虞宏宇 北京中学 100018
摘要
CRISPR/Cas9技术主要利用了向导RNA和Cas9蛋白的复合体进行目的DNA片段的识别与剪切，虽然其极大地方便了基因编辑，但其也存在一定的局限性，如对目标DNA片段依然有选择性、存在脱靶现象。对此，本文利用了CPT1A基因进行CRISPR/Cas9作用和效率的检验。在研究中将搭载有CPT1A基因和CRISPR/Cas9对应序列的质粒导入了293T细胞系。通过对比，发现有部分细胞并未编辑成功。说明CRISPR/Cas9技术的效率会受一定因素的影响，在本文中进行了对这些影响因素的进一步探讨，并结合前人的研究在讨论部分分析了编辑失败的可能原因。通过进行原因分析，可以在一定程度上提高CRISPR的编辑效率。
关键词：CRISPR/Cas9、基因编辑效率、脱靶、CPT1A基因
1 引言
CRISPR是在细菌体内发现的一种天然的免疫方式，对于大部分具有特异性识别能力的CRISPR序列来说，它们的作用机理都是相似的。当拥有CRISPR基因的细菌识别到外来病毒入侵后，会识别这段外源DNA，并将其中的片段插入到CRISPR序列中的重复序列区之间，插入的片段称为间隔区。随后，CRISPR基因及相关基因被转录，产生crRNA和tracrRNA，连接形成tracrRNA/crRNA复合物，再与能进行DNA切割的Cas蛋白相连接，形成复合物。通过碱基互补配对，复合物可以识别并结合在外源DNA上，通过结构域的作用进行DNA的切割，从而达到使外源DNA突变而无法表达的目的。
在真正使用CRISPR/Cas9技术进行特定基因编辑的时候，通常会将crRNA和tracrRNA直接进行连接，称为向导RNA，连同Cas9转入目的细胞。通常为了提高稳定性并延长影响的时间会转入DNA而非RNA或者蛋白，因此就需要前期将向导RNA对应的DNA序列连在质粒上，并随连有Cas9蛋白DNA的质粒一同转入。在进行切割后，可以利用同源重组（HR）技术或者非同源性末端结合（NHEJ）在损伤的部位进行特定片段的加入或删除，完成DNA的剪辑。
不过虽然CRISPR/Cas9技术的出现极大地推进了基因编辑技术的发展，其依然有一定的局限性，如脱靶效应等在编辑过程中依然有很大概率发生。针对此，本实验进行了CRISPR/Cas9技术对特定基因编辑效率的研究。本研究中选用的靶基因是CPT1A，与线粒体的脂肪酸代谢有关，是代谢途径中的限速酶。
在本研究中，为了确定CRISPR/Cas9对于CPT1A基因的编辑效率，需要将CRISPR/Cas9所需的向导RNA和Cas9蛋白以及CPT1A转入细胞内，从而使得基因编辑得以发生。
在实验前期通过PCR、酶切、退火等方法可得到拥有相同粘性末端的DNA和质粒载体。之后使用DNA连接酶将DNA和质粒连接后，就分别获得了搭载有CPT1A基因和CRISPR/Cas9基因的载体。
通过将质粒导入感受态细胞进行目的质粒的扩增，此后进行对293T细胞系的转染。由于被成功切割的CPT1A质粒会导致断裂处的修复，使原本处于CPT1A两端的GFP基因相连接，从而发出荧光。因此，通过在荧光显微镜下观察细胞是否产生荧光就可以判断编辑是否成功。
2 实验方法
2.1 搭载靶基因载体的制备
先对靶基因（CPT1A）进行PCR，之后酶切，使用BamHI-HF/EcoRV-HF两种内切酶切割基因组的扩增产物和pCAG-EGxxFP原质粒。过夜后电泳分离出目的片段，胶回收。测量获得溶液中两种DNA的浓度比例，按比例加入等摩尔数的DNA分子，并加入solution I和水，等待40min，进行连接。对之后的CRISPR/Cas9序列和PX459原质粒进行相似操作，进行连接后就能获得两种分别搭载有CPT1A和CRISPR体系的载体。
2.2 菌落的筛选及载体的扩增
热激感受态细胞，破坏膜通透性，之后将配置好的载体导入感受态细胞，并在37°C下培养感受态细胞30min。此后挑单菌落进行菌落PCR和电泳，筛选出含有目的质粒的菌落，将合格的菌落加入摇菌管中，放入摇床进行摇菌扩增。
2.3 扩增后质粒的提取
将扩增完的菌液移入离心管，离心获得沉淀。向离心管中依次加入Buffer P2、Buffer NP3，混匀，倒入HiPure DNA Column，放在离心管里，离心过滤后倒掉废液。依次加Buffer PW1、Buffer PW2、Buffer PW2洗脱。最后加入Elution Buffer，离心过滤后拿掉吸附柱。进行提取液浓度测量，测好后标记在离心管上。
2.4 细胞转染
最后进行细胞转染，将两种载体导入293T。前期根据浓度计算出体系中各类溶液所需的量。之后取离心管，配置培养板中所需的溶液量，加入CPT1A、向导DNA以及一定量的DMEM培养基。向含有293T细胞系的细胞培养板中加入50μl的培养基，并移入之前离心管中的试剂，同时还要加入GFP作为对照组。放回37°C的培养箱，开始转染。
3 结果分析
在实验中共有三组使用了不同转染试剂的对照组。A组只加入了CPT1A质粒，而没有guide DNA，这就导致CPT1A基因不可能被切割，所以预测结果不会有荧光产生，而事实也与此相符（图1 A组），证明CPT1A质粒自身对实验结果没有影响，不会在未经任何编辑的情况下产生荧光。C组只加入了GFP，即绿色荧光蛋白，预测结果应该是所有细胞均产生荧光，图片与此符合（图1 C组），证明细胞中并不存在会影响绿色荧光蛋白表达的因素，表达后能直接被观测到。B组是实验组，既加入了CPT1A质粒又加入了guide DNA质粒，因此在细胞中应会有荧光产生。根据图像（图1 B组），确实有一部分细胞被成功编辑了，但是依然有部分细胞没有发出荧光，表明编辑失败。因此得到在实验中使用的guide DNA能与Cas9蛋白结合进行基因编辑，但是依然有因素影响了基因编辑的过程，致使部分样本未能达到预期结果。
4 结论
CRISPR/Cas9技术能进行有效的基因编辑
1. 在实际应用CRISPR/Cas9技术时有其他因素会影响其编辑效率
2.
5 讨论
在使用基因编辑的过程中，主要分为两个步骤——损伤DNA双链以及利用细胞内的修复机制进行对损伤位置进行操作。目前实现精准损伤DNA双链形成DSB的有三种技术，分别是ZFN、TALEN、以及本实验中使用的CRISPR。通过形成DSB可成功诱导细胞内修复机制的发生，从而实现靶基因的编辑，包括HR和NHEJ两种途径。如果要完成成功的基因编辑，上述的两个过程都必须成功完成。因此，编辑失败不仅可能是由于CRISPR系统的错误，也有可能是因为修复过程并未能按照预期进行。
此处主要讨论CRISPR/Cas9系统可能导致的脱靶效应。脱靶效应所指的是向导RNA（sgRNA）对靶基因识别错误，导致编辑在错误的位置发生。具体来说可以分为两类，一类是由于基因组上存在与靶基因相同的序列，导致Cas9蛋白在错误位置结合，另一类是由于sgRNA在识别靶基因时出现了错配，并未与靶基因结合。其中第二类由于sgRNA错配导致的脱靶效应是导致基因编辑失败的重要原因。在sgRNA以及Cas9蛋白识别靶基因序列的过程中，必须完全配对的只有临近PAM序列的7-12个左右碱基对的seed sequence，所以就导致了在识别过程中可以容忍多个碱基对的错配，有研究表明在体外细胞中错配数可达到7个碱基对。对于细菌来说，这种对于外源DNA的错配允许实际上增强了细菌免疫的灵活性，提高了细菌的生存比例。但也因此造成实际的sgRNA可以识别并结合的DNA位点就远远多于与sgRNA一样的DNA序列数。
CRISPR/Cas9错配的另一原因是其作用机制，在结合时CRISPR/Cas9系统是直接形成最终进行剪切的构型，产生封闭的R-loop，也就表明结合是单向、不可逆的，且是整段sgRNA序列同时配对。相比之下，晚于CRISPR/Cas9系统被发现的CRISPR/Cas12型系统在进行配对时是先形成半封闭的R-loop，之后进行逐个碱基的识别与配对，当核对无误后才会形成最终封闭的R-loop。
参考文献
[1]Hsu PD, Lander ES, Zhang F: Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. CELL 2014, 157,1262-1278.
[3]李辉, 施振旦. CRISPR/Cas9新型基因打靶系统的研究进展[J]. 江苏农业学报, 2013, 29(4):907-911.
[4]贾良杰. CRISPR/Cas基因组靶向编辑技术综述[J]. 中国医药导报, 2014(22):154-156.
[5]李和刚, 杨峰, 张宝珣, et al. CRISPR/Cas9技术研究进展[J]. 中国畜牧杂志, 2015, 51(21):86-91.
[6]Teng, F., Cui, T., Feng, G., Guo, L., Xu, K., Gao, Q., ... & Li, W. (2018). Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering.Cell discovery, 4(1), 63.
[7]Wu, X., Scott, D.A., Kriz, A.J., Chiu, A.C., Hsu, P.D., Dadon, D.B., Cheng, A.W., Trevino, A.E., Konermann, S., Chen, S., et al. (2014). Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnol. Published online Apr 20, 2014.
[8]于文琪(综述), 王雅梅(审校). 染色质 DNaseⅠ超敏感位点的定位及其转录调控功能的研究进展[J]. 医学研究生学报, 2015(6).
[9]郭全娟, 韩秋菊, 张建. CRISPR/Cas9技术的脱靶效应及优化策略[J]. 生物化学与生物物理进展, 2018(8).
[10]Pattanayak V, Lin S, Guilinger J P, et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology, 2013, 31(9): 839-843 DOI:10.1038/nbt.2673
[11]冯红, 董阁, 雍彬, et al. 原核CRISPR-Cas系统的结构功能及应用[J]. 四川师范大学学报(自然科学版), 2014, 37(2):268-281.
[12]郑小梅, 张晓立, 于建东, et al. CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的研究进展[J]. 生物技术进展, 2015(1):1-9.
[13]Carroll, D. Staying on target with CRISPR-Cas. Nat. Biotechnol. 31, 807–809 (2013).
论文作者:虞宏宇
论文发表刊物:《科技新时代》2019年2期
论文发表时间:2019/4/10
标签：基因论文; 质粒论文; 编辑论文; 细胞论文; 序列论文; 技术论文; 荧光论文; 《科技新时代》2019年2期论文;