张万义[1]2004年在《利用bcl-2基因治疗慢性充血性心力衰竭的实验研究》文中提出[背景]近年来人们逐渐认识到心肌细胞的反复丢失是心力衰竭进程中最为重要的因素。而心肌细胞凋亡可能是其反复丢失的根源所在。同时因凋亡所致的心肌细胞死亡与病理性的心室重构密切相关。因此对由于凋亡所致的心肌细胞数量减少的研究,逐渐成为心力衰竭研究的热点。 细胞凋亡是受基因编码调控的。许多基因参与凋亡的调控,目前研究表明,Bcl-2基因直接抑制细胞凋亡。鉴于此,运用基因载体技术、基因转移技术将bcl-2基因导入衰竭的心肌,可直接抑制心肌细胞凋亡,减少心肌细胞丢失,提高心脏功能。 [方法]本课题根据文献采用腹主动脉结扎法制备了慢性心衰模型,将模型动物分为对照组及基因药物心肌注射后1d、3d、7d组。基因药物注射组用构建的In-vivo-jetPEI-pCAGGS-GFP-bcl2 DNA进行心肌转染,对照组注射等量的In vivo-jetPEI。采用激光共聚焦显微镜及抗体染色法观察心肌切片中GFP、Cy3荧光的表达,以二步免疫组化法检测Bcl—2基因蛋白的表达变化:以缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞;用多道生理记录仪检测转染动物的心功能包括:心率(HR)、中心静脉压(CVP)、心输出量(CO)、左室舒张末压(LVEDP)等。 [结果] 1.带有GFP报告基因的Bcl-2基因药物,注射慢性心衰大鼠的心肌后,1天后取材,用激光共聚焦显微镜观察,能明显的看到GFP的表达,用Cy3二抗也能检测到GFP较高表达的丰度。
麦瑞林[2]2009年在《DAA-Ⅰ与丹参素抗心衰大鼠心肌细胞凋亡的机制研究》文中认为目的:观察去天冬氨酸血管紧张素I(DAA-I)及丹参素防治阿霉素性心衰大鼠的治疗作用,探讨其抗衰竭心脏中氧化损伤与心肌凋亡的心肌保护机制,评价DAA-I及丹参素对心肌细胞的保护作用与防治心衰等心血管疾病的效应,为临床研究提供临床前实验依据。方法:以腹腔注射阿霉素复制SD系大鼠心衰实验动物模型,28天后随机设立正常对照组、模型对照组、DAA-I组、丹参素组、DAA-I+丹参素组、消炎痛组、DAA-I+消炎痛组、缬沙坦组,同时开始给予DAA-I等药物进行干预,连续28天。56天后,各组大鼠行颈动脉插管至左心室以检测LVSP、LVEDP、±dp/dtmax等血流动力学指标;放射免疫法检测血浆TNF-a;取左心室组织匀浆检测左心室组织中SOD、MDA、CAT等氧化损伤指标;取左心室作病理切片,显微镜下观察左心室病理形态学的改变;以TUNEL技术检测左心室心肌细胞凋亡情况(AI);以免疫组化SABC法检测心肌组织中Bcl-2、Bax、caspase-3基因表达的变化。结果:1.血流动力学:模型组大鼠LVSP、±dp/dtmax明显下降,而HR、LVEDP则呈明显上升的趋势,与正常组比较具有明显的差异(P＜0.01)。与模型组比较,DAA-I组、DAA-I+丹参素组及缬沙坦组及丹参素组大鼠HR、LVEDP明显降低,LVSP、±dp/dtmax则明显为升高,各治疗组血流动力学以上指标均与模型组有明显差异,并以DAA-I+丹参素组改善最为显着(P＜0.01);消炎痛组与DAA-I+消炎痛组与模型组比则没有明显差异(P＞0.05);2.光镜下病理形态学:光镜观察正常组大鼠左心室组织心肌纤维结构清晰、排列规则、核染色均匀,心肌无明显病理性改变,心肌之间间隙紧密而无水肿及纤维化改变;模型组心肌可见明显空泡化或水肿等细胞变性、核染色呈深染,可见心肌纤维化、伴炎症细胞浸润,心肌纤维萎缩、排列紊乱,心肌细胞间间隙增宽;DAA-I组、DAA-I+丹参素组、缬沙坦组及丹参素组均有所改善。3.细胞因子TNF-a的变化:与正常组比较,模型组大鼠血循环中TNF-a的含量显着高于正常组,约接近正常组的四倍(P＜0.01);与模型组比较,除了消炎痛组、DAA-I+消炎痛组没有明显差异外(P＞0.05),DAA-I组、DAA-I+丹参素组、缬沙坦组TNF-a的含量均显着性下降(P＜0.01),其中尤以DAA-I组、DAA-I+丹参素组下降最为明显并接近正常组水平(P＞0.05),丹参素组虽然呈下降趋势,但并没有达到统计学意义(P＞0.05)。4.氧化损伤指标:在模型组心肌组织匀浆中SOD、CAT活性较正常组明显降低(P＜0.01),而脂质过氧化反应产物MDA含量则较正常组显着增高(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组均能提高心肌中SOD、CAT活性及降低MDA含量,均具有明显差异性(P＜0.01),其中以DAA-I组、DAA-I+丹参素组组最明显;而消炎痛组、DAA-I+消炎痛组没有明显差异(P＞0.05)。5.心肌组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表达:与正常组比较,模型组Bax基因呈高表达而Bcl-2基因弱阳性表达,Bcl-2/Bax比值降低,具有显着性差异(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组均能抑制大鼠心肌组织中Bax基因表达及促进Bcl-2基因表达而上调Bcl-2/Bax比值,具有显着性差异(P＜0.01),尤以DAA-I组、DAA-I+丹参素组更为显着(P＜0.01),但两者之间并没有明显差异(P＞0.05);与模型组比较,消炎痛组、DAA-I+消炎痛组无明显差异(P＞0.05)。与正常组相比,模型组心肌组织中Caspase-3蛋白呈高表达水平(P＜0.01);与模型组比较,各治疗组均能抑制大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达(P＜0.01),而消炎痛组、DAA-I+消炎痛组无统计学意义(P＞0.05)。6.TUNEL检测心肌细胞凋亡率(AI):与正常组比较,模型组心肌细胞凋亡率呈高水平具有显着性差异(P＜0.01);与模型组相比,各治疗组能有效抑制心肌细胞凋亡,有显着性差异(P＜0.01),尤以DAA-I组、DAA-I+丹参素组最为显着(P＜0.01),但两者之间并没有明显差异(P＞0.05);与模型组比较,消炎痛组、DAA-I+消炎痛组则没有明显抑制心肌细胞凋亡(P＞0.05)。7.死亡率:实验结束时统计各组大鼠死亡率,正常组大鼠全部存活,与模型组病死率比较,各治疗组均能降低心衰大鼠病死率而改善心衰预后。结论:1.心力衰竭的病理生理进程与氧化损伤及心肌细胞凋亡机制有着密切关系,及时采取抗氧化损伤及心肌凋亡等措施对逆转衰竭心脏心肌重构及避免或延缓失代偿进程具有重要临床意义。2.DAA-I能明显改善心衰大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax等血流动力学指标,具有很好维持及改善心功能作用而有效防治心衰的发生发展。DAA-I能明显降低心衰大鼠的病死率而改善心衰预后。3.同时本实验表明DAA-I通过与AT_1结合以拮抗AngⅡ的心血管效应,而具有心急；ばв?给予与AT_1相结合的消炎痛则能起到阻断DAA-I的作用。DAA-I具有明显改善心衰大鼠血流动力学和调节心衰过程中的细胞因子、抗氧化损伤及心肌细胞凋亡的作用,这些作用可能是其保护心肌细胞以防治心衰的机制;丹参素单用时作用稍弱,而DAA-I与丹参素合用则能明显提高协同效应,尤其体现在抗氧化损伤、改善血流动力学等方面。显示出DAA-I+丹参素从中西医结合角度上调控RASS以防治心衰具有一定前景。4.DAA-I的心肌保护作用机理可能与以下几方面密切相关:降低循环血液中肿瘤坏死因子含量;增高心肌中SOD、CAT活性及降低MDA含量;抑制心肌中Bax蛋白表达而上调Bcl-2/Bax比值,抑制心肌组织中caspase-3蛋白的表达等。5.本实验表明DAA-I作用优于ARB阻滞剂缬沙坦,提示DAA-I与目前拮抗RASS系统的ACEI和ARB相比,呈现作用全面、确切等优点。首先,通过与结合消炎痛敏感型AT_1亚型受体以发挥拮抗AngⅡ结合AT_1产生的效应;其次,心衰等病理情况下,机体AT_2上调,加上因拮抗AngⅡ作用后通过反馈机制,使得尤其心脏局部组织中AngⅡ浓度上调,与AT_2结合发挥扩张血管等有利于心血管的效应;最后,或许能发挥与ARB一样的效应,能够加强AngⅡ与AT_2结合而逆转AngⅡ不利于心血管的作用。DAA-I是一个很有潜力的心肌细胞保护药物,但其详细及综合机制及从中西医结合角度防治心血管疾病等尚有待进一步深入研究及探讨。
陈金星[3]2003年在《功能基因群调控慢性充血性心力衰竭气虚证的机制研究》文中认为充血性心力衰竭（CHF）发病率高，严重影响病人生活质量，且死亡率高。CHF是能量供应不足造成基因表达异常而引起的一种超负荷心肌病，其特异性病理变化为左心室重构。本研究是在实施导师王硕仁的国家自然科学基金课题《心气虚证时基因功能表达群对血脉、神明的调控特点研究》中的相关内容及其部分扩展研究。1功能基因群调控慢性充血性心力衰竭气虚证的实验研究本实验旨在揭示心衰的功能基因组学及其与结构功能的关系。采用冠脉结扎建立心梗后心衰模型，在后期加用左旋精氨酸升高血压致心衰恶化，观察心衰形成(术后10天)、稳定(术后8周)、恶化(术后12周)叁期气虚证的基因表达谱变化及其与心脏功能、结构改变和蛋白质原位表达的关系。结果显示了模型动物的基本特征：⑴复制了心衰心气虚证的模型：①心悸（心率加快，P<0.01）。②气促、胸闷（呼吸加快，P<0.01）。③乏力：行动迟缓、蜷卧。④舌质色紫暗少津、胖大、舌尖偏右可见到一处明显青紫。⑵发现了功能基因群表达的时空变化：对心衰形成、稳定、恶化叁期大鼠的左心室梗塞区、非梗塞区和同期假手术组的左心室分别取材提取总RNA，以9张大鼠40S基因芯片(4096个基因/张芯片)对其进行检测，发现有参与能量代谢和心肌细胞骨架及纤维等13类共千余条表达上调和下调的基因，基因差异表达在梗塞区为形成期最多（1086条）、稳定期次之（724条），恶化期较少（372条），而非梗塞区为形成期最多（196条），恶化期次之（183条），稳定期最少（97条）。⑶确定了决定CHF的关键功能基因群；以基因芯片分析软件，用聚类分析法，结合生物信息学意义分析结果显示：受体、信号转导的基因表达极度降低，引起①代谢类（尤其是能量代谢）、离子与通道类、抑制凋亡（Bcl2）基因表达随之下调，同时心肌胚胎基因再表达、收缩舒张类基因下调，②部分细胞调节蛋白类（尤其是激活心肌间质纤维化的基因，如FN、TIMP等）、DNA合成、修复和重组类基因、原癌基因和抑癌类基因、促进早期凋亡的基因、细胞周期蛋白类基因表达明显上调。③表达下调最低的为磷酸甘油酸变位酶，参与信号转导、氧化磷酸化和能量代谢过程，下调近10-folds。④表达上调最高的为纤溶酶，激活心肌间质纤维化系统，如FN、TIMP，其上调近25-folds。基因表达调控紊乱的结果是心肌细胞肥大、坏死或凋亡、心肌纤维化的左室重构发生，最后导致心脏功能降低。2功能基因群调控慢性充血性心力衰竭气虚证的干预研究本实验旨在验证功能基因群调控CHF气虚证的基本规律。以胶原纤维蛋白基因及其调控基因的表达改变为例，采用活血益气方药以及卡托普利对CHF关键功能基因群改变的干预作用，以反证功能基因对CHF的调控作用。结果显示了干预因素对CHF关键病变（左室重构）的基因调控作用。⑴干预因素影响了CHF模型的病理进程：①活血药占全方总量的75%的活血益气组（HXYQ）、活血药占全方总量25%益气活血组（YQHX）的心功能显着好转，与模型组比较 P<0.01；②心电图改善，以HXYQ明显。③心气虚证候减轻：心悸缓解(P<0.01， P<0.05)、气促明显改善(各治疗组P<0.01)、舌淤血征缓解(HXYQ明显)。⑵干预因素逆转CHF病变的主要机制：①HXYQ 、QXZ的心脏系数明显减小。②HXYQ
杨华升[4]2003年在《温阳化饮、益气活血法防治充血性心力衰竭的实验研究》文中提出充血性心力衰竭(CHF)是各种心脏病的终末阶段，临床发生率高，病死率高，是严重危害人民健康的常见疾病。目前CHF的治疗目标已从单纯改善症状向提高患者长期生活质量和降低病死率方面转变，而仅凭西药治疗仍难实现这一目标。西药治疗常须联合应用多种药物，存在一些难以避免的毒、副作用，而中医药治疗具有多靶点、多途径和副作用相对较小的优势。 本研究通过分析大量的中医古代文献及近年来中西医对CHF的研究进展，结合我们的临床经验，认为阳气虚衰，瘀血痰饮互结是CHF的主要病机。在此基础上提出运用温阳化饮、益气活血法治疗CHF，选用附子、人参、黄芪、丹参等十位药物组成强心胶囊并进行了实验研究。 本研究采用腹腔注射阿霉素法复制了目前公认的Wistar大鼠CHF动物模型，将动物模型分为中药预防组、中药治疗组和西药对照组(卡托普利、倍他乐克联合应用)叁组进行药效学研究，并设立正常对照组和模型组作为对照。结果表明以温阳化饮、益气活血法组成的强心胶囊具有以下作用：(1)可明显改善CHF大鼠的心脏收缩和舒张功能；(2)能显着降低CHF大鼠血浆内皮素、肿瘤坏死因子、心钠素、醛固酮、血管紧张素Ⅱ的水平；(3)能改善CHF大鼠心肌的病理变化和超微结构；(4)强心胶囊能明显抑制CHF大鼠心肌细胞凋亡及调控相关基因Fas、Bcl-2的表达。以上结果提示：强心胶囊是防治心衰的有效药物，其在调整CHF大鼠的神经内分泌水平，降低内皮素和肿瘤坏死因子水平方面同西药对照组作用相当，其调控细胞凋亡相关基因表达、减少心肌细胞凋亡及改善心室重构作用优于西药对照组。温阳化饮、益气活血法可以从多种途径对CHF进行有效防治，早期用药效果更佳。
赵锋利[5]2000年在《开心胶囊Ⅰ号对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡调控作用的实验研究》文中研究表明心力衰竭（Heart Failure简称HF）是严重危害人类健康的一种病理综合征，见于各种心血管疾病。心力衰竭患者一旦出现典型症状，病情将进行性加重，死亡率与恶性肿瘤病人相仿。 开心胶囊Ⅰ号是广州中医药大学第一附属医院陈镜合教授研制的中药复方制剂，临床上用于治疗无症状性心力衰竭及心功能尚属NYHAⅠ、Ⅱ级的轻度心力衰竭患者，疗效显着。为了深入阐明验方开心胶囊Ⅰ号的机理，本研究从文献理论与动物实验两方面入手做了以下工作： （一）文献研究1.医文献理论方面：传统中医学无明确的心衰病名，一般将本病归于“喘证”“心悸”“水肿”等范畴，认为其基本病机是水气与气（阳）虚，治疗上偏重补虚与治水。现代中医学已明确认识到本病，但病名尚无共识之称谓，病机方面认为其主要是心气虚、血瘀、水泛叁者病变的相互转化；治疗上多联合应用益气、温阳、化瘀、利水等四种基本治法，不同病情，不同医家，各有侧重；某些情况下，心衰的中医药疗法与现代西医疗法优势互补。2.现代医学文献理论方面：经复习文献后认为：A.近年来世界心血管病学界在HF治疗策略上的最重要转变是：维护心脏、提前治疗尚未出现明显“充血性”症状的HF，以改善患者生活质量、提高远期存活率为根本目标。B.在HF概念方面的重要转变是：提出了无症状性心力衰竭（AHF）。AHF是指已有心脏压力升高，但既无典型症状也无明确体征的HF亚临床阶段。AHF是比心力衰竭NYHAⅠ级更为轻浅的阶 开心欣辽1号对心力衷场大辽妇胞凋亡训扭作用的实脸研兑段，表面上病情稳定，但内部心肌重构与心脏重塑等病理生理变化持续进展，适应状态迟早会变转变为适应不良而发展成有症状心衰。C．在11卜基础研究方面，认为现在更注重阶发展演变这一动态进程的病理生理机制。己有大量证据说明：HF的进展与以下叁方面关系密切：①血流动力学异常②神经内分泌的激活③心脏重塑。叁者互为因果，形成恶性循环。HF病程进展的分子细胞学基础被认为主要是：①心肌细胞的变化②心肌细胞外间基质细胞的纤维化，其中心肌细胞的变化又包括心肌细胞数量和质量的变化两方而（坏死与凋亡同时存在，并且适应不良性肥大）。 据此，在中医学“不治己病治末病”的理论指导下，以现代医学细胞凋亡与神经内分泌两方面的成果为研究切入点，对开心胶囊1号的疗效机制进行动物实验研究，探讨其与凋亡、凋亡基因及一氧化氮、内皮素的相关机制。 （二）实验研究1．动物模型的建立： 本研究以结扎左冠状动脉主干下2．4mm所致大鼠MI后模型作为心衰模型。 造模成功后叁天的SD大鼠140只（假手术组只开胸不结扎冠状动脉人雌雄谷半u50＜100g人 随机分为 5组，每组各 20t2只。开心胶囊 1号高、低剂量组，分别以开心胶囊 1号灌胃（10、sn·kg‘·d－‘）；卡托普利组以自由饮水给药门·L－＼ 模型组、假手术组正常喂养。连续给药8周后开胸，心脏取血后，取心脏，部分非梗塞心肌剪成小块分别放液氮中保存，部分心脏 10yo甲醛固定包埋后平行于乳头肌水平取片，血标本离心后－20oC保存。待测下列指标。2 尤衍利硕士论文 导师：际似合被投 2．对HF大鼠血清及心肌NO的影响： 按试剂盒要求以硝酸还原酶法，通过分光光度计测定NO水平。 结果表明开心胜囊1号可增加血清m浓度，但与模型组及假手术组 比较无统计学意义（卜＞0．（）5）。模型组心肌NO浓度较假手水组增加 （卜＜O．05）：开心胶囊1号高剂量组能增加心肌洲浓度，与模型组比 较差异显着（P＜（）．05）。 人 对仰大鼠血浆及心肌盯的影响： 按试剂盒要求应用放射免疫法测定ET结果表明，模型组血浆及 心肌 E＊较假手术组明显增高，差异非常显着（P＜0．00）：升心胶囊 I号高、低剂量组较模型组减少，差异非常显着（P＜0．（）of，（）．of）。 4．对＊‘人鼠心肌细胞凋亡的影响： 按试剂盒要求应用TUNEL法检测HF大鼠左室梗塞周围心肌细胞 结果表明，模型组凋亡指数较假手术组增加（V0．05）：开心胶囊1 号高剂量组较模型组减少（P＜0．05）。 5．对 HF大鼠心肌细胞 bC－2、P53蛋白表达的影响： 按试剂盒要求应用叩免疫组织化学法检测心肌细胞卜C卜2蛋白 表达结果表明，模型组表达较假手术组增加叩N．00）；开心胶囊 1 号高剂量组较模型组增多（P＜0．05）。各组 PS：1蛋白表达未能显示阳 性结果。 开心胶囊1号临床上应用可能对延缓心衰进展有利，可防治AHF、 NYHA、U级患者由适应发展至适应不良。据动物实验，推测其疗效 机理可能与其具?
郭豫涛[6]2005年在《联合钙离子ATP酶2a和骨髓干细胞移植治疗心力衰竭的研究》文中研究表明心力衰竭是各种心脏病的严重阶段,发病率和死亡率高,5年存活率和恶性肿瘤相仿。心力衰竭的治疗日益受到人们的关注。虽然药物治疗心力衰竭取得一定进展,但疗效有限,其它如心脏移植等外科治疗存在高风险,费用昂贵等缺陷,因此亟需寻找更为安全有效的治疗方法。在心力衰竭的治疗策略中,增加心肌细胞数目和纠正心肌细胞功能是治疗的两个主要方面。本研究以骨髓干细胞为平台,腺病毒为治疗基因载体,联合钙离子ATP酶基因(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCa2a)和细胞移植治疗慢性充血性心力衰竭。比较单纯SERCA2a基因治疗,骨髓干细胞移植以及联合基因和细胞移植治疗心力衰竭的作用,探讨SERCA2a基因治疗,骨髓干细胞移植治疗心力衰竭的可能机制,评价以SERCA2a作为基因治疗靶点和骨髓干细胞作为平台应用于心力衰竭治疗的可行性。为寻找慢性心力衰竭尤其终末期心力衰竭的高效安全的治疗策略提供思路和实验基础。本研究分四个部分进行。 实验第一部分观察腺病毒载体转染骨髓干细胞(msenchymal stem cells,MSCs)的有效性和外源性基因表达的时相。体外培养大鼠(Sprague Dawley,SD)骨髓干细胞,用已构建好的Ad5-CMV-GFP真核载体分别转染培养的第3代(P3)及第8代(P8)MSCs。流式细胞仪检测转染后第2,4,7及10天绿色荧光蛋白(GFP)的表达率。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western杂交等方法检测腺病毒受体(CAR)在各代MSCs中的基因和蛋白质的表达。重组腺病毒对MSCs的转染率可达80%,P3与P8代MSCs转染率无明显差异(P>0.05)。转染后2天可见GFP表达,第7天表达水平达高峰,28天仍可见GFP在MSCs中表达。CAR在P1明显低于P2,P3,P6,P8各代MSCs(P<0.05),但P3,P6与P8 MSCs表达的CAR无显着差别(P>0.05)。重组腺病毒载体能有效转染骨髓干细胞,并维持1个月左右。P3与P8 MSCs均可作为基因治疗的高效细胞载体。 实验第二部分以腺病毒(Ad-CMV)介导SERCa2a基因转染MSCs,测定表达产物,为心力衰竭的细胞移植和基因治疗提供细胞水平的实验基础。体外
佚名[7]2002年在《作者索引》文中指出(按汉语拼音字母顺序排列,索引论文前3位作者)AAdrian W Gelb Development 0f anaesthesiology (15):1 345一1346艾玉峰应用带蒂皮瓣、肌皮瓣修复小腿骨外露、骨髓炎创面 (2):183 组织工程骨复合骨
朱浩[8]2018年在《辛温通阳法治疗心梗后室性心律失常的疗效评价及其基于微小RNA的机制研究》文中研究说明目的通过动物心梗模型验证辛温通阳法的代表药物葱白提取物防治心梗后室性心律失常的疗效,初步阐明葱白提取物作用机制;利用芯片筛选可逆性差异性微小RNA并结合生物信息学预测靶蛋白,进一步明确葱白提取物治疗心梗后室性心律失常的微小RNA调控机制。方法本研究选用体重为250-300克,3-4月龄的健康纯种SD雄性大白鼠,随机分为预防组和治疗组。预防组(A-L)分为:假手术组、空白模型组、葱白组、葱白提取物组和胺碘酮片组,每组15只;治疗组分为急性组(1周)和慢性组(4周),每组又分为假手术组、空白模型组、葱白组、葱白提取物组和胺碘酮片组,每组15只。行腹腔注射麻醉,上呼吸机,开胸,暴露心脏,丝线围绕左前降支结扎,直至所在范围内的心肌明显肿胀、变暗、无收缩运动,心电监护示ST段抬高0.5mV,且30min内不回落,示心肌梗死模型制备成功。预防组大鼠麻醉后连接体表心电图,造模成功后,设置刺激电极,进行程序电刺激诱发室性心律失常;治疗组分别于给药结束后,大鼠麻醉后连接体表心电图,开胸,设置刺激电极,进行程序电刺激诱发室性心律失常。预防组连续给药1w后建立心梗模型;治疗组建立心梗模型后,从术后第二天开始灌胃给药。急性组连续给药1w,慢性组连续给药4w。治疗结束后在体诱发心律失常,记录所发生的室性心律失常的种类。比较各组之间心律失常评分,进行疗效评价。采用微小RNA芯片比较预防组和治疗组共20只SD大鼠心肌细胞的miRs差异性表达,给予药物处理后恢复原来表达谱。列出可逆性差异miRs表达谱。设计相应引物,QRT-PCR进一步验证上述可逆性差异性表达的miRs。用TargetScan和PicTar工具,预测miRs靶蛋白,根据蛋白功能,建立葱白提取物-miRNA-mRNA蛋白通路,利用luciferase实验在HEK293细胞中验证miRs同靶蛋白的序列特异性,上调和/或下调相应miRs,在心肌细胞中检测其蛋白表达相关性。结果1.预防给药实验中,与空白模型组比较,葱白组大鼠VP、VT及胺碘酮片组大鼠VT、VF的发生例数无显着性差异(P>0.05),其余各治疗组均可降低心梗后大鼠心律失常的发生例数(P<0.01),葱白提取物组效果最为显着(P<0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠心律失常的发生时间、持续时间及发生率无显着性差异(P>0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可延长心律失常发生时间,减少持续时间和发生率(P<0.01),胺碘酮片组效果最为显着(P<0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠ST段抬高程度及Mest评分无显着性差异(P>0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可降低ST段抬高程度及Mest评分(P<0.05),葱白提取物组效果最为显着(P<0.01)。急性给药实验中,与空白模型组比较,葱白组及胺碘酮片组VT、VF的发生例数无显着性差异(P>0.05),其余各治疗组均可降低心梗后大鼠心律失常发生例数(P<0.01),葱白提取物组效果最为显着(P<0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠心律失常的发生时间、持续时间及发生率无显着性差异(P>0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可延长心律失常发生时间,减少持续时间和发生率(P<0.01),葱白提取物组效果最为显着(P<0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠心律失常的发生时间、持续时间及发生率无显着性差异(P>0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可延长心律失常发生时间,减少持续时间和发生率(P<0.01)。慢性给药实验中,与空白模型组比较,葱白组及胺碘酮片组VP、VF的发生例数无显着性差异(P>0.05),其余各治疗组均可降低心梗后大鼠心律失常发生例数(P<0.01),葱白提取物组效果最为显着(P<0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠心律失常的发生时间、持续时间及发生率无显着性差异(P>0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可延长心律失常发生时间,减少持续时间和发生率(P<0.01),葱白提取物组效果最为显着(P<0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠心律失常的发生时间、持续时间及发生率无显着性差异(P>0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可延长心律失常发生时间,减少持续时间和发生率(P<0.01)。2.运用miRNA芯片,我们列出了10对葱白提取物处理心梗后大鼠心肌细胞和无葱白提取物处理对照组大鼠心肌细胞中的miRNAs表达谱。散点图可被用于葱白提取物处理组和无葱白提取物处理组中的miRNAs不同表达的视觉评估。图中X轴和Y轴的值代表两组样本信号经标准化后的平均值(log2缩放),绿色直线为倍数变化线。图中央的绿线代表倍数变化(Fold Change)为1倍,表示两组样本之间无差异。位于最上方绿色直线以上和最下方绿色直线以下的miRNAs,表示其在两组样本之间的倍数变化大于1.5倍。散点图用于筛选出倍数变化在1.5倍以上的一般数据。火山图可被用于显示倍数变化和统计学意义之间的关系,更为直观的显示了葱白提取物处理组和无葱白提取物处理组之间miRNAs表达的显着差异。两条垂直绿线分别表示上调或者下调1.5倍,水平绿线表示P值为0.05,红色标识表示差异在1.5倍以上,且P值小于0.05具有统计学意义的miRNAs。mi RNAs芯片筛选出葱白提取物处理组大鼠心肌细胞中可逆性恢复的67个具有显着表达差异的miRNAs(FC>1.5,P<0.05)。其中,分别有16个miRNAs表达上调,51个miRNAs表达下调。上调最明显的miR-21及下调最明显的miR-15b-5p作为后续验证对象。在qRT-PCR对15组样本的验证中,与未使用葱白提取物的对照组相比,葱白提取物组大鼠心肌细胞中miR-15b-5p表达均显着减少(p<0.05),miR-21表达均显着增加(p<0.05)。miR-15b-5p及miR-21的表达水平均与其在miRNAs芯片中的表达趋势相一致。3.基于TargetScan数据库(7.0版)找出了与心律失常相关的miR-15b-5p的靶基因WNT3A以及miR-21的靶基因TGFβR2(图3.1)。在HEK293细胞中,分别过表达miR-15b-5p及miR-21,检测它们对含靶基因3’UTR的报告基因抑制情况。其中,miR-15b-5p明显抑制含有野生型(WT)WNT3A基因的3’UTR的报告基因表达(P<0.01),而对突变型(Mut)WNT3A基因的3’UTR的报告基因表达无明显差异;同样的,miR-21明显抑制含有野生型(WT)TGFβR2基因的3’UTR的报告基因表达(P<0.01),而对突变型(Mut)TGFβR2基因的3’UTR的报告基因表达无明显差异。在大鼠心梗后心肌细胞中分别敲低miR-15b-5p及过表达mi R-21后,与对照组相比,miR-15b-5p敲低组靶蛋白WNT3A表达水平上升,miR-21过表达组靶蛋白TGFβR2表达水平下降。结论1.辛温通阳中药葱白提取物可通过影响大鼠模型心梗后室性心律失常的发生类型、发生及持续时间、发生率和ST段抬高程度进而改善心梗后室性心律失常的发生发展。2.葱白提取物防治急性心肌梗死后室性心律失常的微小RNA作用机制主要与调节miR-15b-5p及mi R-21的表达有关,可能通过影响Wnt/β-catenin及TGF-β/Smad信号转导通路有关,其具体的调控机制有待进一步的深入研究。
李艺[9]2016年在《GS Rb1与IA对缺血缺氧心肌细胞的作用及机理探究》文中研究说明目的：1.通过培养乳鼠原代心肌细胞建立缺血缺氧模型,观察心肌细胞在缺血缺氧环境细胞损伤、凋亡与能量代谢变化情况。2.观察益气活血中药人参及毛冬青的主要有效成分人参皂苷Rb1(GS Rb1)及毛冬青甲素(IA)对缺血缺氧心肌细胞损伤及凋亡的影响,探讨GS Rb1与IA对缺血缺氧心肌细胞的保护作用。3.初步探索缺血缺氧心肌细胞中能量代谢AMPK-PGC-1a通路表达及腺苷酸生成情况,初步探讨人参皂苷Rb1(GS Rbl)与毛冬青甲素(IA)干预缺血缺氧心肌细胞的能量代谢途径,了解其对缺血缺氧心肌细胞的保护作用机制,为益气活血法用于心力衰竭的防治提供理论依据。方法：1.原代心肌细胞缺血缺氧模型的建立：选取新生SD乳鼠采集心肌组织消化成心肌细胞的单细胞悬液,正常培养72h后利用缺血培养液及物理缺氧方法分别对心肌细胞进行缺血缺氧30min、1h、2h、3h、 4h、6h、12h、24h造模干预。通过氧气含量指示剂确认缺氧水平,利用CCK8法检测细胞活力,光镜、电镜观察细胞损伤情况,建立缺血缺氧心肌细胞模型。2.GS Rbl与IA对缺血缺氧心肌细胞及线粒体的保护作用研究：正常培养乳鼠心肌细胞48h后将细胞分为11组：正常组、模型组、曲美他嗪组、参高组、参低组、毛高组、毛低组、参高毛高组、参高毛低组、参低毛高组、参低毛低组。正常组与模型组继续完全培养液正常放置培养箱内培养,给药组分别置换添加相应浓度药液的培养液继续培养24h,共培养72h。利用缺血缺氧造模方法对模型组及各给药组进行缺血缺氧造模干预6h,正常组继续正常培养6h。78h收集细胞进行检测。利用CCK8检测细胞活力、比色法检测LDH、FFA、MDA水平、倒置显微镜、电镜观察细胞损伤情况、TUNEL法检测细胞凋亡率、流式细胞仪检测mPTP开放情况。3.GS Rbl与IA干预缺血缺氧心肌细胞能量代谢的机制研究：首先探讨心肌细胞在缺血缺氧环境中能量代谢相关代谢变化情况。将细胞分为2组：正常组、模型组。利用前述实验方法对乳鼠心肌细胞进行培养造模及药物干预,利用western blot检测能量底物代谢相关蛋白AMPK、PGC-1a、PPARa、GLUT4、CPT-1、 ACADM和线粒体生成相关蛋白Tfam、NRF2蛋白表达水平。探究人参皂苷Rbl与毛冬青甲素干预后缺血缺氧心肌细胞上述能量代谢相关蛋白的表达情况,探讨两药干预缺血缺氧心肌细胞能量代谢的相关机制。将细胞分为10组,分别为模型组、曲美他嗪组、参高组、参低组、毛高组、毛低组、参高毛高组、参高毛低组、参低毛高组、参低毛低组。利用westernblot检测上述能量代谢相关蛋白表达情况。高效液相色谱法检测腺苷酸AMP、ADP、ATP含量。结果：1.原代心肌细胞缺血缺氧模型的建立：通过氧气含量指示剂确认在缺氧盒内心肌细胞达到缺氧要求。通过CCK8检测细胞活性曲线和光镜、电镜观察心肌细胞在缺血缺氧环境中各个时间节点形态学的改变,选取6h为缺氧造模时间点。模型组与正常组心肌细胞比较具有明显细胞损伤的形态学改变,搏动力显着下降,细胞活力明显降低,出现明显的衰竭心肌细胞表现,缺血缺氧心肌细胞造模成立。2. GS Rbl与IA对缺血缺氧心肌细胞及线粒体的保护作用研究：2.1.光镜观察：将心肌细胞进行分组给药后,倒置显微镜下可观察到缺血缺氧模型组心肌细胞出现明显细胞损伤表现,心肌搏动力明显下降,搏动频率减慢。曲美他嗪组较模型组心肌细胞活力明显增强,细胞形态未受明显影响,细胞搏动力与频率较正常组稍减,较模型组明显好转。人参皂苷Rbl与毛冬青甲素给药组细胞形态与搏动力均较模型组有改善,以人参皂苷Rbl高剂量与毛冬青甲素高剂量联用组心肌细胞保护作用最显着,两药剂量与细胞保护效力呈量效关系。2.2.电镜观察：通过电镜下分析各分组给药心肌细胞形态与各细胞器、线粒体形态,人参皂苷Rbl与毛冬青甲素干预组与曲美他嗪组细胞损伤程度较模型组均有不同程度改善,线粒体功能与完整性得到保护,并发现人参皂苷Rbl与毛冬青甲素高剂量联用组抗缺血缺氧损伤效用与曲美他嗪作用相似,同时电镜分析说明人参皂苷Rbl与毛冬青甲素在单药与联用对缺血缺氧心肌细胞的保护作用均存在量效关系,人参皂苷Rbl高剂量与毛冬青甲素高剂量单药作用相似。2.3.细胞活力检测：通过CCK8法检测细胞存活率显示,模型组与正常组相比细胞存活率明显减低。模型组与药物干预组对比,各给药干预组细胞存活率均有一定程度提高,两药联用组较单药组有更高效用,参高毛高组具有最明显作用,显着地改善了缺血缺氧心肌细胞的细胞损伤。2.4.细胞损伤相关指标：LDH、FFA、MDA检测显示：模型组与空白组对比LDH、FFA、MDA均明显上升,缺血缺氧后细胞损伤模型建成。各给药干预组与模型组对比,LDH、FFA、MDA含量均明显降低。各给药干预组对减低细胞内LDH、FFA、MDA均有一定作用,作用分别呈量效关系。人参皂苷Rbl高低剂量均能够明显降低LDH含量,且呈量效关系。毛冬青甲素高剂量可降低LDH含量。两药联用组能够明显降低LDH,且作用较人参皂苷Rbl与毛冬青甲素单药明显,呈量效关系,参高毛高组具有最优效用。参高毛高组在降低胞内FFA有最优效用(P<0.01)。在给药干预组与模型组的对比中,各个给药组MDA含量与模型组有非常大的差异,P<0.01,有统计学意义,说明各个给药组都对缺血缺氧心肌细胞氧化损伤有治疗作用。在曲美他嗪组分别与参高组、参低组、参高毛高组、参低毛低组、参低毛高组的两两比较中无统计学差异。说明这5组对MDA指示的细胞过氧化损伤与曲美他嗪治疗效应相似。2.5. MPTP开放检测：利用钙黄绿素-AM (Calcein-AM)对细胞质、线粒体进行染色,再通过氯化钻与细胞质内钙黄绿素发生反应荧光猝灭,分析得线粒体通透性转移孔mPTP开放情况,从而得到在造模干预情况下细胞线粒体功能状态。模型组荧光表达较正常组相比明显下降,曲美他嗪组与参高毛高组比较相近,说明两者在抑制线粒体通透性转移孔开放方面具有相近效用。人参皂苷Rb1与毛冬青甲素对抑制mPTP开放调控的作用均呈量效关系。各药物干预组与模型组对比均具有非常显着的差异,说明各给药组对缺血缺氧心肌细胞线粒体膜损伤均有改善作用。2.6.细胞凋亡：在TUNEL法检测细胞凋亡率中,模型组凋亡率与正常组对比明显上升,说明缺血缺氧造模后对心肌细胞凋亡的影响巨大,能够明显地发挥促凋亡作用。与模型组相比,曲美他嗪组及参高组、参低组、毛高组、人高毛高组、人高毛低组、人低毛高组都均有明显降低细胞凋亡率的作用,说明人参皂苷Rb1与毛冬青甲素联用及人身皂昔Rb1与毛冬青甲素单用对抑制细胞凋亡均具有显着作用。3.GS Rb1与IA干预缺血缺氧心肌细胞能量代谢的机制研究：3.1.能量代谢通路蛋白表达：观察各分组心肌细胞在缺血缺氧环境中能量代谢相关蛋白表达,模型组AMPK、PPARa、PGC-la、CPT-1、ACADM、NRF2、Tfam与正常组对比均有不同程度下降,Glut4蛋白表达量在造模后无明显变化。在给药后,曲美他嗪组与参高毛高组AMPK表达量明显高于其余各给药组,且参高毛高组蛋白表达量高于曲美他嗪组,P<0.01,结果具统计学意义。本次实验中未发现各药物对PPARa蛋白表达有明显促进作用。与模型组对比,参高组、参低组与模型组对比能够明显提高缺血缺氧心肌细胞PGC-la蛋白的表达量,两两对比P<0.01,差异具有统计学意义。参高毛高组、参高毛低组与模型组对比均有明显差异,都能够上调PGC-la蛋白表达量,P<0.01,结果具有统计学意义。参高组、参低组和参高毛高组、参高毛低、参低毛高、参低毛低组两两比较、存在量效关系,P<0.01,说明人参皂苷Rb1与毛冬青甲素联用对PGC-la表达量有明显促进作用,且与药物浓度密切相关。曲美他嗪能够明显降低缺血缺氧心肌细胞CPT-1蛋白表达,P<0.01,差异具有统计学意义。与模型组两两相比,参高组、毛高组、参高毛高组、参低毛高组对CPT-1蛋白表达有负性作用,P<0.01,结果具有统计学意义。各给药组与模型组对比蛋白表达趋势均有下降,说明人参皂苷Rb1与毛冬青甲素无明显促进脂肪酸代谢作用。除参低毛高组外,各给药组对ACADM均无明显促进或抑制作用。曲美他嗪组GLUT4蛋白表达量上可见明显升高,与模型组对比P<0.01,具有统计学意义,说明曲美他嗪能够显着地上调GLUT4蛋白表达,促进机体转运利用葡萄糖进入线粒体氧化功能。与模型组对比,参高组、参低组、毛高组、参高毛高组、参高毛低组与模型组两两比较均有明显促进作用,P<0.01,具有统计学意义。说明这几组药物配比与浓度可明显增加GLUT4蛋白表达量。参高毛高组与其他药物干预组两两比较p值均<0.01,具有统计学意义。参高毛高组在促进GLUT4蛋白表达与葡萄糖代谢中具有最优效用。在与模型组的两两比较中,各给药干预组均能够明显地上调NRF-2蛋白表达量,P<0.01,具有统计学意义。人参皂苷Rb1与毛冬青甲素对NRF-2蛋白有明显激活效用,曲美他嗪组与参高组、参低组、毛高组、参高毛高组、参高毛低组、参低毛高组两两比较结果无统计学意义,该几组具有相似的促进NRF-2蛋白表达作用。参高毛高组与其余各给药干预组的对比中P<0.0l,具有统计学意义,说明参高毛高组能够显着地促进NRF-2蛋白表达,在各组中具有最优效用。与模型组的比较中,各给药干预组均能够提高缺血缺氧心肌细胞Tfam蛋白的表达,P<0.01,且与正常组比较均有明显的调高现象,考虑与应激性药物刺激蛋白及线粒体的快速合成有关。在给药干预组中,参高毛高组与其他各给药组两两比较P<0.01,具有统计学意义。说明人参皂苷Rbl与毛冬青甲素高剂量配伍给药具有最优效用。3.2.高能磷酸化合物生成：观察各分组心肌细胞在缺血缺氧环境中能量代谢产物生成情况,模型组与正常组比较AMP含量明显增加,ADP、ATP含量显着下降,叁者与正常组比较P<0.01,具有统计学意义在给药组与模型组AMP含量的两两比较中,各给药组都在一定程度上降低了缺血缺氧环境下心肌细胞AMP的含量,P<0.01,具有统计学意义。在降低AMP含量方面,参高毛高组、参高毛低组、参低毛高组能够明显降低AMP的效用。在给药组与模型组ADP含量的比较中,发现各给药干预组ADP含量均有升高,P<0.01,具有统计学意义。其中,曲美他嗪组与参高毛高组ADP含量无统计学意义,P<0.05,说明二者具有相似的升高ADP含量的作用。余组与ADP含量的提高大致呈量效关系。在给药组与模型组ATP含量的比较中,曲美他嗪组、参高组、参低组、参高毛高组、参高毛低组、参低毛高组均有明显提高ATP含量的作用,P<0.01,结果有统计学意义。毛高组、毛低组、参低毛低组在趋势上对促进ATP生成有一定表现,但与模型组比较P<0.05,无统计学意义。结论：1.心肌细胞缺氧1h起即出现缺氧损伤表现,以缺血缺氧6h为造模条件制备心肌细胞缺血缺氧模型成立。2.人参皂苷Rbl及毛冬青甲素对保护缺血缺氧心肌细胞形态学完整性、降低凋亡率、减少细胞脂质沉积、减轻脂质过氧化损伤、减少线粒体通透性转移孔的开放保护线粒体功能等都有明显作用。单药组中人参皂苷Rbl对心肌细胞的保护作用总体优于毛冬青甲素。3.AMPK-PGC-1α通路可能是调节缺血缺氧心肌细胞能量代谢的关键通路。人参皂苷Rbl与毛冬青甲素都能够明显激活AMPK-PGC-1α通路,刺激葡萄糖代谢与线粒体生成。人参皂苷Rbl能够降低AMP含量,促进ADP、ATP生成,改善缺血缺氧心肌细胞能量代谢。毛冬青甲素能够降低AMP含量,促进ADP生成,对ATP生成无明显作用。4.人参皂苷Rbl与毛冬青甲素高剂量联用在保护缺血缺氧心肌细胞形态学完整性、降低凋亡率、减少细胞脂质沉积、减轻脂质过氧化损伤、减少线粒体通透性转移孔的开放保护线粒体功能的作用方面较人参皂苷Rbl高剂量、毛冬青甲素高剂量明显提高,两药联用具有最优效用。其可能的机制是通过两药共同作用于AMPK-PGC-la能量代谢通路,促进葡萄糖氧化代谢、抑制脂质过氧化和促进腺苷酸合成。
冷怀明[10]2002年在《《第叁军医大学学报》2002年第24卷主题词索引》文中提出外文字母、数字1 2 5Ｉ标记1 2 5Ｉ-ＲＧＤ - 4ＣＹ肿瘤αｖβ3受体显像的实验研究 (李前伟等 ) 2 4(1 1 ) :1 340 - 1 3421 甲基 4 苯基吡啶ＭＰＰ+ 对体外培养的中脑多巴胺能神经元活性的影响 (陈锦华等 ) 2
参考文献：
[1]. 利用bcl-2基因治疗慢性充血性心力衰竭的实验研究[D]. 张万义. 中国人民解放军军医进修学院. 2004
[2]. DAA-Ⅰ与丹参素抗心衰大鼠心肌细胞凋亡的机制研究[D]. 麦瑞林. 暨南大学. 2009
[3]. 功能基因群调控慢性充血性心力衰竭气虚证的机制研究[D]. 陈金星. 北京中医药大学. 2003
[4]. 温阳化饮、益气活血法防治充血性心力衰竭的实验研究[D]. 杨华升. 黑龙江中医药大学. 2003
[5]. 开心胶囊Ⅰ号对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡调控作用的实验研究[D]. 赵锋利. 广州中医药大学. 2000
[6]. 联合钙离子ATP酶2a和骨髓干细胞移植治疗心力衰竭的研究[D]. 郭豫涛. 中国人民解放军军医进修学院. 2005
[7]. 作者索引[J]. 佚名. 第四军医大学学报. 2002
[8]. 辛温通阳法治疗心梗后室性心律失常的疗效评价及其基于微小RNA的机制研究[D]. 朱浩. 湖北中医药大学. 2018
[9]. GS Rb1与IA对缺血缺氧心肌细胞的作用及机理探究[D]. 李艺. 广州中医药大学. 2016
[10]. 《第叁军医大学学报》2002年第24卷主题词索引[J]. 冷怀明. 第叁军医大学学报. 2002
标签：心血管系统疾病论文; 心肌细胞论文; 充血性心力衰竭论文; 慢性心力衰竭论文; 基因治疗论文; 缺氧症状论文; 基因合成论文; 心肌损伤论文; 丹参素论文; bcl-2论文; 丹参论文; 药品论文; chf论文;