邓党明1 严康峰2
（1广东省广州市南沙区中医院 511462）
（2广东省广州市番禺区中心血站 511400）
【摘要】目的 对采用非连续密度梯度离心法分离红细胞的效果进行观察，分析其影响因素以及影响的程度。方法 不同分离条件的分离效果观察，主要通过正交设计方法进行比较；分析各参数给分离效果带来的不同影响，主要通过多元线性回归统计方法。结果 影响红细胞分离的因素有离心时间、离心力、红细胞浓度、标本红细胞平均体积、个体年龄等，其中影响最大的是红细胞平均体积。结论 分离条件相同标本不同，或者标本相同分离条件不同，得到的分离效果也不同，控制影响因素，能够得到相对稳定的分离效果。
【关键词】 分离红细胞 非连续密度梯度离心法 影响因素 分析
【中图分类号】R457.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）02-0237-02
连续密度梯度和非连续密度梯度是密度梯度离心方法的两种不同的方法，采用连续密度梯度离心方法分离红细胞，无法对所分离的红细胞数目进行控制，而且需要在19000-74000g离心力的条件下进行分离。本研究所采用的分离方法为非连续密度梯度离心法，观察分离效果，分析影响因素及影响程度。现报道如下。
1.资料与方法
1.1 一般资料
选取2013年3月份，21例无偿献血志愿者的新鲜外周血标本。志愿者平均年龄为（34±9）岁。
1.2 方法
对所选的21例标本，分别进行离心条件相同情况以及不同离心条件下展开红细胞分离研究，过程中所用到的仪器和试剂有低温离心机、10ml离心管、CPDA保存液、0.9%生理盐水、血细胞计数仪、Percoll细胞分离液，以及采用0.2g/L的KCI、0.2g/L的KH2PO4、0.18g/L的C6H12O6、8.0g/L的NaCI、3.49g/L的Na2HPO4?12H2O4的PBS缓冲液和1.5mol/L盐水。
首先，在2000r/min的条件下将标本进行5分钟的离心，去浆，将4℃的PBS加入，设置2000r/min的洗涤，次数控制在2次；将上清液、白膜层用吸管细细的进行清理，加入CPDA保存液，待混合均匀充分后，放入冰箱4℃下进行保存备用；选用1ml加样器按密度从高到低的顺序，将不同密度的Percoll分离液加入离心管内，建立体积为1ml/层的分离液密度梯度6层；在分离液梯度的最上面加入400μl标本，放置于低温离心机20分钟，设置温度4℃和3500g，结果得到红细胞6个部分；细致的用吸管将离心管内各层的红细胞分别吸出，并放置到带有编号的试管内，均放入PBS洗涤，设置1000r/min，4℃、5min离心进行2次的洗涤，洗涤完毕，将上清液进行清理，然后分别将1ml生理盐水加入，悬浮红细胞，进行红细胞计数,计数采用血细胞计数仪进行计数。
为了观察和分析离心温度、离心时间以及离心力带给标本分离效果的影响，我们针对同一份标本设置不同的影响因素值进行离心分离试验，离心温度、离心时间和离心力的三个水平值分别为20℃、10℃、4℃，30min、20min、10min和3500g、2500g、1500g。离心分离试验分别进行9次，操作如上所述。
1.3 统计学方法
SPSS17.0统计软件；One-WayANOVA分析;多元线性回归方差分析多因素相关性；一般线性模型多变量方差分析正交设计结果。
2.结果
21例血标本,年龄平均为（34±9）岁，分离前的细胞浓度平均为（4.62±0.32）×1012/L,MCV平均为（92.79±4.91）fl，分离后红细胞在1-6层中所占的比例平均依次为：（20.19±15.28）%、（16.35±6.33）%、（4.81±3.18）%、（13.81±3.84）%、（17.69±5.16）%和（15.20±7.46）%,各层红细胞比重与影响因素之间的相关性分析，P<0.05，具有统计学意义；采用多元线性回归统计分析影响因素给各层红细胞所带来的影响，结果发现除第2层和第3层外，其余各层拟合所得多元线性回归方程均具有统计学意义；采用标准回归系数进行影响因素的影响强度比较时，标准化回归系数与作用影响力呈正比，系数越大，作用影响力越大，系数越小，作用影响力越小，本研究中，第1、4、5、6层的标准化回归系数均较大，表现出较大的作用影响力，其中，第1层呈现负相关，第4层、5层和6层呈现正相关；影响作用力与浓度、年龄之间的关系，在第4层中呈现负相关，第1层、第5层和第6层呈现正相关。
离心温度、离心时间以及离心力对同一标本进行分离分析，发现各因素均不能对各层效果造成单独的影响，详见表1。但是，分离后不同条件下的分离图中可以看到各因素对离心效果还是有影响的，可以发现10℃、20min、3500g的离心条件下，层次间只有较少的细胞分散，层次分明，分离效果最佳。
表1 红细胞离心分离条件正交试验结果
3.讨论
采用密度梯度分离方法, 分层不同个体红细胞时, 处于同一密度层次的红细胞数目就会不一样, 分离效果也不同。正交设计分析中, 关于离心力、温度、离心时间对分离效果的影响无统计学意义, 可能与分离后吸取各分层细胞的操作还不够精细及血常规仪计数时固有的变异系数有关, 故各分层红细胞百分比数据的统计分析结果与分离图片存有一定差异。考虑到4℃条件下, 红细胞处于较低的代谢状态, 为减少由于分离时间较长对红细胞造成的损伤, 因此最终的分离条件定为: 4℃、20 min、3 500 g。本研究的结果充分证明，分离条件相同标本不同，或者标本相同分离条件不同，得到的分离效果也不同，控制影响因素，能够得到相对稳定的分离效果。
参考文献
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论文作者:邓党明1,,严康峰
论文发表刊物:《医药前沿》2014年第2期供稿
论文发表时间:2014-4-16
标签：红细胞论文; 梯度论文; 标本论文; 密度论文; 因素论文; 效果论文; 方法论文; 《医药前沿》2014年第2期供稿论文;