吕玲玲[1]2003年在《豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因转化花椰菜的研究》文中研究表明关于B．t基因转化花椰菜已有不少报道，但很少有将CpTI基因转化花椰菜的研究报道。本实验以花椰菜为试材，通过植物基因工程获得抗虫转基因植株，主要的工作和结果如下： 1．花椰菜高频再生体系的建立 以4-7天花椰菜的子叶，下胚轴为外植体，MS为基本培养基，通过加入不同浓度和不同组合的6-BA，NAA，筛选出外植体不定芽分化的最适培养基(MS+BA2.0mg／L+NAA0.2mg／L)，并比较了两种不同外植体的分化能力，下胚轴的分化频率高于子叶。 2．花椰菜外植体对卡那霉素(Kan)的敏感性分析 在分化培养基中加入浓度为10mg／L的Kan时，外植体形成愈伤组织明显受到抑制，形成的愈伤组织也部分死亡；当Kan加入浓度为15mg／L时，外植体及形成的愈伤组织全部逐渐白化死亡；当浓度为30mg／L时，外植体未形成愈伤组织就白化死亡，因此以15mg／L Kan作为外植体的筛选压。 3．花椰菜外植体高频转化体系的建立 在最适培养基上试验了预培养时间、感菌时间、共培养时间等转化条件，建立了花椰菜外植体的高频转化体系：4-7天的子叶和下胚轴外植体，再生培养基上预培养3天，在用YEB液体培养基稀释10倍的菌液中感菌30-60秒，共培养2天后，立即转入含Carb的脱菌培养基(MS+6-BA2.0mg／L+NAA0.2mg／L+Carb500mg／L)中培养7-10天抑制农杆菌的生长，然后转入含Kan的筛选培养基(MS+6-BA 2.0mg／L+NAA0.2mg／L+Kan15mg／L+Carb300mg／L)中筛选抗性愈伤组织和抗性芽，每两周换一次培养基。逐渐降低Carb的浓度。经多次继代培养，淘汰未转化的“假转化体”，得到具有Kan抗性的转基因植株。 4．转基因植株的鉴定 提取转基因植株的总DNA，对其进行PCR扩增，大部分转化植株呈阳性，而非转化植株呈阴性；对PCR阳性植株进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析，转化植株都有特异杂交带，而对照无特异杂交带，结果证明CpTI基因已被整合到花椰菜的基因组中。同时对转化植株进行初步的离体叶片饲虫试验，结果显示转化植株具有一定的抗虫性。
吕玲玲, 雷建军, 宋明, 曹必好, 陈国菊[2]2004年在《豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化花椰菜的研究》文中指出通过根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入花椰菜无菌苗的下胚轴和子叶中,卡那霉素(Kan)的筛选质量浓度为15 mg/L,抑制农杆菌生长的抗生素选用羧苄青霉素(carbencillin),质量浓度为500mg/L.对所获得的转基因植株进行PCR扩增,结果显示大多数为阳;PCR-Southern及Southern分子检测分析,结果证明CpTI基因已被整合到花椰菜植株的基因组中.转基因植株叶片的离体饲虫初步试验结果表明,对鳞翅目害虫菜青虫的生长发育有一定的抑制作用.
吕玲玲, 雷建军, 宋明, 李立云, 曹必好[3]2004年在《抗虫基因转化花椰菜的研究(英文)》文中研究说明通过根癌农杆菌介导,将抗虫基因-豇豆胰蛋白酶抑制剂(CowpeaTrypsinInhibitor,简称CpTI)基因导入花椰菜无菌苗的下胚轴和子叶中。卡那霉素(Kanamycin,简称Kan)的筛选浓度为15mg/L,抑制农杆菌生长的抗生素选用羧苄青霉素(Carbencillin,简称Carb),浓度为500mg/L。对所获得的14株Kan抗性植株进行PCR扩增,结果显示有8株为阳性;对PCR阳性植株进行Southern分子杂交检测,结果证明CpTI基因已被整合到花椰菜植株的基因组中。
马炳田[4]2001年在《基因工程改良杂交籼稻的抗虫性》文中指出水稻(Oryza sativa L)是重要的粮食作物之一，全世界有近半数的人口以稻米为主食。在我国，水稻年播种面积在3000万公顷以上，其中杂交稻的播种面积占50％左右，达1600多万公顷，部分省市如四川、江西杂交稻占90％以上。虫害是影响水稻高产稳产的重要因素之一。目前常采用化学防治，但效果不理想，还带来环境污染、杀灭天敌和人畜危害等问题。农业技术措施及生物防治也不能有效控制水稻害虫的为害。实践证明，抗虫品种的应用是最为经济有效的办法。常规育种由于受到种质资源稀少和生殖隔离的限制，至今还未解决水稻的抗虫性。植物转基因技术的出现和成熟，为我们解决这个问题提供了一种有效的途径。 本研究通过基因枪或农杆菌转化法将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck、修饰的CryIA(C)毒蛋白基因(sbk)、雪花莲凝集素基因(gna)等转入了优良叁系杂交稻恢复系SH527、SH163、保持系D62B、D297B、D702B、两系恢复系W2008、两系不育系612S等亲本材料中，获得196个独立的无性系(T0)。以籼稻为受体时基因枪转化法的绿苗获得率为0.93％，高于农杆菌转化法(0.32％)，但总体上转化籼稻比较困难。为此，我们筛选并建立了一套包括叁系、两系亲本在内的易于组培的转基因中间受体系统(SH527、D297、BW2008、612S)，最高绿苗获得率可达2.41％。 分子证据和选择标记基因抗性筛选证明外源基因在转基因植株中能够稳定遗传，有的已传递到第四代(T3)并纯合；目的基因与选择标记基因一般为共整合到受体基因组中，在后代中共遗传，并能正确表达，少数植株发生目的基因丢失现象。通过抗性基因聚合和杂交稻的配组发现外源基因的遗传和表达特性能够通过常规杂交转移到其他材料或杂交稻中。获得抗性基因聚合的转基因植株，但外源基因载体结构相同会导致转基因表达减弱。 田间或室内抗虫性鉴定表明转基因植株抗虫性得到提高。在室内用转sck，sbk基因D62B、W2008、SH527等的蛋白粗提物浸泡的饲料饲喂玉米螟12天后，平均虫重在15-22mg；未转基因植株蛋白粗提物处理的饲料喂虫后的虫重却有28-30mg，不用植物蛋白粗提物处理的饲料喂虫的虫重达37.60mg。在田间，基因枪转化法获得的转sck基因SH527的感虫分蘖率为15.31％、转sbk基因的为10.54％，对照为35.60％。同样，转sck基因的W2008的感虫分蘖率为24.28％、转sbk基因的为22.29％，对照为40.89％。 转基因的插入和组培过程可能导致受体的一些农艺性状的变异，但绝大多数是不可遗传的，在后代中能够恢复，仅少数为不可逆变异。转gna SH527当代(T0)植株株高仅有66.7cm，而相应的组织培养苗株高为84.0cm，种子实生苗株高为107.3cm；到T1代及T2代，转基因植株的株高与对照相当。转sckW2008的T0代植株在单株分蘖数、株高、穗长、穗粒数、结实率、千粒重等农艺性状上都明显低于未转基因的对照植株。到T1、T2代时，转基因植株与对照植株差异不明显。但转bac(sbk+sck)基因的612S未获一粒种子。 用转Sob基因纯合SH527一个单株作父本与二个不育系（G46A、D62A、D702A）配组的杂交稻的 感虫株率分别为 20％、50％、75％，对照为 80％、85％、80％；感虫分桑率分别为 6．15％、5二8％。 13．70％，对照为18。30％、14．96％、14．13％。考种结果发现转基因杂交稻与相应对照在株高、单株平 均分孽数、平均穗长、结实率、干粒重等主要农艺性状无明显差异。 为了避免选择标记基因给转基因植物带来的担忧，我们首次利用在体外构建的能去除选择标记 基因的“双T－DNA”单子叶植物表达载体系统转化水稻。在转基因植株中，目的基因与选择标记基 因共转移频率为58．旧％：在两个共转移单株的川代中，获得无选择标记基因的转抗虫基因水稻植 株的频率为 20．83O和 18．420。 外源基因在转基因植株中经常发生表达不稳定或沉默现象，严重影响转基因植物的开发与应用。 核基质结合区（MARS）能提高并稳定外源基因在转基因植株中的表达。为此，我们首次利用含豌豆 MARs序列的单子叶植物表达载体转化水稻。在转基因川代中，含MARs的转sob基因W2008、 SH527的日的基因表达活性与不含 MARS的转SCk基因植株相比，分别提高25．25％和 22．40％。含 MARS转基冈＊2008、SN父7个体的表达活性差异分别是最高为最低的2．82倍和4．16倍，相应的不 含 MARS的转基因的为 7．96倍和 11．53倍。
参考文献：
[1]. 豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因转化花椰菜的研究[D]. 吕玲玲. 西南农业大学. 2003
[2]. 豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化花椰菜的研究[J]. 吕玲玲, 雷建军, 宋明, 曹必好, 陈国菊. 华南农业大学学报. 2004
[3]. 抗虫基因转化花椰菜的研究(英文)[J]. 吕玲玲, 雷建军, 宋明, 李立云, 曹必好. Agricultural Science & Technology. 2004
[4]. 基因工程改良杂交籼稻的抗虫性[D]. 马炳田. 四川农业大学. 2001