夏芸[1]2004年在《红系转录因子FKLF的表达纯化及初步研究》文中指出珠蛋白基因的程序性表达是组织发育时期专一性的。人的5个β类珠蛋白基因在11号染色体的短臂上形成一簇(ε，~Aγ，~Gγ，δ和β)，并且它们的表达有两个主要的开关，一是从胚胎型(ε)到胎儿型(γ)基因表达，接着是由胎儿型(γ)到成人型(β)珠蛋白基因表达。尽管人们已鉴定出许多珠蛋白基因的顺式调控元件及相应的反式作用因子，但珠蛋白基因调控的精确分子机制仍不甚明了，尤其对涉及胎儿及胚胎珠蛋白基因发育控制的反式作用因子所知有限。 在参与β-类珠蛋白基因调控的反式作用因子中，具有Cys2-His2型锌指的Kr(?)ppel样因子目前研究的较多。其中，人们已经对Spl——通用Kr(?)ppel类锌指蛋白，及EKLF——系组织专一的Kr(?)ppel类锌指蛋白进行了很好的研究。已知Spl与ε、γ及β-珠蛋白基因启动子CACCC box相互作用；EKLF对β-珠蛋白基因的表达至关重要，它结合在β-珠蛋白基因启动子的CACCC box上。 近两年来，又有FKLF和FKLF-2两个新Kr(?)ppel样因子相继被鉴定出来。根据现有的研究，我们知道FKLF主要由512个氨基酸组成，在近羧基末端有3个邻近的锌指，它与Spl、EKLF及KLF家族其他蛋白的锌指结构相同。根据锌指的氨基酸同源性，FKLF属于Kr(?)ppel样因子的第叁个亚族。FKLF的特点是在长的氨基末端区含有两个酸性及两个富含脯氨酸的区域。FKLF主要的转录活性在氨基端，氨基端的两个酸性区构成了FKLF反式激活功能的关键区域。FKLF主要在红系细胞中表达，可能是体内胚胎型及胎儿型珠蛋白基因表达的一个激活因子。目前，国内外还没有对FKLF原核表达及纯化的研究。 本论文通过用PCR方法从pBS/FKLF质粒中扩增得到FKLF的编码序列，将其克隆到原核表达载体pET32a(+)上，转化E.coli BL21(DE3)后用IPTG诱导，获得了FKLF融合蛋白的高表达。再将收集到的包涵体进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，从胶中分离纯化获得较纯的FKLF融合蛋白，经纯化浓缩后的蛋白浓度约为3.5mg/L培养基。再将获得的FKLF蛋白免疫新西兰大耳兔及Balb/C小鼠，制备了FKLF多克隆抗体，效价为1∶800。 同时，我们还构建了FKLF的真核表达质粒pIRES-EGFP/FKLF、pcDNA3/FKLF和pIRES-pac/FKLF。实验结果表明，在转染有这叁个表达质粒的华东师范大学硕士学位论文K562细胞中，FKLF的表达均比空白对照及空载体对照增加明显。这为进一步研究FKLF对胚胎及胎儿珠蛋白基因表达的影响奠定了基础，同时也为进一步获得稳定表达的细胞株奠定了基础。 另外，我们还以K562细胞和HEL细胞为模型研究了轻基脉这一胎儿型珠蛋白的诱导剂对内源FKLF表达的影响。结果显示，轻基脉不能在转录水平上增加内源FKLF的表达，而且用FKLF的抗体在翻译水平上也没能检测到FKLF的表达。我们推测可能有其它被激活的转录因子影响了FKLF的表达。
马艳妮[2]2008年在《ε-及γ-珠蛋白基因活化相关因子的鉴别和功能机制研究》文中进行了进一步梳理人出生前后发生造血位点由胎肝向成人骨髓的转移,并同时发生胎儿血红蛋白(HbF,α2γ2)向成人血红蛋白(HbA,α2β2)的表达转换(或开关)。研究表明,如果在成人期已经关闭的γ-珠蛋白基因能够重新活化,表达的γ-珠蛋白能够代偿镰刀形细胞贫血症(SCD)及β-地中海贫血患者中β-珠蛋白的不足,改善贫血症状,达到有效的治疗效果。本课题的目的就是希望寻找和确定能够特异活化γ-珠蛋白基因的因子或相关因子,为治疗镰刀形细胞贫血症和重型β-地中海贫血症提供新方法奠定基础。我们首先分析了人脐带血、正常成人骨髓和异细胞型胎儿血红蛋白持续存在综合症(HPFH)患者骨髓来源的红系细胞培养物中的基因表达情况,检测到了大量差异表达的基因,并通过实时定量PCR的方法验证了部分基因差异表达的真实性。我们共获得了1271条差异表达序列标签(ESTs),对其中的200多条进行了克隆和测序。序列比较发现这些基因包括信号转导分子、转录翻译相关因子、代谢相关的酶类、癌症或其他疾病相关因子、看家基因等,涉及到转录及翻译水平的基因表达调控、信号传导、细胞代谢、细胞分裂与凋亡及细胞分化等各种生命活动过程。这些资料为γ-珠蛋白活化因子以及珠蛋白开关的研究提供了有意义的线索。进而我们对于一个在脐带血中表达高于正常成人骨髓中的基因-CTDSPL2基因进行了深入研究。该基因编码一个小分子CTD磷酸酶类似物,在脐带血中的表达为正常成人骨髓中的2.5倍,在K562细胞hemin诱导向红系分化以及CD34+造血干/祖细胞EPO诱导向红系分化过程中表达均明显上调。这些均提示其可能参与γ-珠蛋白基因的表达增加。CTDSPL2-GFP融合蛋白细胞定位显示其主要集中于细胞核,提示其可能在细胞核中参与基因的转录调控。我们实验了CTDSPL2基因在K562细胞中对于珠蛋白基因表达的调控作用。通过G418筛选获得了6株CTDSPL2过表达的稳定K562细胞株。联苯胺染色检测了这些细胞在红系分化过程中的血红蛋白水平,说明CTDSPL2的过表达非常明显地促进了K562细胞中的血红蛋白水平。进一步实时定量PCR和RNase保护实验检测了过表达细胞在红系分化前后各个珠蛋白(包括α-、ξ-、ε-、γ-、β-珠蛋白)mRNA的表达变化,结果显示CTDSPL2的过表达对ε-及γ-珠蛋白基因的表达具有明显的促进作用,对α-、ξ-及β-珠蛋白基因作用微弱,在hemin诱导K562细胞向红系分化后对于各珠蛋白基因的作用与分化前基本一致。同时,我们确定了CTDSPL2有效的RNAi靶点,通过慢病毒介导的基因转移获得了稳定的CTDSPL2表达抑制K562细胞株。通过联苯胺染色和实时定量PCR方法检测了稳定细胞株中的血红蛋白以及各珠蛋白mRNA的表达变化情况,结果显示CTDSPL2的表达抑制降低了K562细胞中各个珠蛋白尤其是ε-珠蛋白基因的表达,但不能抑制hemin诱导的红系分化过程中各珠蛋白基因的表达上调。这些结果均说明CTDSPL2基因在K562细胞中确实具有促进ε-及γ-珠蛋白基因表达的功能,对ε-珠蛋白基因的促进作用更为明显。在确定了CTDSPL2基因在K562细胞中对于ε-及γ-.珠蛋白基因表达的促进作用后,我们进一步实验了该基因在造血干/祖细胞红系分化过程中对于珠蛋白表达的调控作用。通过体外构建载体、293T细胞包装,我们获得了较高滴度的CTDSPL2过表达以及表达抑制慢病毒颗粒,并从脐带血中分离纯化CD34+造血干/祖细胞,通过慢病毒颗粒感染CD34+造血干/祖细胞分别实现了CTDSPL2基因在脐带血来源的造血干/祖细胞中的稳定过表达和表达抑制。利用实时定量PCR方法检测了CD34+细胞在EPO诱导的红系分化前后各珠蛋白基因的表达情况,结果显示CTDSPL2在CD34+细胞中的过表达可以促进各个珠蛋白的表达上调,并更为明显地促进ε-和ξ-珠蛋白基因的表达,而在EPO诱导CD34+细胞红系分化后则显示出对ε-珠蛋白基因更为强烈的促进作用。且CTDSPL2基因在CD34+细胞中的表达抑制也部分降低了各珠蛋白基因的表达量,对ε-珠蛋白基因的抑制作用最为明显。这些结果充分说明CTDSPL2基因在脐带血来源的造血干/祖细胞红系分化过程中具有促进ε-珠蛋白基因表达的作用,这与在K562细胞中的结果基本一致。通过以上研究,基本确定了CTDSPL2基因在K562细胞以及脐带血来源的造血干/祖细胞中对于ε-及γ-珠蛋白基因的活化作用。我们进一步对其调节ε-及γ-珠蛋白基因表达的机制进行了初步研究。检测了K562细胞红系分化过程中ERK磷酸化水平的变化,发现在CTDSPL2过表达的K562细胞中ERK磷酸化水平均比对照细胞要高,但在U0126(一种ERK磷酸化抑制剂)抑制了细胞中的ERK磷酸化水平后,该基因对于珠蛋白的促进作用仍然存在,初步说明该基因促进ε-及γ-珠蛋白基因表达涉及ERK磷酸化水平的升高但不依赖于ERK的磷酸化。用实时定量PCR以及Western blot方法检测了过表达稳定细胞株中9种与珠蛋白基因调节相关的转录因子的表达,结果显示该基因在一定程度上可能通过促进FKLF、GATAl、NF-E4等转录因子的表达来促进ε-及γ-珠蛋白基因表达。我们还通过免疫共沉淀的方法分离了可能与CTDSPL2相互作用的蛋白,并进行了质谱鉴定分析,获得了CTDSPL2可能相互作用蛋白的初步线索。我们的结果鉴别和初步确定了CTDSPL2是一个新的能够活化ε-及γ-珠蛋白基因的蛋白因子,并初步实验了这一因子的作用机制。这些为珠蛋白基因表达调控及开关机制的揭示奠定了一定基础,为通过活化ε-或γ-珠蛋白治疗镰刀形细胞贫血症和重型β-地中海贫血症提供了新的候选基因和初步的实验依据。
张昕[3]2005年在《红系分化发育过程中珠蛋白基因表达开关进程的分析及相关调控因子基因探寻》文中指出在人类个体发育过程中存在ε(胚胎型)→γ(胎儿型)→β(成人型)珠蛋白基因表达开关过程。在成人骨髓造血干细胞向红系分化发育过程中也存在γ→β基因表达的“压缩性”开关过程。虽然对于珠蛋白基因表达调控及开关的研究已取得许多进展，但至今对于调节这些开关的决定性调节因子仍不明确。这些因子的确定对于揭示珠蛋白基因开关机制具有决定性意义，本课题的目的就是希望能向此目标迈进。 本研究首先利用密度梯度离心方法，从正常成人和异细胞型遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合症(HPFH)家系患者的骨髓组织(Bone Marrow)、健康足月正常分娩胎儿脐带血(Umbilical Cord Blood)中分离得到了含有造血干／祖细胞的单个核细胞(Mono-Nuclear Cell，MNC)，进行初步纯化及体外(in vitro)扩增后，组合使用Epo、IL-3、GM-CSF等细胞因子，将造血干／祖细胞向红系方向进行诱导培养。鉴于在以往报告中使用的红细胞体外培养方法往往由于添加胎牛血清及诸如c-kit配体、Tpo等促生长添加剂而使得成人外周血或骨髓来源的红细胞内胎儿型γ-珠蛋白基因的表达水平升高，不能真正模拟体内成人红系分化发育的过程，无法满足研究珠蛋白表达及开关调节的需要，我们针对成人骨髓来源的红细胞尝试使用了无血清培养方法，针对人脐带血来源的红细胞则使用了含脐带血清的培养方法，并且尽量去除其他影响珠蛋白表达的添加剂，希望能够找到并建立尽可能模拟生理情况的培养条件与方法，并以此为基础，为研究珠蛋白基因表达调控及开关机制提供适当的实验材料。 在向红系诱导过程中，我们在不同的时间点收集了红细胞培养物，提取总RNA，进行逆转录合成cDNA，通过实时荧光定量PCR(Real time PCR)技术详细检测了细胞分化成熟不同时间点的红细胞内α-类与β-类珠蛋白基因的表达水平。结果显示：在使用无血清培养基诱导培养的成人骨髓红细胞内，其α-、β-及γ-珠蛋白基因的表达水平及变化趋势同正常生理情况下的表达过程即所谓的“压缩性开关”非常相似，其中的β-珠蛋白基因的表达同γ-珠蛋白基因相比占明显优势，胚胎型ε-珠蛋白基因表达水平极低，而胚胎型ζ-珠蛋白基因的表达则未能检测到；在使用含人脐带血清的培养基诱导培养的脐带血红细胞内检测到了包括α-、β-、γ-、ε-及ζ-等在内的所有珠蛋白基因的表达，其中的β-珠蛋白基因表达变化趋势同无血清诱导培养的正常成人骨髓红系细胞相似，而与前者不同的是在整个成熟过程中γ-珠蛋白基因同β-珠蛋白基因的表达相比占
彭瀚[4]2006年在《新锌指蛋白HZF1的功能研究》文中进行了进一步梳理造血是人一生中不断由多能造血干细胞更新造血祖细胞和成熟血细胞的过程。现在认为造血干细胞分化定向到某一个特定血细胞链系以及进一步分化发育为成熟细胞的过程至少部分地是由链系特异的转录因子和广泛表达的转录因子协同作用所控制。一些包含C2H2锌指模体的转录因子在血细胞的分化和发育过程中扮演了重要角色。例如GATA家族、FOG和EKLF等。 我组2000年从人骨髓cDNA文库中筛选到一个新的编码锌指蛋白(命名为HZF1)的cDNA(GenBank注册号：AF244088)。本论文在此基础上研究HZF1基因结构、表达、功能和作用机制。 对hemin诱导的K562细胞中获得的cDNA进行PCR扩增，鉴别到HZF1基因的3种转录物，它们可能由HZF1初级转录物不同的剪接产生。分析发现HZF1基因包含四个外显子和叁个内含子。其中一个转录物包含第3、4号外显子，第二个包含第1、3、4号外显子，第叁个转录物包含有全部4个外显子。这叁种转录物的序列差异仅在5’非翻译区，因此编码的肽链是一致的。HZF1编码区长2010bp，编码670个氨基酸残基，其中包含连续的15个C2H2型和2个C2R2型锌指模体。 HZF1 mRNA在人的脑、心、骨骼肌、肾、肝、胰腺和胎肝中高表达；在脾、小肠和骨髓组织中等表达；在结肠、胸腺、肺和外周血白血病中少量表达。HZF1mRNA在各种造血细胞系中都有表达。在hemin诱导K562细胞向红系分化过程中HZF1 mRNA表达上调，诱导24h后HZF1 mRNA表达水平到达最高。同样，在PMA诱导K562细胞向巨核系分化过程中HZF1 mRNA表达上升，诱导60h后表达水平达到峰值。 把HZF1完整读框插入到pEGFP-N1质粒中，构建真核表达载体oEGFP-N1-HZF1，转染NIH3T3细胞，48小时后在荧光显微镜下观察，发现HZF1融合蛋白定位在细胞核中。
程双宁[5]2006年在《一种新型造血相关转录调节因子EDAG-1的原核表达及单克隆抗体的制备》文中提出红系发育相关基因(erythoid develop associated gene,EDAG-1)是一种特异表达于造血组织和细胞的新基因(中国专利申请号:01118268.8公开号:CN1388130A),它在造血发育与分化调控过程中发挥重要作用。为进一步研究EDAG-1调控细胞增殖、分化及凋亡的分子机制,及探讨其临床潜在应用前景,研制EDAG-1的单克隆抗体是十分必要的。本实验用原核表达的方式获得足够的纯化EDAG-1重组蛋白为抗原,通过细胞融合技术制备EDAG-1单克隆抗体,为EDAG-1的深入研究提供可能。本实验选用pGEX-4T-3载体,成功构建了含GST标签的pGEX-4T-3-EDAG-1原核表达载体,经过对表达体系进行优化,在37℃培养,OD600为1.4-1.5时加0.1mM IPTG诱导4小时,可以获得较高效率的GST-EDAG-1融合蛋白表达,融合蛋白占菌体可溶蛋白的30%以上,并且表达的蛋白以可溶性形式存在于菌体中。通过对诱导蛋白的纯化,可以获得较高纯度的EDAG-1蛋白。利用原核表达获得的GST-EDAG-1融合蛋白对BALB/C小鼠进行免疫,将免疫后小鼠的脾脏细胞和来源于同种系小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型和胸腺核苷激酶缺陷型)采用PEG介导的融合方式进行细胞融合实验,通过HAT培养基对融合细胞进行初步筛选,进而通过ELISA实验对所获得杂交瘤细胞进行抗体表达验证,获得表达EDAG-1抗体的单克隆杂交瘤细胞。通过对单克隆抗体的初步实验表明,所获单克隆抗体具有很好的特异性,较低的背景和较好的稳定性。本实验制备的抗EDAG-1的单克隆抗体可用来检测临床白血病细胞中的表达产物,并为将来应用于临床白血病等肿瘤患者的诊断和治疗提供可能,也对深入研究EDAG-1调控造血的分子机制等生物学功能具有重要意义。
张果[6]2005年在《锌指转录因子GKLF作为抑癌基因的相关功能的初步研究》文中研究指明恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，是当前全人类所面临的一个非常严峻的问题。肿瘤的发生发展往往涉及原癌基因的异常活化和抑癌基因的失活，进而引起细胞信号传导的异常。 无论是正常细胞，还是癌细胞，均需获得各种信号以维持其生命活动过程。而各种生理信号激活相应的细胞信号传导通路的结果，通常是在转录水平对靶基因的表达进行调控。由于癌细胞的生物学特性，它的信号传导通路和基因转录调控往往更为复杂。各种转录因子的活性对于基因转录调控具有重要作用。因此，积极展开转录因子功能与调控方面的研究，不仅能够诠释信号传导通路的作用机制，更为重要的是，将有助于人们更深入地认识肿瘤的本质，从而为肿瘤的预防、诊断和治疗提供理论基础。 GKLF(Gut-enriched Kruppel-Like Factor)是在1996年由Yang和de Crombrugghe所在的两个研究小组几乎同时发现的KLF家族(Kruppel-Like Factor)C_2H_2型锌指转录因子，由于其在胃肠道呈现高丰度表达，故而得名。人GKLF基因定位于染色体9q31，编码一个由470个氨基酸构成的蛋白质。GKLF蛋白的C端是锌指结构域，主要参与DNA结合；在锌指区之外，GKLF具有转录活化和抑制结构域，因此具有转录活化和抑制两种功能。 对发育过程中GKLF基因表达谱所进行的分析表明，GKLF很可能参与对细胞增殖和分化的调节。已有的资料还显示，GKLF在大肠癌、膀胱癌和胃癌中表达下调；但在乳腺癌中表达增加。与之相对应的体外实验，在大肠癌、膀胱癌和胃癌细胞系中异位表达GKLF能够抑制细胞增殖，促进细胞凋亡；但在乳腺癌细胞系中过表达GKLF却能够促进细胞转化。 尽管已经有了比较广泛的研究，但是关于GKLF蛋白的功能，目前依然知之甚少。首先，关于GKLF蛋白水平在食管鳞癌中可能存在的异常还没有相关报道。其次，对于GKLF在食管上皮细胞中的作用也没有系统的研究。另外一个重要的问题是，已有的研究主要关注其对细胞增殖的影响，而对于其在细胞凋亡中的作用机制，至今尚未见相关报道。 针对这些问题，我们进行了相关的工作，结果如下： 1．检测了食管鳞癌组织中GKLF的mRNA和蛋白的表达状况。RT-PCR结果显示，
柴立民[7]2005年在《从益髓生血颗粒调控β-珠蛋白及相关基因表达探讨肾生髓理论的分子机制》文中认为本研究是在导师吴志奎研究员肾生髓理论现代研究与临床实践的学术思想指导下,以国家自然基金资助课题为依托,把中医的理论思维和前沿技术有机结合,对益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血的整体效应和疗效的分子机制进行研究。在该药取得显着临床疗效的基础上,采用ELISA、RT-PCR、激光共聚焦显微镜扫描技术、凝胶滞后试验、real-time PCR、DD RT-PCR等实验技术,从造血刺激因子的表达,β-珠蛋白基因簇LCR HS2序列DNA与蛋白质相互作用,珠蛋白基因表达调控发挥重要作用的红系特异的反式作用因子基因的表达,以及与红细胞溶血相关的铁蛋白基因表达等方面,多层次研究了益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血调控珠蛋白基因表达的分子机制,取得了有学术价值的研究结果。 一、理论研究 1、从肾生髓与藏精的内在关系、肾生髓与髓养骨、肾生髓通于脑以及肾生髓生血四个方面,对历代有关肾生髓理论的文献论述进行分析归纳,以期加深对经典肾生髓理论的认识。通过对近年来有关肾生髓理论现代研究的相关文献分析归纳,从肾生髓与神经系统功能的相关性、肾生髓和髓养骨物质基础的现代研究、肾生髓与髓生血的客观性研究和肾生髓理论分子机制的研究等方面,总结肾生髓理论的现代研究成果,为中医经典理论的现代研究探索新的思路和方法。 2、通过对珠蛋白基因簇的组织及表达的时空顺序性、珠蛋白基因的结构与表达、珠蛋白基因表达与红系分化起重要作用的转录因子、珠蛋白基因的顺式作用元件以及β-珠蛋白基因簇位点调控区的功能等方面分析归纳,了解珠蛋白基因表达调控的作用机制,更深入的认识珠蛋白生成障碍性贫血的发病机制,为临床研究提供理论依据;总结导师多年来的运用补肾生血中药治疗β-地中海贫血的研究成果,深入学习导师的学术思想和科研思路。 二、益髓生血颗粒调控珠蛋白及相关基因表达的研究 1、从两个方面对益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血的整体效应进行了研究,研究结果如下:①采用随机单盲安慰剂平行对照进行临床观察,研究结果显示:治疗组血液学参数Hb、RBC、Ret、HbF自给药第1个月至治疗结束均明显提高,安慰剂对照组无明显变化;治疗组患者肝脾肿大明显缓解,B超显示患者脾脏横径治疗后明显小于治疗前;治疗后患者临床中医证候明
霍晓芳[8]2005年在《红系分化相关基因的鉴别与功能分析》文中进行了进一步梳理红细胞是血液细胞的重要组成部分，担负着运输氧气到肌体各种组织和细胞的重要生理功能。在胚胎与胎儿期，依次由卵黄囊、肝、脾、骨髓完成造血；出生后，骨髓成为主要的造血场所。红细胞的生成首先是由多能干细胞分化为多能髓系祖细胞，进一步分化为红系祖细胞，经历红系集落形成单位BFU-E(burst forming unit-erythroid)和红系克隆形成单位CFU-E(colony forming unit-erythroid)阶段，接着经历原幼→早幼→中幼→晚幼→网织红细胞而分化为成熟红细胞。正如其它细胞的分化过程一样，这一过程也非常复杂，并被多种因素精密调节。 造血干细胞向红系的分化决定和继续分化发育成熟是多个基因有次序地开启和关闭或表达增强和降低的结果，它们的表达异常，可能导致血液病的发生。K562细胞是从红白血病病人血液中分离出的细胞株，相当于干细胞分化过程中的红系和巨核系共同祖细胞阶段但停止继续分化。在氯高铁血红素(Hemin)诱导下可继续红系分化过程。为了进一步获得分化过程中相关基因表达的信息，我们应用改良的差异显示RT-PCR技术(DDRT-PCR)，分析K562细胞在Hemin诱导的红系分化前后的基因表达变化，获得红系分化相关基因的线索，进而确定在红系分化中起重要作用的基因，并研究它们的作用机制。 通过对红系分化前后差异表达明显的电泳带进行克隆、测序及在NCBI进行BLAST比对，发现这些基因多为氧化还原酶及其它酶类、信号转导分子、分化相关分子、细胞凋亡相关分子、肿瘤相关分子、染色质结构蛋白等，还有一些已知cDNA而未知功能的基因和几个可能的新基因。为了实验DDRT-PCR差异表达的可靠性，用Dot Blot对部分差异表达带进行分析，证明了改良的DDRT-PCR技术较好地克服了假阳性率高的缺点。 我们首先选择了两个Heroin诱导后表达升高的基因进行功能研究。一个为钙依赖的磷脂酶结合蛋白Annexinl，已知它参与调节细胞生长分化、凋亡等过程。另一个为ArhGAP15，是一个新的人RhoGAP(Rho GTP酶激活蛋白)，与Racl相互作用，
王茫桔, 瞿祥虎, 王立升, 翟芸, 武淑兰[9]2003年在《人类新型Krppel类转录因子hBKLF的cDNA克垄、亚细胞定位及表达特征》文中进行了进一步梳理人胎肝cDNA文库FLD45 85克隆可能编码一种造血相关的转录因子 ,本文旨在从 2 2周孕龄人胎肝中获得其编码基因的全长cDNA序列 ,分析其编码蛋白的功能域、基因组结构、染色体定位、亚细胞定位及表达谱特征。采用 5′RACE方法获得FLD45 85克隆全长 ;生物信息学方法确定hBKLF基因结构、染色体定位及功能域特征 ;GFP融合蛋白技术确定hBKLF亚细胞定位 ;Northern杂交、RT PCR、Western印迹方法分析其表达谱。结果获得了FLD45 85克隆编码的hBKLFcDNA全长序列 ,它含 1810bp ,编码 3 45个氨基酸 ,与小鼠BKLF同源 ,C端含 3个特征性C2 H2 结构的锌指 ,是KLF转录因子家族的新成员。hBKLF基因跨越 3 3kb ,含 6个外显子和 5个内含子 ,位于 4号染色体4p15 2～p16 1。GFP hBKLF融合蛋白在COS - 7细胞中呈细小点状分布于核内 ,核仁区无分布。hBKLF含有两个转录本 ,大小为 4 4kb～ 7 5kb和 1 3 5kb～ 2 4kb。大转录本在成人及胎儿组织广泛表达 ,小转录本在外周血白细胞、肝脏和骨髓表达量最高 ,红系和粒系细胞均表达hBKLF。hBKLF表达量随肝脏发育成熟而下降 ,随红系、粒系成熟而升高。以上研究提示hBKLF可能是一种在体内广泛发挥作用的转录因子 ,在造血的调控中可能有重要作用
张伟[10]2012年在《Krǔppel-like factor家族成员KllfO对巨噬细胞分泌炎症因子的调控研究》文中研究说明巨噬细胞是固有免疫反应重要的效应细胞,在特异性免疫发挥作用前对机体防御病原微生物中起着重要的作用,同时也是一类主要的抗原递呈细胞,是连接固有免疫和适应性免疫的枢纽,在特异性免疫应答的诱导与调节中起着关键的作用。最近的研究主要把巨噬细胞分为两类,一类称为经典激活的巨噬细胞,即M1；另一类称为选择激活的巨噬细胞,即M2。骨髓细胞可以在GM-CSF和M-CSF的诱导条件条件下,分别形成两种类似于M1和M2的表型,在这里我们称之为GM-BMM和M-BMM。 GM-BMM可以产生大量的炎症因子,可以介导对病原菌的抵抗；而M-BMM可以分泌抑炎因子,有助于帮助机体进行组织修复和重建。M-BMM在用LPS刺激时,会有一种高表达IL-10低表达IL-12的状态,但是这种状态是特别是IL-12的调控是如何形成的,一直未有研究。KLF家族是一类锌指蛋白转录因子家族,在其C末端或者接近C末端包含由3个C2H2锌指结构组成的高度保守的DNA结合区域。通过调控基因的转录,KLFs能够在多种生理或者病理过程中发挥功能。Klf10属于Kriippel类转录因子家族,其最初被描述为转化生长因子p诱导的早期基因-(TIEGl,transforming growth factor-beta inducible early gene1)。我们的研究发现K1f10在M-CSF诱导的骨髓来源的小鼠原代巨噬细胞中能够调节IL-12p40的表达,IL-12p40作为IL-12p70和IL-23的共同亚基,在细胞因子的调节网络中起着重要的作用。K1f10基因敲除小鼠中IL-12p40的表达明显上调。而我们通过流式细胞术分析发现K1f10对巨噬细胞表面的一些特定分子标志并没有明显影响,暗示了K1f10并没有影响到巨噬细胞的分化。此外,我们发现Klf家族中与K1f10高度同源的另外一个成员Klf11也能协同K1f10一起来调控IL-12p40的表达。深入的机制的研究发现K1f10能够通过结合到IL-12p40启动子的CACCC位点来抑制其转录。同时我们发现在K1f10敲除小鼠中,CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBP-a)和干扰素调节因子8(IRF8)都受到了明显影响,这两个基因都被报道过能够调控IL-12p40的表达,因此K1f10可能通过调节C/EBP-a和IRF8来间接调控IL-12p40的合成。接下来我们发现在一个用LPS诱导的小鼠内毒素休克模型中,K1f10敲除小鼠也有着上调的IL-12p40的表达。综上,我们在巨噬细胞中找到了一种新的调控IL-12p40的转录因子K1f10,进一步完善了IL-12p40的调控网络,并对K1f10在固有免疫及炎症反应中的作用的进一步研究提供一些新的启示。
参考文献：
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[6]. 锌指转录因子GKLF作为抑癌基因的相关功能的初步研究[D]. 张果. 中国协和医科大学. 2005
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