张慧敏 陈丽群
（赤峰市传染病防治医院 内蒙古 赤峰 024000）
【摘要】 目的：研究赤峰市及周边地区丙型肝炎病毒 (HCV)基因型的流行病学特点。方法：采用INNO LIPA反向线形探针杂交法,对来自赤峰市及周别地区719例慢性丙型肝炎患者进行了HCV基因型调查。结果：719例患者中丙肝基因型分布如下：1b型359例，2a型347例，2i型6例，3a型2例，3b型2例，1a型2例，2r型1例。结论：静脉药瘾或毒品注射是赤峰市及周边地区丙型肝炎的重要传播途径。
【关键词】 肝炎病毒；丙型；基因型；感染控制
【中图分类号】R18 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）15-0388-02
在我国,丙型肝炎病毒(HCV)是肝病的重要致病源,由于HCV的复制所依赖的多聚酶缺乏校对功能,加上为适应环境逃避宿主免疫监视作用易发生突变,在长期的演化过程中产生了许多基因变异株[1]。从1989年Choo等首次克隆丙型肝炎病毒(HCV)以来,世界已对数十株HCV进行了克隆和测序,发现HCV变异较大,存在多种基因型。HCV不同基因型与HCV感染的地区分布、临床表现、预后及对干扰素等抗病毒药物治疗的反应可能具有某种相关性[2]。因此对不同地区的HCV基因型进行深入研究具有其实用价值。
1.材料与方法
1.1 调查对象
收集2011年11月至2015年12月在我院就诊的门诊及住院丙型肝炎患者共719例，按 1995 年第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准 其中男：415例，女304例，年龄分组中25岁以下3例，26～35岁28例，36～45岁85例，46～55岁230例，56～65岁298例，65岁以上75例。输血史35例（4.86%），毒品注射史346例（48.10%），纹身4例（0.56%），穿耳孔3例（0.40%），手术史91例（12.65%），拔牙32例（4.45%），感染途径不详208例（28.98%）
1.2 仪器与试剂
病毒RNA纯化试剂盒（艾康生物），RrvetTta Ace qPCR RT Kit(TOYOBO),dNTP(10mM)、Mgcl2(25mM)、Ex Taq(5U/μl)、DL2000Matktt、1%TAE、6%Loading Buffer等均由TAKARA公司提供，GeIRed由Bictamn提供，琼脂糖由BIOWEST提供。普通低速离心机（Anke TDLSO-2B）,漩涡震荡仪（VWR Mittivertecer）,高速冷冻离心机（Sigms JK15）,生物安全柜（Biotise）。
1.3 方法
(1)逆转录及第一次 PCR扩增:提取的 RNA加入 AMV - RT5U、RNasin20U、Taq酶 2U、2mMdNTP3μl, 10x AMV- RT缓冲液3μl。型共同性引物 P1及P2终浓度分别为0.8μmol/L,总体积 30μl。42℃逆转录 20min后接第 1次扩增 ,反应条件为 94℃ 60min→ 55℃ 90min→ 72℃ 120min,35个循环。(2)第 2次 PCR扩增: 第1次PCR扩增产物5μl加入10×AMV- RT 缓冲液3μl、2mMdN TP3μl、 Taq酶2U。型特异性引物 P 3 及 P 4,5,6,7 终浓度分别为0. 8μmol/L,总体积 30μl。反应条件为94℃ 60min→ 60℃ 60min→72℃ 90min, 30个循环, 72℃延伸 5min。每次扩增均设HCV RN A阳性血清对照和阴性对照 (未加模板 )。(3)第 2次 PCR扩增产物 10μl在 6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳,溴乙锭染色后在紫外灯下观察橙红荧光带,判断结果。HCV-Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 型的扩增产物长度分别为 57bp、144bp、174bp及123bp。
2.结果
2.1 丙型肝炎病人HCV基因分型结果
719例患者中丙肝基因型分布如下：1b型359例，2a型347例，2i型6例，3a型2例，3b型2例，1a型2例，2r型1例。
2.2 丙型肝炎及病人HCV基因分型结果 (见附表)
各组基因分型构成比经χ2检验无显著性差异,P>0.05。719例丙肝病人中52.96%（381/719).具有静脉药瘾或毒品注射、输血或使用血制品的历史。
表 丙型肝炎中 HCV基因型别分布
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3.讨论
随着分子生物学、免疫学技术的进步, HCV 依其基因序列的差异, 可分为不同的基因型,其型别的分布又有一定的地区性差异。同时,HCV 基因型与疾病程度、治疗应答、感染转归等存在一定关系[3]。为了解赤峰市及周别地区HCV基因型别分布,我们对赤峰市及周边地区719 例抗-HCV阳性血清用套式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测 HCV RNA,对阳性者用限制性内切酶进行基因分型研究。目前通过对丙肝病毒基因型的检测，发现丙肝病毒至少有6个基因型及50种亚型，分布于全世界各地区，丙肝病毒基因型的分布有一定的区域性。通过对丙肝病毒基因型的检测研究认为，丙肝病毒1b型致病性强，易致慢性化，且干扰素疗效较差及与肝癌的发生有一定的关系。而对于丙肝病毒2a、2b型干扰素疗效相对较好。另外通过丙肝病毒基因型的检测分析可发现两种或两种以上基因型的丙肝病毒混合感染，混合感染者患病较单亚型感染者为重，对于干扰素反应相对较差，因此对丙肝病毒基因型的检测分析有利于了解丙肝病毒在世界的分布情况，判断疾病的预后及治疗效果有一定的临床意义。但是丙肝病毒基因型的检测对丙肝病毒感染的诊断意义不大。主要感染途径为毒品注射史（包括少数静脉药瘾者和大部分短期或偶尔毒品注射者，所应用毒品为安纳加）[4]。HCV-RNA水平与基因型无关系。静脉药瘾或毒品注射为主要感染途径，年长者（大于50岁，且85%以上为农民）感染途径以注射毒品为主，以1b型居多。经与部分患者沟通得知，既往注射毒品（安纳加）都有村落集聚现象，农民集体劳动后，为解乏，共用注射器注射上述毒品，一只注射器全村人轮流使用，且无严格消毒措施，导致局部地区丙型肝炎患者集中存在。随着时代发展，技术进步，现均已应用一次性注射器，故此类现象发生机会大大减少。也会成为本地区经本途径感染丙型肝炎的患者减少的原因之一。
目前，用来进行丙肝病毒基因型的检测方法很多，分别为基因1、2、3、4、5、6型。以目前科学医学发展，基因6型病毒结构是无法达到彻底治愈的，只能保肝护肝控制治疗。5型病毒是暂时不需要治疗的，通过调节自身的免疫机体，自身可达到康复或者是利用干扰素结合利巴韦林治疗达到治愈。而1234基因型病毒通过科学、系统、规范、专业治疗，在短时间内是可达到彻底治愈的。LPAHCv n 基因分型系统是依据HCV不同基因型在5’端非翻译区(5’UR)核昔酸序列的差异而设计的寡核昔酸探针反相杂交系统,内包括1 条各型Hgy通用的探针和19 条型或亚型特异性探针,能分别对H Cv l一6型及其亚型进行分型,具有较广的覆盖面和较高的精确性,但其不足为不能对新发现的基因型作出鉴定。本文基因分型的结果初步表明,赤峰市及周边地区丙型肝炎病人中,HCV基因型1b (即国内以往报道的且型或KI型) 占49.9%(359/719)呈绝对优势。至于其他HCV感 染人群中基因型的分布是否有所不同,尚待进一步调查。本文的临床资料表明,719例丙肝病人中52.96% (381例) 具有静脉药瘾、毒品注射、输血或使用血制品的历史.证实此也是赤峰市及周别地区丙型肝炎的重要感染途径。
【参考文献】
[1] 毛小荣，张立婷，蒋妮等，丙型肝炎病毒基因型在中国大陆汉族慢性丙型肝炎患者中的分布特征[J].浙江大学学报（医学版），2015，（04）：417-422.
[2] 熊陶，胡爱荣，蒋素文等，浙江省东部地区丙型肝炎病毒基因分型的研究[J].中华医院感染学杂志，2015，（22）：5139-5141.
[3] 田绿波，陈肖潇，贺黎铭等，国境口岸入境人群丙型肝炎病毒的基因分型研究[J].中华医学杂志，2015，95（12）：903-907.
[4] 王佳丽，王静林，杨红樱等，云南省大理地区丙型肝炎病毒E1/E2基因序列分析[J].中华实验和临床病毒学杂志，2015，29（02）：106-108.
论文作者:张慧敏,陈丽群
论文发表刊物:《医药前沿》2016年5月第15期
论文发表时间:2016/6/23
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