张宏, 林代华, 彭成[1]2002年在《脾虚胃癌转移鼠模型的建立及基因表达谱的变化》文中研究说明目的:建立病证结合的脾虚胃癌转移鼠模型;探索该模型的基因表达谱的变化。方法:以过食酸味法建立脾气虚证动物模型,并在此基础上结合外科原位移植方法(SOI)植入新鲜人胃癌组织块建立脾虚胃癌转移鼠的病证结合动物模型;采用基因表达谱芯片技术作本模型的基因差异表达的检测。结果:成功建立了脾虚胃癌动物模型、脾虚胃癌转移鼠动物模型;发现转移鼠模型的胃癌细胞在脾虚状态时,有许多涉及胃癌细胞分化、凋亡、增殖和物质代谢等的癌症相关基因的表达与SGC-7901相比有较大差异。结论:用本文所述方法可复制出稳定的病证结合的脾虚胃癌动物模型、脾虚胃癌转移鼠动物模型;从实验的角度证明了脾虚在胃癌的发生、发展过程中有着重要作用,并提示这种作可能是通过影响一系列的胃癌相关基因的异常表达完成的。
林代华[2]2002年在《脾虚胃癌转移鼠模型的建立及基因表达谱的变化》文中研究指明目的：研究脾虚与胃癌的关系；建立病证结合的脾虚胃癌转移鼠模型，探索该模型的基因表达谱的变化。 方法：将NIH、BALB／c-nu／nu小鼠以过食酸味法建立脾气虚证动物模型，在此基础上，用2-乙基亚硝胺诱发NIH小鼠胃癌，研究脾虚与胃癌的关系，用外科原位移植方法(SOI)于BALB／c-nu／nu小鼠植入新鲜人胃癌组织块建立脾虚胃癌转移鼠病证结合动物模型，采用基因表达谱芯片技术研究脾虚胃癌转移鼠模型的基因差异表达。 结果：成功建立了脾虚胃癌动物模型、脾虚胃癌转移鼠动物模型。发现脾虚是胃癌的基础；转移鼠模型的胃癌细胞在脾虚状态时，有许多涉及胃癌细胞分化、凋亡、增殖和物质代谢等的癌症相关基因的表达与SGC-7901相比有较大差异。 结论：用本文所述方法可复制出稳定的病证结合的脾虚胃癌动物模型、脾虚胃癌转移鼠动物模型；从实验的角度证明了脾虚在胃癌的发生、发展过程中有着重要作用，并提示这种作用可能是通过影响一系列的胃癌相关基因的异常表达完成的。
敖慧[3]2007年在《参术胶囊治疗脾虚胃癌转移鼠模型的基因表达谱研究》文中研究表明目的:研究脾虚胃癌转移鼠模型引起的基因表达谱变化,探寻其分子生物学特征;研究参术胶囊治疗脾虚胃癌转移鼠模型的基因表达谱变化,分析其治疗脾虚胃癌的分子机理。方法:在将BALB/C-nu/nu小鼠采用食醋法建立脾气虚证动物模型的基础上用外科原位移植方法(SOI)在小鼠胃浆膜上植入经传代培育后生长的SGC9701胃癌组织块,建立脾虚胃癌转移鼠病证结合动物模型;用基因芯片分别检测脾虚胃癌转移鼠模型组和空白对照组,胃复春治疗组和模型组,参术胶囊治疗组和模型组的基因差异表达。结果:脾虚胃癌转移鼠模型引起151条基因上调,53条基因下调,涉及MAPK信号通路等多通路的改变;参术胶囊能逆向调节因脾虚胃癌引起的9条基因的差异表达,其治疗作用涉及VEGF信号通路等多条通路。结论:脾虚胃癌转移鼠模型具有脾虚和胃癌的分子生物学特点;参术胶囊是从多靶点(如代谢相关基因、离子通道和运输蛋白),多途径(如VEGF信号通路、MAPK信号通路)出发来治疗脾虚胃癌和改善症状的。
敖慧, 彭成, 林代华, 张宏, 叶冰[4]2010年在《参术胶囊治疗脾虚胃癌转移鼠模型的基因表达谱研究》文中研究表明目的:研究脾虚胃癌转移鼠模型的分子生物学特征;参术胶囊治疗脾虚胃癌转移鼠模型的基因表达谱变化,分析其治疗脾虚胃癌的分子机理。方法:在将BALB/c-nu/nu小鼠采用食醋法建立脾气虚证动物模型的基础上用外科原位移植方法,建立脾虚胃癌转移鼠病证结合动物模型;用基因芯片分别检测脾虚胃癌转移鼠模型组和胃癌细胞株,脾虚胃癌转移鼠模型组和空白对照组,参术胶囊治疗组和模型组,阳性药物的基因差异表达。结果:脾虚胃癌转移鼠模型中95条基因差异表达与代谢、免疫、离子通道和运输蛋白等有关;参术胶囊能逆向调节因脾虚胃癌引起的9条基因(代谢相关基因、离子通道和运输蛋白)的差异表达。结论:脾虚因素加重了脾虚胃癌的病情;参术胶囊是从多靶点出发来治疗脾虚胃癌和改善症状的。
李洪[5]2009年在《肝郁证模型大鼠海马差异基因表达谱的研究》文中研究指明一、研究背景辨证论治是中医学的精华和优势,“证”是辨证论治的依据,是疾病处于一定阶段病因、病位、病性和病势的综合,能体现患者的整体性特征。证本质的研究是中医学现代化研究的核心内容。肝郁证是中医肝病的一个基本证型,是许多常见临床证候的基础,广泛存在于临床各系统疾病中。自上世纪50年代以来,肝郁证本质的研究一直是中医研究领域的热点,已初步证实肝郁证具有现代病理生理学基础,并部分地阐释了其中医理论的科学性,取得了阶段性成果,认为和机体神经、内分泌、循环、消化、免疫等多系统密切相关。但是对肝郁证的评价还处于笼统、多指标、不确定状态,有待进一步深入研究,从系统而全面的角度来阐释肝郁证的实质。基因组学在整体上研究基因的功能,这与中医学的“整体观”概念十分相似。基因芯片是随着人类基因组研究的深入而迅速发展起来的一项重要的生物学技术,它的特点是高通量、快速、并行化采集生物信息。作为后基因组时代一项举足轻重的技术,基因芯片使生命科学与医学用全方位的整体新思维方式研究成为可能,因而广泛的应用于医学研究的各个领域。若借助基因芯片这种先进、快速的研究手段,可以尝试从基因水平探讨肝郁证的本质。可以设想,通过对同病异证和异病同证的基因表达谱差异比较中寻找证候的共同性和差异性建立一个“证候-基因表达谱”,揭示基因与证的内在联系,也会使中医辨证论治理论得到全面的检验和应用。二、研究方法目的:采用慢性束缚应激的方法复制与临床接近的、有效的大鼠肝郁证模型;利用基因芯片对肝郁证大鼠的海马组织中的差异表达基因进行分析比较,在动物模型上寻找肝郁证相关的基因,尝试从基因水平对肝郁证的微观辨证进行初步探讨,也为从临床疾病的角度对肝郁证相关基因的研究提供理论支持;比较逍遥散干预大鼠与模型大鼠之间的差异基因表达,一方面从基因转录水平探讨逍遥散对肝郁证的作用机理,另一方面以方测证,方证互参,说明肝郁证的本质。方法:在肝郁证理论指导下,复制慢性束缚应激肝郁证大鼠模型,并通过行为学实验和检测大鼠血清激素水平验证模型的可靠性;并用中药复方逍遥散干预造模动物,验证逍遥散对肝郁证大鼠的治疗作用;采用含有27000个已知基因的大鼠全基因组芯片检测大鼠海马内差异基因表达情况,比较模型大鼠与正常大鼠、逍遥散干预大鼠与模型大鼠的差异表达基因,利用生物分子功能注释系统(MAS)对与疾病相关的基因进行分析;用实时荧光定量PCR技术验证部分与疾病相关的差异表达基因结果的可靠性。1.慢性束缚应激肝郁证大鼠模型的复制情志异常是肝郁证的主要病因,不良生活事件所形成的心理应激则是情志病因的实质;肝郁证是对郁怒、抑郁、焦虑等负性情绪心理应激状态下,以高级神经中枢调节机制紊乱为前提,涉及多系统、多器官的病理改变。基于上述考虑,参照文献报道,从慢性应激的角度出发,将18只同周龄雄性Wistar大鼠随机分3组:肝郁证模型组、逍遥散组、正常对照组,每组各6只,模型组与逍遥散组大鼠单笼饲养,每日将大鼠置于束缚笼内,固定其身体与尾部,使之不能随意活动,每天6小时;逍遥散组大鼠在造模的同时,以逍遥散中药煎液10g/kg.d灌胃;正常对照组不予任何干涉,时间为3周。观察大鼠的一般状况,每周对各组大鼠进行一次液体消耗实验及摄食实验,造模开始与结束时分别对各组大鼠进行一次敞箱实验,并在造模结束后取大鼠血清,检测血清的CRH含量,以验证肝郁证模型的可靠性,并且论证逍遥散对肝郁证的治疗作用。2.利用基因芯片检测模型组与正常组大鼠海马的差异表达基因造模结束后处死所有大鼠,分离海马组织,提取海马总RNA,在检验总RNA的质量与数量合格后,总RNA反转录得到cDNA,体外转录合成生物素标记的cRNA,再与基因芯片进行杂交反应,这里我们选用北京博奥生物公司的含有27000个已知基因的晶芯~(?)大鼠全基因组表达谱芯片(27K Rat Genome Array);用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪对基因芯片进行扫描,得到半定量杂交结果后,采用LuxScan 3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,筛选出模型组与正常组大鼠海马的差异表达基因。借助MAS系统,通过搜索NCBI基因组数据库,对检测到的差异表达基因进行查询和确认,获得相关基因的信息并进行生物学注释,分析与疾病相关的基因在肝郁证的发生中可能的机制。3.利用基因芯片检测逍遥散组与模型组大鼠海马的差异表达基因同样采用27K Rat Genome Array芯片筛选出逍遥散组与模型组大鼠海马的差异表达基因,借助MAS系统,通过搜索NCBI基因组数据库,对差异表达基因进行查询和确认,获得相关基因的信息并进行生物学注释,尝试初步探讨逍遥散对肝郁证在基因水平上的作用机理。4.实时荧光定量PCR方法验证部分差异表达基因提取各组大鼠海马的总RNA,反转录得到cDNA,采用SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法,检测已有的基因芯片结果中部分与疾病相关的基因在各组大鼠海马中的表达情况,用以验证基因芯片结果。结果:1.成功复制了慢性应激肝郁证大鼠模型。造模3周后,一般状况来看,模型组大鼠主要表现为倦怠少动、喜欢贴壁、叫声尖细、反应迟缓、饮食减少,伴有毛色晦暗发黄、大便颗粒松散甚至呈水样等等肝郁证的表现。液体消耗实验结果发现,模型组大鼠造模后的糖水偏好程度显着低于正常组大鼠(P＜0.01);摄食实验中模型组大鼠的摄食量亦较正常组大鼠有显着性下降(P＜0.05);畅箱实验测得的动物行为学评分来看,造模后模型组大鼠的水平运动得分和垂直运动得分明显低于同时期的正常组大鼠(P＜0.01);此外,模型组大鼠的血清CRH浓度显着高于正常组大鼠(P＜0.01)。说明慢性束缚应激确能造成大鼠的肝郁证,能有效的模拟临床中肝郁证兴趣丧失、快感缺乏等症状。2.大鼠海马样品的总RNA经检验质量合格,顺利进行后续实验。模型组与正常对照组大鼠海马的芯片检测结果为:共有48个差异表达基因,表达上调的基因有15个;表达下调的基因33个。搜索基因组数据库及用MAS系统进行分析,对与疾病相关的基因进行功能分析,结果发现,部分差异表达的基因可以阐释肝郁证模型以及临床病例的某些主要表现。大致分为3类:(1)与神经精神类疾病相关的基因:主要有脑源性神经营养因子(Bdnf)、色氨酸羟化酶1(Tph1)、糖原合成酶激酶-3(Gsk3b)等,它们的表达异常,说明肝郁证中存在神经内分泌系统的紊乱,神经递质的调节上的发挥失常及神经元受损等机制,可能是导致肝郁证患者情绪低落、兴趣丧失、运动迟缓、饮食减少等的原因,也在一定程度上解释了肝郁证与现代医学中抑郁症、焦虑症等疾病的密切联系;(2)与肿瘤相关的基因:中期因子(Mdk)、叶酸受体1(Folr1)、水通道蛋白1(Aqp1)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Igfbp2)等,此结果提示肝郁证大鼠存在某些肿瘤的易感性,可能与临床上肝郁证患者气滞血瘀,日久成积而引起肿瘤发生有一定的相关,与我们前期肝郁证大鼠蛋白质组学研究结果类似;(3)其他疾病相关基因:如血管紧张素转化酶(Ace)、细胞内氯通道(Clic6)、X联内肽酶同源性的磷酸盐调节基因(Phex)等,这些基因的表达改变与肝郁证的关系有待进一步研究。3.逍遥散干预3周后,逍遥散组大鼠的倦怠少动、饮食减少等症状明显改善;液体消耗实验、摄食实验及畅箱实验结果发现,逍遥散组大鼠的糖水偏好程度、摄食量及行为学评分在第3周时与模型组相比,均有明显改善;与模型组大鼠比较,逍遥散组大鼠血清CRH浓度亦有升高趋势;逍遥散干预组与模型组大鼠海马的芯片检测结果为:共有22个差异表达基因,表达上调的基因有7个;表达下调的基因15个。其中与疾病关系密切的基因有:神经元钙传感器(Ncs-1)、阿片黑素促皮质激素原(Pomc)、色氨酸羟化酶1(Tph1)等,提示逍遥散对肝郁证的治疗作用可能与稳定细胞膜,防止钙超载,提高神经元抗损伤能力,双向调节HPA轴,神经内分泌功能等机制相关。另一方面从方证互参的角度也反证了肝郁证模型的可靠性。4.实时荧光定量PCR方法检测了Bdnf、Tph1、Mdk等3个基因在各组大鼠海马中的表达情况。结果发现,RNA质量完好,PCR反应扩增效果较好,PCR产物纯度较高,目的基因Bdnf、Tph1、Midkine在各组大鼠海马的表达比较与基因芯片检测结果基本一致,验证了芯片部分检测结果的可靠性。结论:1.本次研究采用慢性应激束缚的方法,成功的复制了大鼠的肝郁证模型,模型可靠。2.利用基因芯片检测出的模型组与正常组大鼠海马的差异表达基因中,部分基因的异常表达提示肝郁证可能与神经内分泌系统的紊乱,神经递质调节失常、神经元受损等机制密切相关,同时也提示肝郁证存在一定的肿瘤易感性。3.利用基因芯片检测出的逍遥组与模型组大鼠海马的的差异表达基因中,部分差异基因的表达提示逍遥散可能通过提高神经元对应激损伤的耐受性,调节神经内分泌功能等机制来发挥治疗肝郁证的作用。4.通过实时荧光定量PCR方法检测了部分与疾病相关基因在各组大鼠海马中的表达情况,与基因芯片的检测结果是基本吻合的,验证了部分基因芯片表达结果的可靠性。肝郁证大鼠模型海马差异表达基因的研究,为从基因水平探讨肝郁证实质研究的深入作了有益的尝试。
姚实林[6]2007年在《阳虚质理论及其外周血基因表达谱研究》文中研究指明目的 构建阳虚质的理论体系;检测阳虚质的外周血基因表达谱,探索其分子机制。 方法 检索600余部古代文献及大量现代文献中有关阳虚质的论述,对阳虚质的概念、成因、特征、诊断、干预方法进行研究,形成阳虚质的理论基础。在临床流行病学调查的基础上,选择8例典型阳虚质和6例典型平和质受试对象,抽取空腹静脉血各10 ml,分离白细胞,提取总RNA,纯化后进行单轮扩增,生物素标记cRNA,用Affymetrix公司生产的U133+2.0芯片检测基因表达谱。以平和质作为对照,用SAM分析阳虚质的差异表达基因,对差异表达基因进行GO注释和pathway分析并进行显着性检验,并对差异表达基因的生物学功能进行评价,从基因水平阐明阳虚质成因、特征及其发病倾向性的机制。 结果 阳虚质成因与禀赋不足、胎养不当等先天因素及社会环境、饮食习惯、疾病影响、医过等后天因素密切相关;阳虚质的特征性表现为寒象(身寒、代谢物澄彻清冷、畏食生冷)、面白体胖及脉微等;在发病倾向上易患虚寒证、寒湿证、血瘀证,对痰饮、肿胀、泄泻、阳痿等具有易患性;对阳虚质的诊断应在研究文献的基础上,结合专家临床经验进行量化诊断;阳虚质的调理原则为用甘温药温补阳气,或用温阳散寒药温补命门阳气,应注意阴阳、精气的互生。 与平和质比较,当fold change>2.0或fold change<1/2时,阳虚质共有1 739基因位点表达上调,其中表达上调的位点785个,下调的位点957个。按q<0.05进行筛选,上调基因有684个位点,下调基因有920个位点。共有267个差异表达的基因位点可进行GO注释或pathway分析且有统计学意义,其中表达上调的位点150个,下调的位点117个,涉及GO通路48个、KEGG通路3个、GenMAPP通路9个。表达上调的基因主要涉及炎症相关基因、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白基因CREB及环磷酸腺苷反应元件调节蛋白基因CREM等,表达下调的基因主要是与遗传信息传递相关的基因及亚甲基四氢叶酸还原酶基因MTHFR等。 结论 阳虚质理论体系对指导临床用药及养生保健具有重要意义。阳虚质表现为多种生理功能紊乱,其分子机制具有一定的复杂性,不宜从某几个基因及其表达产物去探索其分子机制。阳虚质主要表现为以致炎性细胞因子基因表达上调为特征的免疫功能紊乱和遗传信息传递能力下降。
伍春[7]2014年在《党参多糖对D-半乳糖致衰老小鼠皮肤抗氧化作用及基因表达谱的影响》文中研究指明目的：本实验的目的是观察党参多糖对D-半乳糖致衰老小鼠皮肤组织氧化损伤以及基因表达谱的的影响，探讨党参多糖是否能延缓小鼠皮肤衰老及其分子生物学机制，并进一步探求营卫气虚衰老理论与氧化自由基学说之间的内在联系。方法：将2月龄昆明种雄性小鼠120只随机分成空白对照组、衰老模型组、党参多糖低剂量组、党参多糖高剂量组和维生素E组；采用D-半乳糖构建衰老小鼠模型，在造模的第11天起开始进行药物干预；给药32天后取材进行指标检测，包括皮肤一般形态学观察，测定皮肤组织中SOD活性、ATP酶活性、MDA含量、LF含量、HYP含量，以观察党参多糖对D-半乳糖致衰老模型小鼠皮肤组织形态及抗氧化能力的影响；应用小鼠全基因组基因芯片技术筛选出党参多糖作用后小鼠皮肤组织中具有显着性表达差异的基因，并分别应用GO数据库、NCBI数据库和KEGG数据库对具有显着性表达差异的基因进行功能分析和信号通路分析；应用RT-PCR技术对基因芯片结果进行验证，检验结果是否真实有效。结果：（1）皮肤组织病理切片观察结果：与空白对照组比较，衰老模型组小鼠皮肤组织光镜下可见表皮变薄，皮肤附属器及真皮胶原纤维含量明显减少；与衰老模型组比较，党参多糖低、高剂量组及维生素E组小鼠皮肤附属器增加，胶原纤维含量增加且排列较致密。电镜下可见衰老模型组小鼠成纤维细胞核异染色质增多，胞质很少，扩张的粗面内质网及脂褐素颗粒明显增多，胶原纤维减少；党参多糖高剂量组及维生素E组小鼠皮肤细胞粗面内质网无扩张，脂褐素颗粒减少，胶原纤维数量增加；党参多糖低剂量组小鼠皮肤细胞内质网轻度扩张，但胶原纤维明显增加。（2）党参多糖对衰老小鼠皮肤抗氧化能力相关指标的影响：与空白对照组比较，衰老模型组小鼠皮肤组织SOD活性下降（P<0.05），ATP酶活力下降（P<0.05），MDA及LF含量显着增高（P<0.05），HYP含量显着减少（P<0.05）；与衰老模型组比较，党参多糖高剂量组小鼠皮肤组织SOD活性显着增高（P<0.05），ATP酶活性显着增高（P<0.05）、MDA及LF含量显着减少（P<0.05），HYP含量显着增高（P<0.05）；与维生素E组比较，党参多糖高剂量组小鼠皮肤组织SOD、ATP酶活性、MDA及HYP含量值无明显差异（P>0.05），党参多糖低剂量组介于维生素E组和衰老模型组之间。（3）党参多糖对衰老模型小鼠皮肤基因表达的影响：党参多糖干预后衰老模型小鼠皮肤组织中有显着性表达差异的基因共有118个，其中85个上调，33个下调，主要涉及的功能包括物质代谢、细胞凋亡、免疫应答、氧化应激、DNA损伤、蛋白修饰、基因转录、皮肤形态等方面；应用KEGG数据库分析经党参多糖作用后显着改变的信号通路，共筛选出6条活性发生显着性改变的信号通路，其中5条上调，1条下调。上调的通路中，差异显着性位于第一位和第二位的是分别与皮肤胶原纤维形成密切相关的ECM信号通路和与皮肤形态密切相关的Focal信号通路。（4）RT-PCR实验结果证明所验证的基因与基因芯片的结果相吻合，其上调或下调的趋势一致，说明基因芯片的结果真实可靠，能准确地反映各组小鼠基因表达的水平。结论:（1）本研究结果表明党参多糖能通过改善D-半乳糖致衰老模型小鼠皮肤组织的病理形态，增强抗氧化能力及增加胶原蛋白含量来延缓皮肤衰老。（2）党参多糖能通过调节小鼠皮肤组织中多个基因及多条信号通路的活性发挥延缓皮肤衰老的作用，揭示了党参多糖是通过多靶点、多途径来延缓小鼠皮肤衰老的。（3）补益营卫能够延缓小鼠皮肤衰老，中医营卫气虚衰老理论与西医学的氧化自由基学说之间有着密切的联系。
参考文献：
[1]. 脾虚胃癌转移鼠模型的建立及基因表达谱的变化[C]. 张宏, 林代华, 彭成. 第六次全国中西医结合实验医学学术研讨会会议论文集. 2002
[2]. 脾虚胃癌转移鼠模型的建立及基因表达谱的变化[D]. 林代华. 成都中医药大学. 2002
[3]. 参术胶囊治疗脾虚胃癌转移鼠模型的基因表达谱研究[D]. 敖慧. 成都中医药大学. 2007
[4]. 参术胶囊治疗脾虚胃癌转移鼠模型的基因表达谱研究[J]. 敖慧, 彭成, 林代华, 张宏, 叶冰. 云南中医学院学报. 2010
[5]. 肝郁证模型大鼠海马差异基因表达谱的研究[D]. 李洪. 南方医科大学. 2009
[6]. 阳虚质理论及其外周血基因表达谱研究[D]. 姚实林. 北京中医药大学. 2007
[7]. 党参多糖对D-半乳糖致衰老小鼠皮肤抗氧化作用及基因表达谱的影响[D]. 伍春. 甘肃中医学院. 2014
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