胞的质量、重组胚胎的构建。激活方法、培养系统等因素都影响异种核移植胚胎的发育。
谭晓颖[8]2009年在《绵羊同种及绵羊—山羊异种核移植研究》文中进行了进一步梳理在绵羊同种及绵羊-山羊异种克隆胚构建过程中,为了完善克隆胚构建及培养体系,就离子霉素和乙醇分别联合6-D的激活、不同的融合和化学激活前培养时间和不同阶段添加饲养层对克隆胚发育的影响叁个方面进行了研究。对绵羊同种核移植所得流产胎儿进行了分子生物学检测,结果表明:1. 5mmol/L离子霉素联合6-D激活同种克隆胚胎和异种克隆胚胎5min,其卵裂率、桑椹胚和囊胚发育率虽均高于7%乙醇联合6-D激活胚胎5min(同种依次为79.67%Vs73.39%、44.79% Vs 35.08 %以及11.97% Vs 8.18%,异种依次为76.00% Vs 72.13%、36.84% Vs 35.60%以及9.77% Vs 6.82%),但差异不显着(P>0.05),同种克隆和异种克隆胚胎比较,差异不显着(P>0.05)。表明易得到的乙醇可以替代离子霉素。2.融合前平衡1h的同种和异种胚胎卵裂率,桑椹胚率均比不平衡直接融合明显高(同种76.88% ,76.70% Vs 64.49%,63.16%;52.85%,43.04% Vs33.33%,28.33%;异种为76.09%,77.53%Vs70.09%,63.33%;46.07%,44.93% Vs 30.67%,28.07%)(P<0.05),但平衡1h与直接融合囊胚发育率差异不显着。激活前平衡2h与否直接影响激活胚胎的完整率。融合后平衡2h再激活,可以获得明显高于直接激活的胚胎完整率(同种95.81%,97.27% Vs 74.64%,69.85%;异种97.50%,96.40% Vs 78.76%,67.16%)。总的看来,融合和激活前分别平衡1h,2h的同种及异种克隆胚胎均获得效果较好的胚胎激活完整率,分裂率,桑椹胚发育率和囊发育率(同种95.81%,76.88%,52.85%,9.76%;异种为:97.50%,76.09%,46.07%,10.11%)。但无论平衡与否,胚胎的融合率都没有显着差异。3.在克隆胚培养前72小时添加饲养层有助于提高卵裂率(同种差异显着,84.08% vs72.96% vs75.76%(P<0.05);异种差异不显着,76.86% vs 69.38% vs 67.11%(P>0.05)),同种克隆和异种克隆胚比较,异种克隆胚的卵裂率和囊胚率明显低于同种克隆胚胎。而在72h之后添加饲养层共培养,桑椹胚和囊胚发育率与未添加的差异均不显着(P>0.05)(桑椹胚率同种31.47% vs 40.0 % vs 51.48%;异种,37.84% vs 39.22% vs 51.48%,囊胚率同种,7.69% vs 10.67 % vs 14.79%;异种,3.60% vs 5.88% vs 7.32%)。结果表明对同种和异种克隆胚胎而言,在前72h进行共培养,有利于胚胎的发育,而72h之后不需要饲养层共培养即可,同种克隆和异种克隆胚胎比较,差异不显着(P>0.05)。4.筛选5对微卫星引物对体细胞克隆绵羊流产胎儿DNA进行PCR扩增,12%聚丙烯凝胶电泳,硝酸银染色克隆胎儿的微卫星DNA指纹与供体细胞完全相同,而不同于其受体母亲和对照绵羊。证明该流产羔羊基因来源于供体细胞,为体细胞克隆绵羊。用Sry基因特异性引物扩增发现流产胎儿和供核细胞一样均为雄性,进一步证实了该流产胎儿为体细胞克隆绵羊。
王贺[9]2011年在《延边奶山羊—绵羊体细胞克隆胚融合、激活条件的研究》文中进行了进一步梳理异种间的体细胞克隆技术为保护和拯救珍稀濒危动物、人类器官移植开辟了一条崭新的途径,目前,虽然有种间体细胞核移植动物出生,但是较低的成功率限制了这项技术在实践中的应用。种间核移植仍面临着很大的困难,需要寻求适宜的供受体细胞组合及早期胚胎发育的环境。为了给动物种间核移植研究积累知识和经验,本实验对延边奶山羊-绵羊重构胚的融合、激活做了预先一步的研究。本实验采用延边奶山羊耳皮肤成纤维细胞为供核细胞,以绵羊MⅡ期去核的卵母细胞为核移植受体,构建了山羊-绵羊异质重构胚。我们设计了一系列的试验以优化延边奶山羊-绵羊重构胚的融合激活效果,探讨了不同融合电场强度、脉冲次数、脉冲时程、融合后平衡时间、融合液浓度及激活方法对重构胚融合率及重构胚体外发育率的影响。实验结果如下：1、甘露醇浓度为0.25mol/L、0.28mol/L时重构胚的融合率(50.12%vs52.74%)和卵裂率(53.50%vs55.52%)差异不显着(P>0.05),但与0.30mol/L组相比差异显着(P＜0.05),0.28 mol/L组的桑椹胚发育率(17.36%)明显高于其他两组,相比差异显着(P<0.05);2、电场强度为1000v/cm时重构胚的融合率与其它各组之间相比差异显着(P<0.05),电场强度为1200v/cm,1400v/cm以及1600v/cm时重构胚的融合率之间差异不显着(P>0.05)；1400v/cm的卵裂率(60.84%)和囊胚率(8.14%)最高,与1200 v/cm相比差异不显着(P>0.05),但与其他各组相比差异显着(P＜0.05)：3、2次脉冲的融合率与1次脉冲相比差异显着(P＜0.05),但与3次电脉冲相比差异不显着(P>0.05)；2次脉冲的卵裂率(69.84%)和囊胚率(6.14%)显着的高于1次和3次脉冲,差异显着(P＜0.05)；,但1次和3次脉冲之间差异不显着(P>0.05)。4、脉冲时程为40 u s时重组胚的融合率(65.56%)高于其他各组,但差异不显着(P>0.05),但是卵裂率(58.90%)与其他叁组(10μs、20μs、80μs)相比差异显着(P<0.05)。脉冲时程为40μs的桑椹胚发育率为18.16%,与10μs组、80μs组相比差异显着(P<0.05),但与20μs组相比差异不显着(P>0.05)5、30min、60min、90min、120min不同的平衡时间的融合率差异不显着(p>0.05),但90min组的卵裂率(70.62%)显着高于其他叁组,相比差异显着(p<0.05)。90min组的囊胚率为8.10%,显着高于30min和120min组,但与60min组相比差异不显着(p>0.05)。6、EH+CHX、EH+DMAP、Ion+CHX、Ion+DMAP四种激活方式卵裂率方面差异不显着,但是在桑椹胚发育率方面,Ion+6-DMAP组(21.30%)显着高于其他叁组(18.90%、14.12%、15.34%), EH+CHX组与EH+6-DMAP组和Ion+6-DMAP组相比差异显着。EH+6-DMAP组和Ion+6-DMAP组之间差异不显着。
沈晓晖, 陈建泉, 成国祥[10]2008年在《生殖性克隆的类型及影响核移植效率的因素》文中提出生殖性克隆(Reproductive Cloning,RC)是指通过细胞增殖而不经历两性交配产生的遗传背景完全相同个体的生殖技术,它对优良种畜的扩繁和挽救濒危动物具有极大的应用价值。本文对生殖性克隆种类及其进展作一综述,并重点对影响核移植成功率的因素进行讨论。
参考文献：
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[4]. 波尔山羊—牛种间体细胞核移植的研究[D]. 张锐. 安徽农业大学. 2007
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[6]. 大鼠白血细胞核移入去核小鼠卵母细胞的种间核移植囊胚生成效果观察[D]. 侯新高. 西南大学. 2009
[7]. 黑熊—家猫种间体细胞核移植研究[D]. 刘志春. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[8]. 绵羊同种及绵羊—山羊异种核移植研究[D]. 谭晓颖. 西北农林科技大学. 2009
[9]. 延边奶山羊—绵羊体细胞克隆胚融合、激活条件的研究[D]. 王贺. 延边大学. 2011
[10]. 生殖性克隆的类型及影响核移植效率的因素[J]. 沈晓晖, 陈建泉, 成国祥. 中国比较医学杂志. 2008