王朋[1]2003年在《维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究》文中研究指明目的 增殖性玻璃体视网膜病变(简称PVR)是孔源性视网膜脱离(简称RRD)的常见并发症和手术失败的主要原因，尽管玻璃体视网膜手术技术不断提高，但复发率并未改善，同时玻切手术本身就是诱导PVR形成的一个危险因素，因此，如何在PVR形成的早期就应用药物抑制其发生和发展是眼科医生急需解决的问题。视网膜色素上皮细胞(简称RPE)是PVR形成时最重要的细胞。抑制PVR的关键就是抑制RPE细胞的增殖。近期PVR研究的热点是借助凋亡途径控制细胞的增殖，主要是施加凋亡诱导剂，使迁移增殖的RPE细胞发生凋亡，从根本上阻止PVR膜的形成和进一步发展。现今用于诱导RPE细胞凋亡的药物主要是抗代谢药，这些药副作用大，患者不易接受。维拉帕米是一种可靠的钙通道阻滞剂，副作用小、方便、价廉、易于得到。研究证明，维拉帕米对其他组织细胞的凋亡具有双重调节作用，同时钙离子在凋亡中的作用也不十分清楚，且有关维拉帕米对RPE凋亡的诱导作用及机制国内外均未见报道。因此本实验进行了人视网膜色素上皮细胞原代和传代培养，施加维拉帕米诱导其凋亡，来确定诱导RPE凋亡的有效作用浓度和时间，从而为今后探讨维拉帕米在增殖性疾病中的临床应用奠定理论基础。 方法 一、组织来源及准备 在无菌条件下，取我校一院眼科角膜移植后的供体眼球。 二、人RPE细胞的培养 无菌状态下，采用酶消化法，分离和种植人RPE细胞于24孔板内，待细胞融合后，胰酶传代。 叁机’I’f比色法测定药物对RPE增生的影响 将第 3代 RPE细胞以 2 X 10’个／00gi的细胞密度接种于 96IL塑料培养板中，加人40m牙L，80m珍L，160m才L，320m牙L的维拉帕米，培养24小时后，应用M’I’f比色法，在全自动酶标仪上测其在490urn处的吸光值A。计算细胞增生抑制率，并对数据进行统计学分析。 四、凋亡的检测 将第3代的RPE细胞分叁组进行凋亡检测。第一和第二组分别加人维拉帕米80mg／L和 160 mg／L，第叁组作为对照组未加药。采用HE染色、AO荧光染色以及透射电镜进行观察。以80mg／L，160 mg／L浓度的维拉帕米，作用 12－72小日后，力人 PI染液后，经流式细胞仪检测。通过计算凋亡区（亚二倍体峰）细胞所占百分比得出凋亡率。 结 果 在测定药物对RPE增生影响的实验中，细胞抑制率分别为13．55％、16．71％、42．34％和51．of％，随着浓度增大，细胞抑制率不断上升，结合方差分析和t检验证明维拉帕米对人RPE细胞增殖有明显的抑制作用，且呈明显的剂量依赖关系。结合光镜。电镜、荧光显微镜和流式细胞仪检测凋亡所得结果为80 mgll和160mg／l维拉帕米均可诱导RPE凋亡。在同一浓度时，随着时间延长，凋亡率不断增加，在同一时间内，药物浓度增加，凋亡率也不断增大，经统计学分析证明其差异具有显着性。结果显示 160mg／L维拉帕米作用 72小时，凋亡率可达 49．3％。 结 论 1．维拉帕米能有效抑制体外培养的人RPE细胞增生，且呈明 ·2·显的剂量依赖关系。 2．维拉帕米能够诱导体外培养的人RPE细胞凋亡，本实验条件下，160mg／L是诱导凋亡的最适浓度，72 ／J’时是凋亡的最佳作用时间。
庞东渤, 洪晶[2]2007年在《视网膜色素上皮细胞凋亡途径的研究》文中指出目的研究维拉帕米(verapamil,Ver)诱导体外培养的人视网膜色素上皮(reti-nalpigmentepithelium,RPE)细胞凋亡过程的凋亡途径。方法应用80mg·L-1Ver作用体外培养的人RPE细胞12h、24h、48h诱导凋亡。RT-PCR及Western blot检测caspase-3及caspase-8表达。结果对照组RPE细胞可见caspase-3的mRNA及蛋白有少量的表达,Ver作用12h、24h、48h时,caspase-3的mRNA及蛋白表达增强。对照组和Ver作用12h、24h、48h组caspase-3与内对照β-actinRT-PCR产物OD比值的平均值分别为0.58±0.08、0.89±0.12、1.22±0.14及1.18±0.09,组间比较,差异有显着意义(F=19.22,P<0.05)。本实验条件下未发现caspase-8的mRNA及蛋白表达。结论Ver诱导体外培养人RPE细胞凋亡可能是通过细胞内途径完成的。
周薇[3]2013年在《维拉帕米抑制兔外伤性增生性玻璃体视网膜病变的实验研究》文中指出目的：通过观察结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)在家兔眼增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)中表达的时相变化,以及钙通道拮抗剂维拉帕米(Verapamil,Ver)玻璃体腔给药对其表达的影响,探讨PVR的发病及防治机制,从而为PVR的临床治疗提供实验依据。方法：36只健康家兔,随机分为叁组,每组12只,分别为正常组、生理盐水组、维拉帕米组。本实验选取每只家兔左眼作为实验观察眼,采用玻璃体腔注射富含血小板的血浆液的方法进行建造外伤性增生性玻璃体视网膜病变的模型。正常组：单纯饲养后予以玻璃体腔注射0.9%氯化钠注射剂,剂量为0.1ml；生理盐水组：造模后30分钟,玻璃体腔内注入0.9%氯化钠注射剂,剂量为0.1ml；维拉帕米组：造模后30分钟,予以玻璃体腔注射盐酸维拉帕米注射剂,剂量为0.1ml (0.25mg)。全部实验眼于术后第7、14、21、28天在充分散瞳下用裂隙灯显微镜和直接检眼镜观察并记录伤口、角膜、前房及玻璃体视网膜的改变,参照Fastenberg评级标准进行分级,进行眼部B超检查；然后进行麻醉、处死、迅速摘除眼球、取材、石蜡包埋、HE染色、CTGF免疫组化染色。光镜下观察玻璃体视网膜组织各时间点的变化,采用Image-ProPlus6.0软件对CTGF阳性染色的平均光密度(mean optical density, MOD)进行测量,所有数据均采用SPSS12.0for Windows软件包进行处理,进行统计学分析。结果：1、裂隙灯显微镜和直接检眼镜下,正常组玻璃体透明,视网膜未见明显异常；与生理盐水组相比,维拉帕米组玻璃体混浊程度及视网膜平均增生程度明显减轻,牵拉性视网膜脱离数量明显减少。2、B超检查,正常组未见玻璃体混浊及视网膜脱离声像；维拉帕米组玻璃体混浊及视网膜皱褶、脱离的眼数明显少于生理盐水组。3、HE染色,正常组玻璃体视网膜结构正常；维拉帕米组较生理盐水组增殖膜明显减少,视网膜水肿程度及增生程度明显减轻。4、造模后7天CTGF的表达明显增强,14天呈强阳性表达,21天时达到峰值,28天时表达减弱；并且同一时间点维拉帕米组玻璃体视网膜CTGF的表达均低于生理盐水组,P<0.05。结论：1、本实验成功建立了玻璃体腔注射富含血小板的血浆液制备外伤性PVR动物模型,具有可行性和可重复性。2、正常家兔的玻璃体视网膜中未见明显CTGF的阳性表达,外伤性PVR型玻璃体视网膜组织中CTGF的表达显着增高。3、维拉帕米可以显着抑制外伤性PVR中CTGF的阳性表达,减轻损伤处视网膜的水肿,抑制纤维增殖膜的形成,一定程度上抑制了PVR的形成。
柳麓仑[4]2010年在《维拉帕米对视网膜Müller细胞分泌VEGF的影响》文中研究指明糖尿病性视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病常见的微血管并发症,是发生双眼盲的最主要疾病。如何有效的防治DR,是现今世界研究的热点。DR的主要病理表现为视网膜病理性新生血管形成,功能不全的新生血管伴随视网膜内皮细胞向玻璃体腔增殖,而后形成瘢痕,最终瘢痕牵拉视网膜而导致失明。因此,有效的预防新生血管的形成,可减缓糖尿病性视网膜病变的进展,对改善患者的生存质量具有重要意义。DR发生时出现的病理性血管新生,与VEGF的关系极为密切。VEGF可增加血管的通透性,促进内皮细胞迁移和增殖,从而促进新生血管的形成。视网膜Müller细胞是特化的神经胶质细胞,是人类视网膜最主要的神经胶质细胞,它贯穿整个内界膜至外界膜的视网膜,对维持视网膜内环境的稳定起重要作用。由Müller细胞衍生的VEGF,是血管渗漏、视网膜前及视网膜内病理性新生血管形成的主要因素。我们前期的实验已经证实,Müller细胞存在L-型钙离子通道,且应用L-型钙离子通道阻滞剂维拉帕米,可抑制Müller细胞外钙离子内流。本实验的目的在于研究钙通道阻滞剂维拉帕米,是否能够通过抑制Müller细胞钙离子内流,从而抑制Müller细胞VEGF的表达,探寻钙通道及VEGF表达的内在联系,为DR的防治提供新的思路。本实验采用组织块悬浮培养的方法建立了体外兔视网膜Müller细胞的原代培养体系,并分为正常对照组、高浓度葡萄糖组、高浓度胰岛素组、高糖高胰岛素组、维拉帕米对照组、维拉帕米高糖组、维拉帕米高胰岛素组、及维拉帕米高糖高胰岛素组,应用免疫细胞化学染色法测定维拉帕米对高糖、高胰岛素环境下体外培养的视网膜Müller细胞分泌VEGF的影响。结果显示:高糖组与正常对照组相比VEGF表达在第1天有显着差异(P<0.01),第3天及第5天有差异(P<0.05);维拉帕米对照组与正常对照组相比VEGF的表达在第1天、第3天无明显差异(P>0.05),第5天有差异(P<0.05);维拉帕米高糖组与高糖组相比VEGF的表达,第1天有显着差异(P<0.01)第3天及第5天有差异(P<0.05)。结论:高糖可使体外培养的兔视网膜Müller细胞VEGF表达增加;维拉帕米可以使高糖条件下体外培养的兔视网膜Müller细胞VEGF表达下降;维拉帕米对正常对照组VEGF的表达无显着影响。本实验为钙离子及钙通道在DR形成中的作用机制及寻找新的治疗方法提供了理论和实验依据。
韩泉洪[5]2000年在《单核细胞趋化蛋白-1在增生性玻璃体视网膜病变中的作用研究》文中提出目的：增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是有多种炎性因子、炎症细胞和组织细胞参与的损伤修复过程，巨噬细胞在PVR的发病过程中有重要的作用，单核细胞趋化蛋白—1(monocyte chemotactic protein-1，MCP—1)可以特异性地趋化巨噬细胞和淋巴细胞向炎症的部位聚集，而视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)是其中主要的增殖细胞。本实验研究的目的是(1)评价巨噬细胞调理液(MCM)对培养人RPE合成MCP-1的作用；(2)观察MCP—1对RPE移行的作用和地塞米松和道诺霉素对这种作用的影响，以及细胞信号转导通道阻滞剂对这个过程的作用；(3)观察视网膜脱离后不同时期的临床标本组织中MCP—1的表达与巨噬细胞和淋巴细胞的关系。 方法：(1)在培养人RPE的培养液中加入20％培养人巨噬细胞调理液(MCM)、白细胞介素—1β(IL—1β)或肿瘤坏死因子—α(TNF—α)(0.2，2，20ng／ml)培养2、4、8、16、24和48h后，对培养细胞爬片进行免疫组化和原位杂交染色，并对培养RPE的上清液作Western blot检测MCP—1的含量。同时在培养液中加入地塞米松(10~(-8)，10~(-7)，10~(-6)M)或道诺霉素(2μg，20μg，200μg／L)重复上述实验，观察在此条件下MCM对MCP—1合成的作用；(2)处于生长融合状态的单层RPE用剃须刀片刮出一片无细胞的区域，在无血清培养液中加入MCP—1、IL—1β和TNF—α，培养20h后计数进入刮痕区的细胞，观察这些因素对RPE移行的作用。同时另设实验组在培养液中分别加入MCP—1中和抗体、地塞米松、道诺霉素、蛋白激酶C抑制剂(Calphostin C，CC)和钙离子通道阻滞剂维拉帕米(Verapamil，Ver)，观察这些条件下MCP—1对RPE移行作用的变化。最后用MTT法检测了MCP—1对RPE的促增殖作用；(3)选用视网膜手术取材标本，包括裂孔源性视网膜脱离视网膜下液中的细胞成份，B级PVR玻璃体手术集取物以及PVR C／D级的视网膜增殖膜，免疫组化法检测其中MCP—1、CD68和CD3的表达状态。 结果：(1)Western blot检测表明培养的人RPE在无药物作用的条件下，MCP—1的分泌为阴性，20％MCM、IL—1β和TNF—α培养条件下，2h时可以检测到分泌的MCP—1，而且随着时间和药物浓度的增加而上升，并在16h达到较高水平，但是MCM培养过程中MCP—1的分泌浓度较低，约为IL—1β条件下的1／5。原位杂交和免疫组化结果验证了Western blot的结果。加入地塞米松
李秋实[6]2011年在《维拉帕米对体外培养的人晶状体上皮细胞增殖和黏附的抑制作用》文中进行了进一步梳理目的研究钙离子拮抗剂维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养的人晶状体上皮细胞(huamn lens epithelial cell,HLEC)增殖、凋亡和黏附的影响。方法体外培养人晶状体上皮细胞株(SRA01/04)。Ver处理第二代人晶状体上皮细胞。MTT法观察不同浓度的Ver对HLEC增殖的影响,流式细胞术(FCM)检测Ver对HLEC周期的影响,AO/EB双染法观察细胞凋亡形态,Annexin V-FITC/PITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。MTT法测定Ver对HLEC贴壁的影响。结果(1)随着Ver药物浓度的增加,HELC增殖率减少,以72小时最为明显。(2)FCM检测细胞周期细胞变化时发现:G1期细胞在药物组(77.97±0.18、78.15±0.12、82.86±0.56、84.84±0.42)较正常组(72.67±0.94)增加(P<0.05);S期的细胞在药物组(10.26±0.06、10.08±0.76、8.52±0.31、8.42±0.27)较正常组(16.87±0.33)明显减少(P<0.05)。(3)形态学观察发现HELC在80mg/l浓度的Ver作用72小时后发生了一系列形态改变,包括细胞核固缩、染色质边集等凋亡改变。流式细胞仪测定了10、20、40、80mg/l浓度的Ver可以诱导HLEC发生凋亡,且随着浓度的升高凋亡率显着升高。(4)用药24h后HELC的贴壁量为对照组的73.17%。结论Ver对体外培养的HLEC生长有抑制作用,使细胞停留在G1期。Ver可以诱导HLEC凋亡,随着药物浓度增加细胞凋亡率增加,而且Ver有抑制HLEC贴壁的作用。提示Ver能改变细胞周期的进程而有效抑制HLEC的增生、诱导细胞凋亡并且抑制HLEC的黏附,有望成为防治后发性白内障的理想药物。
参考文献：
[1]. 维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究[D]. 王朋. 中国医科大学. 2003
[2]. 视网膜色素上皮细胞凋亡途径的研究[J]. 庞东渤, 洪晶. 眼科新进展. 2007
[3]. 维拉帕米抑制兔外伤性增生性玻璃体视网膜病变的实验研究[D]. 周薇. 昆明医科大学. 2013
[4]. 维拉帕米对视网膜Müller细胞分泌VEGF的影响[D]. 柳麓仑. 吉林大学. 2010
[5]. 单核细胞趋化蛋白-1在增生性玻璃体视网膜病变中的作用研究[D]. 韩泉洪. 第四军医大学. 2000
[6]. 维拉帕米对体外培养的人晶状体上皮细胞增殖和黏附的抑制作用[D]. 李秋实. 辽宁医学院. 2011
标签：眼科与耳鼻咽喉科论文; 维拉帕米论文; 视网膜论文; 玻璃体论文; 细胞增殖论文; 上皮细胞论文; 药品论文; 健康论文;