梁元存[1]2002年在《寄生疫霉Elicitin基因克隆、表达及Elicitin诱导植物抗病防卫的机制研究》文中指出Phytophthora和Pythium的许多种能向细胞外分泌一类小分子量的蛋白质，统称为elicitins。Elicitins在烟草上能引起过敏反应（hypersensitive response，HR）和系统获得抗性（systemic acquired resistance，SAR）。Elicitins-烟草互作体系是研究信号识别、信号传导等诸多问题的良好体系。本论文报告作者对烟草寄生疫霉（Phytophthora parasitica var. nicotianae）中国菌株的elicitin基因进行克隆、表达及其诱导植物抗病性方面的研究结果。根据已报道的寄生疫霉parA1基因的序列设计引物，从4株寄生疫霉不同寄主分离物（3株来自烟草，1株来自刺槐）中克隆到此基因，序列分析表明4株寄生疫霉parA1基因序列高度保守。然后研究了parA1在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达。对表达载体pET30a(+)双酶切(NdeⅠ-BamHⅠ)，构建表达elicitin蛋白的表达载体pET-eli，用CaCl2法转化大肠杆菌BL21菌株，通过IPTG诱导在大肠杆菌中产生的蛋白在烟草上引起过敏性坏死反应。对重组蛋白性质测定表明，重组蛋白有一定的耐热性，并对蛋白酶K敏感。至此，我们已成功地从寄生疫霉中国菌株中克隆到了parA1基因，并建立了大肠杆菌重组表达体系。在获得重组蛋白的基础上，测定了其诱导烟草和番茄对真菌、细菌和病毒病的抗病诱导作用。对不同浓度的elicitin进行诱导作用比较，此重组蛋白在30nM时，喷洒诱导烟草后产生最高的抗TMV的诱导作用；诱导作用可维持至少20天，其中在第4-5天诱导效果最好。因此，在elicitin诱导植物时，最好使用30nM浓度，并在诱导后第4-5天挑战接种可产生最大的诱导效果。用30nM的elicitin处理烟草和番茄，第4天接种测试的病原物，烟草经诱导后，烟草能抗TMV(tobacco mosaic virus)、烟草黑胫病菌(P. parasitica)、烟草赤星病菌(Alternaria longipes)和烟草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)，诱导作用分别是74.1%、63.8%、50.6%和45.0%；番茄经诱导处理后抗青枯病（P. solanacearum），诱导作用为43.1%。因此elicitin的抗病诱抗作用是非特异的。植物诱导抗性通常与过敏反应（HR）及病程相关（PR）等基因的表达相关联，而这些反应受信号分子水杨酸的调控，在不同体系中，还有H2O2等信号分子及Ca2+通路因子的参与。为了明确elicitin诱导HR的上游信号传导因子，对elicitin处理后<WP=8>植株体内SA、H2O2的积累及Ca2+通道相关反应作了测定。烟草经elicitin诱导处理后，体内水杨酸含量比对照提高了1.65-2.88倍，其中在诱导后的第1天和第4天各有一个峰值。用Ca2+通道阻断剂La3+与elicitin同时注射烟草叶片发现过敏基因HIN1表达被抑制，表明HIN1的表达依赖于胞外Ca2+。在elicitin处理烟草后，过氧化氢酶（CAT）的活性下降1.15-1.62倍；相应地，elicitin处理的烟草植株体内H2O2迅速积累，但在测定的时间内没有出现“氧化迸发”，H2O2含量只是在elicitin注射叶片后的第5和9小时各出现了两个小峰，并且H2O2的增加是系统性的，即不但处理叶片有量的积累，而且非处理叶片也有量的增加。根据这些现象，elicitin诱导HR的过程有SA、Ca2+通道因子和活性氧的参与。为了明确上述信号分子的变化是否与HR相关，我们研究了elicitin诱导的细胞快速死亡及HR的分子表征。用elicitin注射烟草后0.5小时，HR的表征基因HIN1表达，在7小时内表达量逐渐变弱，而最终在12-16小时可观察到HR。HR的另外的表征分子苯丙氨酸裂解酶（PAL）和PR基因的表达。在烟草受elicitin处理后的6天内，PAL活性出现了2个峰，活性水平高出对照1.13-2.44倍。Elicitin喷洒诱导后，检测了防卫基因PR-1b的表达情况。PR-1b在诱导1天后就有表达而并在测定的5天内都有一定量的表达。用150nM的elicitin喷洒烟草叶片，经trypon-blue染色，在12小时可观察到有细胞坏死，说明elicitin引起了micro-HR，而水和低浓度的elicitin不能引起micro-HR；同时发现注射引起HR的elicitin浓度远比引起micro-HR的浓度低。证实能产生HR的激发子的诱导作用不见得要伴随micro-HR
刘若雪[2]2010年在《烟草表皮毛蛋白NtTTG1与转录因子AtMYB44调控植物防卫反应信号传导的机制》文中研究说明自然界中的植物经常遭受病原菌或病原激发子的侵袭,而植物利用自身的先天免疫系统形成一套复杂而有效的防御机制来抵御这种侵害,这些机制包括过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)和系统获得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)。HCD又叫过敏反应(hypersensitive response, HR),是植物抗病反应的一种典型症状,可在24 h内观察到。其特征是病原菌所侵染部位的细胞呈现快速枯死,病原菌得不到营养而致其不能生长和扩散。HR的产生与两种类型的病原菌与植物产生互作有关：一种是病原菌与寄主之间的不亲和互作(avr-R);另外一种是由病原菌与非寄主植物的互作所引起。已有研究表明,病原真菌中引起非寄主过敏性反应的物质主要是由疫霉属病原菌所产生的激发子elicitinS。ParA1是由寄生疫霉Phytophthra parasitica var nicotianae分泌产生的一种elicitin。ParA1处理烟草叶片的表皮毛,可以引起表皮毛细胞发生一系列的HCD相关反应。这表明,表皮毛中存在着一套接受外源激发子ParA1信号的分子机制。那么,ParA1是如何被植物体识别的?表皮毛发育蛋白NtTTG1是如何参与到ParA1引发的HCD过程之中的?转录因子在植物应对生长发育过程中遭受的各种生物和非生物胁迫的过程中起重要的作用。转录因子通过与其调控的下游基因启动子区的顺式作用元件结合而直接调控靶基因的表达,或形成同源、异源二聚体,或与其它蛋白互作成为某种活化形式而参与乙烯、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)与脱落酸(ABA)等信号传导途径,形成复杂的基因表达调控网络,提高植物对环境胁迫的适应能力。HrpNEa是由梨火疫病原细菌Erwinia amylovora产生的一种蛋白激发子。外施HrpNEa能够诱导拟南芥中多种转录基因的表达,也可以通过激发不同信号通路,诱导植物产生抗病、抗虫、抗旱以及促生长等多种有利表型。EIN2 (ethylene insensitive2)是乙烯信号通路的关键调控因子,那么,转录因子和EIN2之间会有什么样的联系?转录因子在乙烯信号传导通路中起到什么作用?本研究着重剖析NtTTG1在ParA1引发的烟草过敏细胞死亡中的作用机制以及AtMYB44参与乙烯信号传导通路的作用机制。1、ParA1与功能缺失蛋白C51S的获得及其功能验证根据以往的研究得知,蛋白激发子ParA1注射烟草叶片,可以引发过敏性细胞死亡；喷施烟草叶片时,可以引发肉眼不可见的微敏反应(microscopic hypersenseitve response, micro-HR),并伴随有活性氧爆发(ROS burst)和染色质凝集现象(Chromatin condensation, Cc)的发生。ParA1中含有6个保守的半胱氨酸,且两两结合形成叁对二硫键维持着对于ParA1的功能行使所必需的特异的空间构象。本研究主要通过点突变(site directed mutagenesis)的方法将ParA1中的第51位半胱氨酸替换为丝氨酸,得到了基因C51S,经原核表达得到了点突变蛋白C51S。通过与对照ParA1的功能验证发现,C51S完全丧失了在烟草叶片上诱导HR的能力。而且DAB、trypan blue和DAPI染色结果发现,C51S处理表皮毛12h后,仍检测不到氧爆发、微敏反应和染色质凝集现象的发生。这些结果都表明,C51S已经完全丧失其生物功能。2、ParA1与NtTTG1在烟草表皮毛细胞的细胞膜附近的相互作用根据拟南芥中参与叶片表皮毛发育的几个关键基因,在烟草中筛选可以受ParA1诱导表达的同源物。发现只有AtTTG1的同源物受诱导表达,并依此克隆到NtTTG1基因。NtTTG1在表皮毛中被ParA1诱导表达的程度明显强于叶肉细胞。并通过酵母双杂交和pull-down assay证明了ParA1与NtTTG1可以发生互作,而C51 S与NtTTG1却不能相互作用。蛋白结构分析表明,51位的半胱氨酸位于ParA1蛋白的边缘,这个位置很可能在与其它蛋白的互作中起作用。ParA1与NtTTG1之间的互作经两个蛋白在植物表皮毛中的亚细胞定位而得到进一步验证。将融合有红色荧光蛋白RFP的NtTTG1在烟草中瞬时表达,这个融合基因瞬时表达12h后在烟草表皮毛中有大量的转录。荧光观察表明,NtTTG1-RFP明显的定位在烟草表皮毛细胞的细胞膜上。而且荧光迭加结果表明,ParA1-eGFP可以与NtTTG1-RFP相结合,而C51S-eGFP不能与之结合。双分子荧光互补实验也进一步验证了荧光迭加的结果,而且,这种互作发生在表皮毛细胞的细胞膜附近。3、烟草叶片表皮毛在ParA1引发过敏性细胞死亡过程中的导航作用表皮毛作为烟草最外部的第一道天然屏障,势必最早接触蛋白激发子ParA1,并参与其诱导的过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)过程。我们以HCD发生过程中的重要信号分子H202和细胞内的染色质凝集为切入点,确定了表皮毛对于ParA1激发子诱导HCD的响应(见本博士论文研究报告第一章)。DCFH-DA染色及荧光观察结果表明,ParA1处理后1h,表皮毛内发生氧爆发,这比叶肉细胞早2h,其产生的活性氧还有向下部叶肉细胞传导的趋势。同时,药物抑制实验证明了活性氧的主要成份是H2O2。DAPI荧光分析表明,表皮毛内染色质凝集的发生要比叶肉细胞早5h左右。Trypan blue染色,并配合质壁分离实验,结果证明,在ParA1处理后1h到12h中,细胞死亡从表皮毛向底部细胞逐渐扩散,表皮毛细胞死亡发生比叶肉细胞早大约5h,且表皮毛在每个时间段内的细胞死亡数都高于叶肉细胞。RT-PCR方法检测了HCD反应中的标志基因PAL、hin1和hsr203的表达,叁个基因在ParA1处理12h后的表皮毛中都有明显表达,而在叶肉细胞内表达稍晚一些。这些结果表明,HCD信号是从表皮毛向叶肉细胞中传导的。4、介导HrpNEa诱导拟南芥抗绿桃蚜作用的37个转录因子的初步筛选HrpNEa是由病原细菌产生的一类harpin蛋白质,它可以通过激发不同信号通路,诱导植物产生抗病、抗虫、抗旱以及促生长等多种有利表型。HrpNEa处理拟南芥可以通过激活乙烯信号通路来诱导植物对绿桃蚜的抗性反应。EIN2是乙烯信号通路中的关键调节因子,在诱导抗虫反应中起重要作用。为了阐明乙烯信号在诱导抗虫反应中的调控机制,我们对在拟南芥上由乙烯诱导的37个转录因子进行了研究。HrpNEa处理野生型Col-0后,与对照相比,发现有22个基因被上调表达,4个被下调,还有9个没有变化,其中AtMYB44的上调表达度最强。通过研究37个转录因子突变体中蚜虫趋避以及蚜虫繁殖情况时发现,有24种突变体和野生型差不多,有4种抗性增强,还有9种抗性减弱。atmyb44对蚜虫的趋避性减弱程度最为明显,而且削弱了HrpNEa诱导的抗虫反应。我们又分别检测了乙烯信号通路的标志基因PDF1.2的表达情况,发现其在野生型中表达,但在atmyb44和另外的4种突变体里不表达,这说明了乙烯信号通路已被阻断。本研究证明了拟南芥突变体atmyb44能消除HrpNEa诱导的EIN2基因的表达,从而说明了AtMYB44与EIN2有着很紧密的联系。5、转录因子AtMYB44与EIN2的互作研究AtMYB44是拟南芥MYB家族的一种转录因子,可以对乙烯信号发生感应,从而介入植物防卫反应。植物防卫反应经常受乙烯信号传导支配,而乙烯信号的中心调控因子是EIN2。目前,对AtMYB44调控的蛋白靶标及EIN2的作用机理的研究,都还不够深入。通过遗传学、药理学及微生物学等方法,我们发现AtMYB44、EIN2和乙烯在对HrpNEa诱导拟南芥对蚜虫产生抗性的过程中都是必需的因子。本研究通过geⅠmobility shift assay (GMSA)和chromatin immunoprecipitation assay (ChIP)两种方式证明了AtMYB44与EIN2能在植物体外体内产生互作。6、转基因双突变体ein2-1 atpp2-a1和ein2-1 abi2-1的产生与鉴定拟南芥AtPP2类韧皮部蛋白是一种独特的结合几丁质的凝集素,其氨基酸序列高度保守且均有韧皮部组织特异性,对刺吸式昆虫的侵袭有着特殊的防卫功能,在植物韧皮部相关防卫(plant phloem-related defense, PRD)反应过程中起重要作用。逆境激素脱落酸(ABA)能调控植物营养生长和生殖生长过程中的气孔关闭、抵抗逆境、种子后熟和休眠等许多重要事件。乙烯是植物生长发育重要的内源信号分子,其介导的植物抗病防卫基本信号通路对于植物的基本防卫十分重要。而EIN2是乙烯信号通路中的关键调节因子。本研究通过RNAi介导的基因沉默的转化方法,构建了AtPP2-A1与ABl2基因的沉默发夹结构,分别转化拟南芥乙烯不敏感突变体ein2-1,将AtPP2-A1与ABl2基因沉默,成功获得了双突变体品系ein2-1 atpp2-a1和ein2-1 abi2-1。为深入研究植物乙烯与PRD、ABA信号通路在植物防卫信号传导过程中的关系提供了材料与依据。
任海英[3]2006年在《生物激发子与氧化还原相关信号对植物生长和抗病性的调控作用》文中认为随着人们对农作物上使用农药的关心，寻找一种安的保护农作物的方法是全世界努力的方向。生防细菌和其他一些天然来源的材料在病害防治和提高产量上有着巨大的应用潜力。Pseudomonas和Bacillus species是一类非常重要的生防细菌，以多种机理保护植物，也能促进种子发芽和植物生长。Harpin是多种植物病原细菌产生的Ⅲ型效应因子的蛋白质，在病原菌侵染的时候泌出激发植物的多种反应，外源施用到植物上能引起多种有利效应。HpaG_(xoo)，Xanthomonas oryzae pv．oryzae产生的一种harpin蛋白质，能激发植物对病原菌和昆虫的防卫反应，促进植物生长，hpaG_(xoo)的转基因烟草系统获得抗性(systemic acquired resistance，SAR)受到诱导。生防细菌在根部的定殖能诱导植物的ISR(induced systemic resistance，诱导系统抗性)，ISR与SAR拮抗，赋予植物截然不同的抗病机理。因此，Ⅲ型效应因子和生防细菌一起使用很可能比其中一个单独使用对植物具有更好的诱导作用。本研究的目的是探清生防细菌和Ⅲ型效应因子是如何互作的，如何影响植物的生长和抗病性。P．cepacia P6854和B．subtilisB-916对水稻纹枯病有比较好的防效，我们产生了hpaG_(xoo)的转基因水稻(品种R109)的一些株系，研究发现HpaG_(xoo)-expressing rice line 1 (HER1)生长较快，对盐胁迫和病原菌的防卫反应较强。Elicitin是疫霉菌产生的一类寄主特异性蛋白质激发子，能诱导多种烟属植物、萝卜和芸苔产生过敏反应(hypersensitive response，HR)，但对番茄、马铃薯等茄科植物，多数十字花科植物等无效。Elicitin不仅能诱导植物的过敏反应，也能诱导多种植物的多种防卫反应，例如：可以诱导烟草抗黑胫病(P．parasitica)和由Xanthomonascampestris pv armoraciae引起的病害，也能使烟草抗TMV的侵染。Harpins和elicitins这两类重要的激发子，诱导植物抗病、抗逆的机理既有相似之处，又有不同，二者共同作用于植物时，是否能协同作用，需要进一步研究。在本研究中构建了能同时表达两种激发子的工程菌，研究了该双元激发子的工程菌的蛋白粗提液与单元激发子蛋白粗提液引起烟草的微敏反应和系统抗病性的差异。核黄素(VB_2)在细菌和高等生物内是核黄素结合辅酶FMN和FAD的重要成分，FMN和FAD是主要的酶促反应如氢化物、氧和电子传递反应的酶的辅酶因子，是一种多功能性的维生素，对动植物、微生物的生长、抗病都有很重要的作用。核黄素在植物和微生物中都能自我合成，合成途径的倒数第二步是由2，4-二氢喋啶合酶(lumazine synthase，LS)催化的，倒数第一步是由核黄素合酶(riboflavin synthase，RS)催化的。动物和人类都缺少这两种酶，但是很多细菌和酵母却依赖这两种酶形成内源核黄素，很久以来LS和RS蛋白质高级结构得到很好的研究，用来设计疫苗，治疗人类和动物的疾病，很多细菌和酵母编码LS和RS蛋白质的基因已经得到克隆。在拟南芥中发现LS与茉莉酸途径相交叉，与根对茉莉酸的敏感性、植物的抗病性密切相关。由此可推断水稻上的OsLS和OsRS很可能存在着目前不为所知的功能，在植物上编码这两个酶的基因的报道不多，尤其是水稻的这两个基因根本还没得到克隆。硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)是一种小分子量蛋白质，催化巯基-二硫键的交换反应，参与细胞还原环境的调节，在不同的组织和器官内有不同的构象，具有多功能性。目前已经在多种微生物、植物和动物内克隆到该基因，细胞质、叶绿体和线粒体内都有多种构象的硫氧还蛋白，除了能消除氧胁迫，这种蛋白质越来越多的功能被发现。烟草上该基因(NtTRX)的功能研究甚少，在生长和抗病性上的功能尚未见报道。本博士论文的研究目的就是初步研究清楚激发子HpaG_(xoo)与生防细菌P．cepacia和B．subtilis或者激发子ParAl一起使用时对植物的生长、抗病性和过敏反应的影响是否存在互作；水稻的核黄素合成过程的酶促步骤的OsLS和OsRS基因和烟草的其中一个氧化还原作用的NtTRX基因(NtTRXh)在植物的生长、抗病性、细胞死亡和活性氧胁迫上的作用。研究结果如下：1生物激发子与生防细菌协同作用影响檀物的生长、抗病和过敏反应为了搞清生防细菌和HpaG_(Xoo)在作物上一起存在时是否能够对植物的生长和抗病有更好的作用，研究了P．cepacia和B．subtilis在野生型水稻R109和表达hpaG_(xoo)的水稻株系HER1上的作用。与野生型R109相比，HER1的长势较好、产量高、对病害和盐胁迫的抗性强。与水处理的对照相比，P．cepacia和B．subtilis的定殖促进R109和HER1根的生长，也能促进R109茎叶的生长，但是HER1茎叶的生长受到抑制。接种纹枯病菌(Rhizoctonia solani)后用P．cepacia和B．subtilis处理，R109和HER1的发病程度都比对照轻，而且HER1有更好的抗性，这说明P．cepacia、B．subtilis和HpaG_(xoo)在诱导植物的抗病性上相互协作。P．cepacia和B．subtilis在根部定殖后，HER1和R109上一些与生长和防卫密切相关的基因具有不同的表达谱。在R109的根内，调控植物生长的OsARF1表达量与P．cepacia和B．subtilis对生长的促进作用是一致的，相反在HER1的茎叶内，OsARF1表达量与P．cepacia和B．subtilis对水稻的抑制作用相一致。在R109和HER1内参与植物生长的编码延展蛋白的OsEXP1对P．cepacia的反应在茎叶内与生长一致，但是在根内却不一致。OsMAPK编码细胞分裂素激活的蛋白质激酶，调控水稻内对盐和病菌侵染的防卫反应，P．cepacia和B．subtilis处理后，R109内OsMAPK的早期表达与抗病性是一致的，但是HER1受P．cepacia处理还是不处理，OsMAPK的表达量都是相似的。显然P．cepacia、B．subtilis和HpaG_(xoo)在水稻的生长和抗病性上的互作是不同的，然而P．cepacia、B．subtilis和HpaG_(xoo)在抗病性方面的协作在农业生产上具有巨大的应用潜力，生防细菌、Ⅲ型效应因子和病原菌的互作原理值得深入研究。ParAl和hpaG_(xoo)基因同时连接到表达载体pET30a(+)上，构建二元重组质粒pET30a(+)：：parAl：：hpaG_(xoo)，转化BL21(DE3)，生成工程菌株BL21：：parAl：：ApaG_(xoo)。Tris-Tricine缓冲系统电泳发现，有两条15 kDa和10 kDa的目的蛋白。不煮或煮沸半小时处理蛋白质溶液然后注射枯斑型叁生烟叶片观察是否引起过敏反应，得到能同时表达寄生疫霉激发子ParAl和白叶枯病菌激发子HpaG_(xoo)的工程菌。同时表达二者的BL21：：pET30a(+)：：parAl：：hpaG_(xoo)的蛋白粗提液(ParAl：：HpaG_(Xoo)与HpaG_(xoo)和ParAl相比，引起较强烈的烟草微敏反应，效应基因hin1和hsr203表达强烈，诱导烟草强烈的对花叶病毒的系统抗性，病程相关基因(PR1a和PR1b)表达较强烈。由此可见，能同时表达HpaG_(xoo)和ParA1两类激发子的工程菌在农业生产上可能具有广阔的应用前景。总之，激发子HpaG_(Xoo)能与生防细菌P．cepacia、B．subtilis和激发子ParA1互作，影响植物的生长、抗病性和过敏反应。2水稻的两个基因OsLS和osRS的功能本研究首次克隆到分别催化水稻核黄素合成过程的倒数第二步和倒数第一步的关键酶的编码基因OsLS和OsRS。OsLS基因全长666 bp，在氨基酸序列上与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、菠菜(Spinacia oleracea)和烟草(Nicotiana tabacum)的LS基因的同源性非常高，在68-76％之间，根据氨基酸序列分析绘制系统进化树，在同一个进化分枝内。与稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和发光细菌(Photobacteriumphosphoreum)的核苷酸序列完全没有同源性，氨基酸序列有一定的同源性，分别是33％和48％，根据氨基酸序列分析绘制系统进化树，在不同的进化分枝内。在大肠杆菌内能表达出包括His-tag在内的约29．85 kDa大小的OsLS蛋白质。该蛋白质有221个aa，分子量是22，471．44 Da，蛋白质等电点是10．01，是一种碱性蛋白质。远远高于激发子HpaG_(xoo)蛋白质溶液的浓度(100μg／ml)的OsLS蛋白质水溶液注射烟草叶片不能引起过敏反应，这说明该蛋白质本身对植物的细胞没有损害。软件分析该蛋白质定位在叶绿体内，与拟南芥、菠菜和烟草的LS蛋白质的定位相同，OsLS蛋白质单体有5个α螺旋，4个β折叠，5个α螺旋把4个β折叠包围在中间。OsRS序列全长1662 bp，与Gene ID OJ1111H02．Predgene04的不含内含子和非翻译区的序列(no intronsequence and no other untranslated regions)完全一致。NCBI Blast分析，OsRS基因与A．thaliana(拟南芥基因库内的推测序列)、Candida albicans、C．famata、Filobasidiellaneoformans、Sinorhizobium meliloti、Bartonella elizabethae、Saccharomyces cerevisiae、Pichia guilliermondii、P．Phosphoreum、Schizosaccharomyces pombe、E．coli等的RS基因在核苷酸序列和氨基酸序列上都没有同源性，在系统进化树的不同进化分枝内。在大肠杆菌内表达该蛋白质，能表达包括His-tag在内的约66．37 kDa大小的蛋白质。100μg／ml的OsRS蛋白质水溶液注射烟草叶片不能引起过敏反应，这说明OsRS蛋白质本身对植物的细胞没有损害。软件分析该蛋白质有553个氨基酸，分子量是59，589．80 Da，等电点是6．00，酸性蛋白质，定位在叶绿体内，该蛋白质的折迭结构有6个α螺旋，5个β折叠，6个α螺旋把5个β折叠作为核心包围在中间。OsLS和OsRS转基因烟草的游离态的核黄素、FAD和FMN含量都有所升高，而且OsLS转基因的烟草(LST)核黄素含量略高于OsRS转基因烟草(RST)的核黄素含量。LST和RST比转空载体的烟草对照植株(VECT，CK)营养生长旺盛，幼苗期表现更强烈，能使细胞壁疏松、促进植物生长的expansin genes在LST和RST内表达水平比CK表达水平高。LST和RST与对照相比细胞编程死亡和细胞死亡的标志基因hinl和hsr203的表达没有显着差异。与对照相比LST和RST抗病性增强，而且LST的抗病性强于RST。在接种TMV之前，LST和RST的抗病相关基因PR1a、PR1b的表达量都远远高于对照烟草内的表达量，接种TMV之后的同样时间，LST和RST内的PR1a、PR1b都受到诱导表达，受诱导的量远远大于对照烟草内受诱导的量，而且LST内PR1a和PR1b的整体表达水平高于RST内的表达水平。乙烯是重要的介导生长和防卫反应的信号分子，释放量增多能引起植物的生长加快和防卫反应增强。LST和RST比对照烟草乙烯的产生速度快、产生量大，RST在开始的乙烯产生量高于LST，但是LST随着时间变化增长幅度比RST大，LST和RST的生长和抗病的不同表现可能与这种乙烯的释放量有关。活性氧是一种与植物的编程性细胞死亡和抗病性密切相关的信号因子，低浓度的活性氧诱导植物的细胞死亡和抗病性，但是高浓度的活性氧会破坏植物的细胞膜，使植物丧失对病害的抗性。转基因的烟草在不接种病毒的时候，活性氧的产生量与对照烟草活性氧的产生量没有差异，接种病毒后48小时差异增大，对照烟草受到的活性氧的胁迫大于LST和RSt，而且LST活性氧产生量略小于RST，这种消除活性氧的胁迫的差异应该与抗病性的差异有关。构建了OsLS和OsRS的过表达载体和沉默载体，转化水稻幼胚愈伤组织，成功得到OsLS和OsRS过表达的水稻转基因株系，OsgS部分沉默的水稻株系。OsLS发生过表达、完全或部分沉默很可能都对水稻的分化和生长产生严重的影响，转基因过程中发现，OsLS和OsLS片段的发夹结构转化水稻，愈伤组织开始分化比空载体转化的愈伤组织分化迟，但是OsLS片段的发夹结构转化的愈伤组织开始出现绿色后不能继续分化，逐渐褐化死亡。OsLS发生沉默可能是一个致死的过程，这与前人的研究细菌和真菌无法产生LS的突变体在一定程度上是一致的。OsRS转化的愈伤组织分化早，成苗快，OsRS片段的发夹结构转化的愈伤组织分化比空载体转化的愈伤组织分化迟，比OsLS转化的愈伤组织分化早。4个月苗龄的OsRS和OsLS过表达的水稻的游离态核黄素、FAD、FMN都比对照植株转化空载体的水稻(VECR)高；OsRS发生部分沉默的植株(SiRS)与VECR相比核黄素含量降低。OsRS转基因水稻(RSR)与VECR相比，分蘖多、长势好，控制分蘖的基因OsMOC1和生长活跃的标志基因OsGRF1表达量大大高于对照水稻内的表达量，抽穗时间大大提前。SiRS与VECR相比，分蘖较少、长势稍差，OsMOC1和OsGRF1表达量略低于对照水稻内的表达量，抽穗时间稍推迟。OsLS过表达株系(LSR)与对照相比，其分蘖能力和生长势大大下降，OsMOC1和OsGRF1表达量少于对照水稻内的表达量，抽穗时间大大延迟。叁种株系的细胞死亡没有明显差异，也即OsLS和OsRS不影响植株的衰老。接种白叶枯病菌PX099，LSR对白叶枯病的抗性最好，病程相关基因OsPR1b和OsPR10受到强烈的诱导，RSR的抗性有小幅提高，OsPR1b和OsPR10受到较强烈的诱导，弱于LSR；SiRS的抗性明显降低，抗病性几乎完全丧失，OsPR1b和OsPR10几乎不受到诱导表达。与对照水稻相比，LSR和RSR受到的活性氧的胁迫减小，而且OsLS的抑制作用强于OsRS，但是SiRS受到的氧胁迫大于对照植株，较低的合适浓度的活性氧对植物的抗病性是有利的，但是过高浓度的活性氧会大大损害植物细胞。总之，水稻的OsLS和OsRS具有非常重要的作用，分别对抗病和生长有很强的促进作用，都能消除活性氧的胁迫，而且OsLS的消除作用强于OsRS。这两个基因对植物的编程性细胞死亡都没有影响。OsLS在烟草和水稻上对生长的作用不同的原因值得深入研究。这两个基因在水稻的育种中有很重要的应用前景。3烟草NtTRXh基因负调控营养生长，正调控抗病性，与细胞死亡无关克隆到烟草(Nicotiana tabacum)的thioredoxin h-like protein complete CDS序列，该蛋白具有完整的TRX蛋白质的活性位点WCGPC。序列的同源性和系统进化树分析可见，NtTRX-h1(AF435818)与小麦的Tal(AF438359)、大麦的Hvh1(AF435815)和拟南芥的Ath-t1(AAG51342)中的氨基酸序列同源性非常高，分别达到71％、72％和78％，在同一个进化簇内；但是与番茄(Lycopersicon esculentum)的LeCITRX-pt(AF261142)和Solanum tuberosum的StCDSP32(Y09987)的氨基酸序列同源性很低，分别为30％和24％，在不同的进化簇内：与烟草(N．alata)的Nah(DQ021448)的氨基酸序列同源性也不高，为37％，在不同的进化簇内。在大肠杆菌内表达该蛋白质，能表达包括His-tag(大约5，426 Da)在内的约22，260 Da大小的蛋白质。150μg／ml的TRX蛋白水溶液不能引起烟草叶片的过敏反应，这说明该蛋白质本身对植物的细胞没有损害。软件分析该蛋白质有152个aa，分子量是17，022．20(17．02 kDa)，蛋白质等电点(pI)是4．53：很可能是一种线粒体基质空间内和细胞质内的蛋白质，微粒体和线粒体内膜上可能少量存在(或不存在)；TRX蛋白的高级构象有2个α螺旋，5个β折叠。成功构建该基因到病毒沉默植物载体pBinPlus2β：：1．7A上，得到pBinPlus2β：：1．7A：：trx，转化农杆菌EHA105，注射烟草，部分沉默ZRX基因的转录表达。成功构建该基因到含有激发子诱导性启动子的载体pBI121：：PPP1上，得到pBI121：：PPP1：：TRX，转化农杆菌EHA105，叶盘法转化烟草，产生转基因的烟草PPP1：：TRX，以空载体pBI121：：PPP1转化烟草做对照。使用激发子harpin_(Ea)诱导转基因烟草发现，PPP1在受到harpin_(Ea)诱导后，能成功引起烟草内源基因TRX的过表达。TRX基因发生部分沉默的植株(siTRX)营养生长速度都比对照植株快，达到显着性差异，NtEXP1、NtEXP2和NtEXP6基因表达量增长；相反TRX基因发生过表达的植株(OvXRX)营养生长速度都比对照植株(CK)慢，达到显着性差异，NtEXP1、NtEXP2和NtEXP6基因表达量略有下降。SiTRX、OvTRX分别和对照植株相比细胞死亡没有明显差异，细胞死亡标志基因hin1和hsr203的表达水平也没有明显差异。植株的TRX基因发生部分沉默对FMV的抗性明显降低，病斑数大大增多，感病程度升高，达到显着性差异，抗病防卫反应受到严重损害，抗病相关基因PR1a和PR1b在TRX发生沉默但是没有病毒侵染的情况下，表达量高于非沉默植株，这对植物本身不利，造成内源物质的浪费，但是一旦发生TMV病毒侵染，非沉默植株的基因表达量在24小时后迅速高于沉默植株，也就是TRX基因可能干扰了PR基因的诱导表达，相反植株TRX基因发生过表达对TMV的抗性明显升高，病斑数大大减少，抗病性增强，达到显着性差异，抗病性增强，抗病相关基因PR1a和PR1b在TRX发生过表达时一旦发生TMV病毒侵染，OvTRX的基因表达量在24小时后迅速高于对照植株，也就是TRX基因可能增强了PR基因的表达。活性氧与植物的抗病性密切相关，高水平的活性氧产生会使植物迅速丧失抗病能力。接种TMV后，SiTRX和OvTRX活性氧的产生在前24小时与对照植株都没有差异，但是从第48小时，SiTRX的活性氧产生量大大多于CK，大量的活性氧损害了PR基因的诱导表达，破坏了烟草的抗病机制，相反OvTRX的活性氧产生量大大低于CK的产生量，植株受到的氧胁迫降低，抗病性增强。总之，TRX基因抑制烟草的营养生长，诱导抗病性，不影响编程性细胞死亡。全文总结通过上述研究，我们对激发子HpaG_(xoo)与生防细菌和ParA1的互作、水稻核黄素合成过程的酶2，4-二氢喋啶合酶和核黄素合酶、烟草的硫氧还蛋白对植物的生长发育和抗病性的作用有了初步的认识。首先，激发子HpaG_(xoo)能与生防细菌P．cepacia、B．subtilis和激发子ParA1互作，影响植物的生长、抗病性和过敏反应。其次，水稻的OsLS和OsRS具有非常重要的作用，OsLS对抗病性有很强的诱导作用，OsRS对生长具有很强的促进作用，二者都能消除活性氧的胁迫，而且OsLS的消除作用更强烈，这两个基因对植物的编程性细胞死亡都没有影响。这两个基因在水稻的育种中有很重要的应用前景，有利于培育生长周期短、产量高、抗病性好的品种。最后，TRX基因抑制烟草生长，诱导抗病性，不影响编程性细胞死亡。本研究为开发更优化的病害防治策略，培育具有优良生长和抗病性状的品种，研究核黄素信号途径与氧化还原信号在植物的生长和抗病性上的信号网络和目标蛋白的研究准备了坚实的理论基础和转基因材料的物质基础，下一个要解决的问题是寻找这些基因在植物内的目标蛋白和相交叉的信号通路，探索这些通路之间的互作网络。
刘士旺[4]2003年在《生防绿色木霉工程菌的构建及其诱导植物抗病性研究》文中指出植物病害一直是制约农作物丰产的主要因素之一。许多重大病害病原菌的频繁变易，导致抗性作物品种经常丧失抗性，另外化学农药的过量施用使病原菌的抗药性增强，造成防治难度加大。有机农药使用后的残留，造成对生物以及环境的破坏，在一定程度上也造成对人体的危害。因此，随着人们环保意识的增强，生物防治特别是生物农药的使用已成为防治植物病害的趋势，市场对开发新型的生物农药也有着迫切的需求。 植物在同病原物竞争进化过程中，已形成一系列防御机制，过敏反应(HR)和系统获得抗性(SAR)就是这种防御机制的典型表现。某些小分子物质能够诱导植物产生这种防卫反应。这种防卫反应的产生，可以抵抗多种多样的病原物对植物的第二次侵染，类似于人或动物的免疫系统，利用植物的这种诱导抗病性和生物防治菌的特性来开发新型的生物农药应该十分可行。绿色木霉(Trichoderma viride)是一种腐生性生物防治微生物，其对植物病原真菌的拮抗作用包括竞争作用、重寄生作用及抗生作用等方面。如果用木霉来表达诱导植物抗病性蛋白，并利用木霉的腐生特点来传播该蛋白，这将大大增加木霉的应用范围，也为开发可持续利用的生物农药提供一条可行的途径。为了验证这种想法，我们使用了隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)分泌的隐地蛋白(Cryptogein, Crypt)作为诱导植物SAR的激发子。通过基因转化的方法获得了含有隐地蛋白基因以及其第13位点突变基因的绿色木霉工程菌，绿色木霉在作为隐地蛋白的传播载体的同时，呈现了诱导烟草抗病的功能。实验研究的主要内容包括以下几个部分： 1．构建了绿色木霉转化的pCSNTCC和pCSNTCCm载体。 为了能使绿色木霉合成的外源激发子蛋白分泌到培养液中，在Crypt和其突变CrypK13V(PCR定点突变，第13位氨基酸由赖氨酸‘K’突变为缬氨酸‘V’)基因前插入信号肽序列，引导外源激发子蛋白分泌到木霉细胞外，与寄主植物直接作用，诱导植物的防卫反应。在合成信号肽基因ThChi和目的基因Crypt和CrypK13V基础上，以真菌表达载体pCSN43以及PBS载体为基本框架，经过系列酶切、连接以及转化等分子生物学技术，构建了crmt基因转化绿色木霉的真菌表达载体PCSNTCC和0丁贝W3厂基因转化绿色木霉真菌表达载体PCSNTCCm。2．建立了绿色木霉的转化体系。 对绿色木霉原生质体制备和再生条件进行了较详细的分析，并在此基础上，利用限制酶介导进行了木霉原生质体转化。结果表明，木霉原生质体形成的合适条件为：培养24 h的菌丝用4 mg加L的Glucanex在磷酸盐缓冲液中（pH 6．98）、30C、振荡（40 r／min）酶解 4 h，原生质体产量达到 4．7X 10’个加g。原生质体在含 0．3 mol／L肌醇和 0．3 mol／L KCI的 CM培养基上再生率为 14．5％。限制酶 ho介导转化绿色木霉原生质体，其转化率为每微克DNA得到1—2个转化子。转化子的PCR鉴定以及特异酶联免疫测定（ELISA）、wes上ern杂交检测表明，外源基因己转入绿色木霉菌并在培养液中有稳定的产物表达。30株原生质体再生株被确定为稳定的转化子，其中＊－1至＊－20为Cr－yP t基因转化子，TV－ZI至＊－30为o地们3V基因转化子。3．转化子诱导植物抗病性 转化子的抗病分析结果表明，转基因木霉菌株TV七和 TV六4等能够分泌CryPt或CryK13V，木霉出发株及转基因木霉抱子处理烟草2个品种和十字花科植物拟南芥u thalfana）根部 10 d后，离体接种和植株整株接种病原菌，实验表明转化子能够提高烟草对黑腔病菌（PhytOPhthom P。rasftfca varnlcotianad、赤星病菌（Altemarfa alte。ata）和烟草花叶病毒（TMV）的抗性，分子杂交检测表明，转化于能够诱导烟草PR基因的表达。转化于处理拟南芥，接种丁香假单胞菌和立枯丝核菌，离体接种和分子水平杂交均表明，拟南芥抗病性基本没有得到提高，表明Crypt的诱导抗病性具有一定的专化性。4．筛选转化子TV－3发酵培养基 转化于TV－3培养基筛选实验表明，合适的利于工业化的固体生产RPA培养基，组成配比为：40％稻草，5％豆饼粉，15 ％鼓皮，1．5％蔗糖，产抱量达到 3．36 X10’cfu／mL；液体MYG培养基，组成配比为麦芽汁30％，酵母提取物0．l％，葡萄糖1．5％，MgSO。7Hzo 0．l％，KHzPO；0．1％，菌丝生物量达到6．74 mg／mL。
张云华[5]2008年在《灰葡萄孢菌激活蛋白的纯化、基因克隆与功能研究》文中进行了进一步梳理激活蛋白是一类从真菌中分离的、具有激发子功能的新型蛋白质,可诱导多种植物产生系统抗性,促进植物生长,改善作物品质。为了进一步发掘具有我国自主知识产权的新型激活蛋白,本研究从灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)中分离获得了纯化的激活蛋白,确定了该激活蛋白在诱导植物抗病性和抗旱性方面的生物功能;克隆并获得了灰葡萄孢菌激活蛋白基因,分别实现了在大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达,确定了表达蛋白的生物功能。该研究为利用工程菌株获得大量激活蛋白,研究并分析激活蛋白结构与功能的关系,从而为蛋白药物的分子设计奠定了基础。主要结果如下:通过沸水浴、离心、阴离子交换层析等方法,从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株的菌丝体中分离纯化出一种激活蛋白,命名为PebC1(protein elicitor botrytis cinerea1)。经SDS-PAGE银染显示该蛋白呈单一条带,相对分子量约为36kD,等电点为4.85。用胶内酶解的方法,采用MALDI-TOF/TOF等质谱技术对纯化的激活蛋白PebC1进行了肽段序列测定,获得3个重复性较好的可靠肽段。在NCBI上进行比对发现,该蛋白与来源于灰葡萄孢菌的蛋白XP_001551609.1匹配率达95%。功能研究表明,灰葡萄孢菌激活蛋白PebC1能显着促进小麦幼苗生长、提高小麦抗旱性、诱导番茄对灰霉病的系统抗性。不同浓度激活蛋白浸泡小麦种子,11天株高均高于对照,其中以5μg/mL激活蛋白对小麦生长的促进作用最明显;激活蛋白处理的小麦根系活力比对照增加1.29倍,小麦幼苗抗旱综合系数也从36.53提高到57.08,说明激活蛋白增强小麦的抗旱性可能与增加小麦根系活力有一定的关系;用不同浓度的激活蛋白浸泡番茄种子,幼苗生长45天接种灰葡萄孢菌孢子悬浮液(浓度为10~(4)个孢子/mL),接种后14天番茄的病情指数明显低于对照,对灰霉病的诱抗效果达到31.95%～69.19%,其中10μg/mL激活蛋白处理对番茄的诱抗效果最为明显,接种后21天的诱抗效果仍达66.10%,说明灰葡萄孢菌激活蛋白PebC1不仅能显着增强番茄对灰霉病的抗性,而且诱抗效果持续时间较长。测定了PebC1处理后的番茄体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的动态变化。经激活蛋白PebC1处理后,番茄幼苗叶片的PAL、POD和PPO活性均有不同程度的提高,PAL活性在诱导后24小时达最高,较对照增加46.84%;POD活性在诱导72小时出现活性高峰,较对照增加109.5%;PPO活性在72小时出现峰值,比对照增加111.0%。PAL、POD和PPO均是与植物抗病相关的防御酶,番茄防御相关酶活性的提高可能是激活蛋白诱导番茄植株抗灰霉病的主要生理机制之一,该研究为揭示激活蛋白诱导植物抗病性的作用机理提供了理论依据。通过反向遗传学的方法,获得了灰葡萄孢菌激活蛋白PebC1基因的cDNA序列,它与来源于灰葡萄孢菌的基因XM_001551559完全一致。该基因编码的蛋白属于灰葡萄孢菌的alpha-NAC蛋白(nascent polypeptide-associated complex alpha polypeptide),它含有保守的NAC结构域和UBA结构域,与来源于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的激活蛋白PeaT1基因的结构域相同,另外,PebC1和PeaT1二者在编码的氨基酸组成上也有79.4%的相似性,其中完全一致的氨基酸占71.0%。PebC1基因全长639bp,编码212个氨基酸,预测分子量为23080.2,等电点为4.57。亲水性分析发现该蛋白属于亲水性蛋白。进行了PebC1基因的原核表达。以原核表达系统中的pET-28a(+)为表达载体,将重组载体转入大肠杆菌Rossetta(DE3)菌株,通过IPTG诱导获得了PebC1基因的表达产物,利用(?)KTA explorer10蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化,选用Hitrap chelating Column柱进行亲和层析,得到了纯化的重组蛋白,并应用质谱分析鉴定了该基因表达的蛋白质为灰葡萄孢菌激活蛋白PebC1。功能测定结果表明,纯化的重组蛋白能促进番茄幼苗的生长,增强小麦的抗旱性。构建了PebC1毕赤酵母表达载体,获得了具有生物活性的分泌表达蛋白。用PCR法从灰葡萄孢菌cDNA中扩增获得PebC1的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/PebC1。重组质粒经BglⅡ线性化后电击导入毕赤酵母GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法进行筛选,获得了分泌表达的重组毕赤酵母菌株。用甲醇诱导PebC1表达,经SDS-PAGE检测证明,PebC1基因在毕赤酵母中成功分泌表达。生物活性试验表明,表达的PebC1蛋白能够诱导黄瓜幼苗对灰霉病的抗性,具有激活蛋白的生物功能。
孙果忠[6]2007年在《非寄主对大豆疫霉菌抗性的分子机理》文中研究表明由大豆疫霉菌引起的根腐病是影响世界大豆生产的毁灭性病害之一，利用抗病品种是控制该病害最经济和有效的措施。然而，由于大豆疫霉菌小种的高度变异性导致品种抗性极易丧失。挖掘持久的抗病基因已成为抗病育种的难题。与单个的抗病基因控制的“基因对基因”抗性不同，非寄主抗性是植物最有效和持久的一种抗病机制。因此，找到非寄主对大豆疫霉菌抗性反应的关键基因，就可能利用基因工程手段创造广谱和持久的抗性材料。本研究的目的就是寻找非寄主拟南芥和烟草对大豆疫霉菌信号识别和抗性反应相关的基因，为从分子水平上解释非寄主对大豆疫霉菌抗性的机理提供依据。本研究获得了以下主要结果：1．大豆疫霉菌无性世代存在很高的毒力变异率，变异率的大小受大豆疫霉菌分离物和寄主基因型的共同影响。非寄主拟南芥和烟草对大豆疫霉菌侵染表现出不同的抗性反应：在拟南芥上不产生可见的症状，而烟草表现出与非亲和大豆寄主类似的局部坏死现象。与侵染叶片不同，在离体共培养条件下，大豆疫霉菌游动孢子对非寄主、非亲和寄主及亲和寄主的悬浮细胞均具有致病性。2．在蛋白质组水平上揭示了大豆疫霉菌诱导的大豆和拟南芥系统获得抗性的差异。在大豆上，伤口、水杨酸和大豆疫霉菌诱导的蛋白表达模式非常一致；而在拟南芥上，大豆疫霉菌与伤口诱导的蛋白表达模式一致，但与水杨酸诱导的存在较大差异。因此，大豆疫霉菌诱导的系统获得抗性在大豆上主要依赖水杨酸介导的信号传递途径，而在拟南芥上不依赖水杨酸的信号传递途径起着重要作用。大豆疫霉菌诱导的大豆和拟南芥差异表达的蛋白质功能相似，主要是与物质代谢相关的酶和各种调节因子，表明二者产生系统获得抗性反应的分子基础可能是相同的。3．利用与gateway技术兼容的酵母表达系统对来源于EST和基因组的大豆疫霉菌激发素家族的21个基因的开放阅读框架进行了克隆和表达，并通过接种烟草和拟南芥含表达产物的酵母上清进行了功能分析。结果表明，利用上述体系进行病原菌胞外蛋白的基因挖掘是可行的。激发素在不同非寄主植物抗性反应中的作用机制存在差异，在烟草上引起叶片的系统性坏死反应，而在拟南芥上可诱导接种部位周围细胞的细胞壁明显加厚。多数类激发素可以抑制酵母引起的烟草叶片坏死，表明激发素家族可能具有抑制一般激发子诱导的烟草坏死反应的功能。4．利用酵母双杂交技术从烟草和拟南芥中筛选了与激发素SOJB和类激发素PPSE7互作的蛋白。SOJB分别从烟草和拟南芥中筛选出了14个和13个蛋白；PPSE7分别从烟草和拟南芥中筛选出11个和14个蛋白。SOJB和PPSE7在拟南芥和烟草中存在几个相同的结合蛋白，表明二者具有共享的生物功能。在烟草中，SOJB能与蛋白质降解有密切关系的两个蛋白—肽酶和泛素结合蛋白互作，而PPSE7没有筛选到类似蛋白；这于本研究中SOJB的作用相符。SOJB和PPSE7均能与跨膜运输蛋白结合，PPSE7与水通道蛋白，SOJB与铜离子转运蛋白；表明二者在胞质内存在作用靶标。在拟南芥中，筛选出两个与PPSE7和SOJB结合的激酶，PPSE7与ATP结合激酶，SOJB与假定的受体激酶；这是在拟南芥中首次发现与激发素结合的受体激酶。5．构建了21个目标基因的gateway兼容的RNAi表达载体，为进一步分析这些基因的功能做好了准备。
黄木坤[7]2010年在《辣椒疫霉elicitin基因及白菜BpERF1基因的功能分析》文中认为辣椒(Capsicum annuum L.)和大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)是在我国广泛种植的重要蔬菜,病害及其它各种非生物逆境始终困扰着这些蔬菜生产,影响其产量、品质和效益。培育和推广应用抗逆性强的品种或者采取更为有效的管理措施以解决上述问题已经越来越迫切,作为上述技术策略的重要基础,开展蔬菜的抗逆分子机制研究,鉴定其基因组中具有重要应用价值的抗性基因并在蔬菜抗逆基因工程中加以应用已经引起了人们高度关注,成为国际生物学界当前十分活跃的研究领域。本研究选择在蔬菜抗逆(病)反应中可能起重要调节作用的辣椒疫霉激发子elicitin和大白菜乙烯应答因子(BpERF1),运用原核表达、酵母双杂交技术对两个辣椒疫霉elicitin基因进行初步功能研究以及通过亚细胞定位、瞬间表达技术和转基因烟草T2代抗逆分析研究大白菜BpERF1基因的功能,取得了以下研究结果:1.通过设计特异性引物和RT-PCR扩增,获得了2个辣椒疫霉elicitin基因的全长cDNA,其中elicitin7与大豆疫霉推定的elicitin SOJ3A有80%同源序列,elicitin24与辣椒疫霉capsicin有96%同源序列。上述2个elicitin激发子cDNA的推导氨基酸序列上均含有信号肽,都为酸性蛋白,都具有elicitin超家族保守的结构域。进一步聚类分析,结果表明上述2个激发子都属于α-elicitin。上述2个elicitin阳性克隆的原核表达产物都可诱导烟草K326产生过敏反应。2.运用Gateway克隆技术,以上述2个elicitin阳性克隆的cDNA为诱饵,构建了用于酵母双杂交的诱饵载体,3AT自激活检测结果显示这2个elicitin基因诱饵载体无自激活现象,其最低3AT浓度为50 mM。用上述2个诱饵载体筛选辣椒cDNA文库,2个elicitin蛋白分别筛选到了1个和10个互作蛋白的阳性克隆,经测序和同源性搜索,这11个阳性克隆分别是大豆冷调节基因类似蛋白(SRC2-like protein)、泛素连接酶相关蛋白(SGT1)、β-微管蛋白(beta tubulin)、长链脂酰辅酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase 6)、生长素抑制蛋白(auxin-repressed protein)、推定的线粒体磷酸运载蛋白(putative mitochondrial phosphate carrier protein)、光合放氧复合物(photosystem II oxygen-evolving complex protein 3)以及4个未知功能的蛋白。这些蛋白分别与植物防御反应、生长、钙离子流,蛋白降解、细胞骨架构成、脂肪酸代谢、光合作用以及呼吸作用有关。3.亚细胞定位结果显示BpERF1是一个核定位蛋白,瞬间表达分析结果表明BpERF1可结合GCC盒,但不能与DRE元件结合。用BpERF1超表达烟草T2代株系的植株分析BpERF1超表达对转基因烟草抗各种逆境胁迫的影响,结果发现BpERF1超表达对转基因植株耐高盐、干旱和低温等作用不明显,但可增强转基因植株对高温的敏感性。人工接种辣椒青枯病病原菌,结果发现BpERF1超表达可提高转基因烟草植株抗辣椒青枯病的水平,这与上述瞬间表达的结果即BpERF1可与GCC盒结合而不与DRE元件结合的结果是一致的,推测BpERF1可能主要参与对生物胁迫的防御反应。4.鉴于BpERF1超表达可提高转基因烟草对高温的敏感性,本研究进一步分析了BpERF1超表达提高转基因烟草对高温敏感性与活性氧代谢和细胞膜脂过氧化之间的可能关系。结果发现转基因烟草和对照均表现出MDA含量与APX活性呈上升趋势,而SOD、CAT呈下降趋势,POD活性则是呈先降后升的趋势。但是,BpERF1超表达的转基因植株中MDA量和H2O2的DAB染色显示显着高于野生型对照,而SOD、CAT和APX等活性氧清除系统都比对照低, POD活性在前期比对照高而后比对照低。这些结果表明BpERF1超表达提高转基因植株对高温敏感性可能与该基因超表达对活性氧代谢和膜脂过氧化的影响有关。
蒋冬花[8]2002年在《隐地疫霉（Phytophthora cryptogea） Cryptogein基因的克隆及其功能的研究》文中认为激发素(elicitin)是一类由卵菌纲(Oomycete)的疫霉属(Phytophthora)和腐霉属(Pythium)真菌分泌的蛋白类激发子，在烟草与疫霉菌的互作中起无毒因子作用。隐地蛋白(Cryptogein)由隐地疫霉(P. cryptogea)所分泌，该激发素在极低浓度下能诱导烟草产生过敏性反应(HR)，并使植株获得广谱抗病性(SAR)。可以预见，将Cryptogein基因转入烟草植株中表达应能诱导产生完整的抗病防卫反应，提高对多种病原物的抗性。因此本研究以隐地疫霉为基因源，克隆了Cryptogein(Crypt)基因并经PCR定点突变获得了13位氨基酸突变的CryK13V基因，构建了这两种基因的植物双元表达载体，并转化了烟草。对两种转基因烟草的抗病性、耐盐性、农艺性状、抗病耐盐分子机理及T1代的遗传特性等进行了初步的研究。具体结果如下： 1 目的基因的克隆和改造：根据已知的核苷酸序列，设计一对引物，以隐地疫霉的基因组DNA为模板用pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，获得了一长度约为300bp的PCR产物，用酶切鉴定和测序分析证明克隆的Crypt基因与已报导的序列相同。进一步用一对突变引物进行PCR定点突变扩增，获13位赖氨酸(K)突变成缬氨酸(V)的PCR产物(OryK13V)，与pUC-mT载体连接后(pUC-CryK13V)通过酶切鉴定和测序证实与预期结果相一致。 2 构建了两个植物双元表达载体：针对Crypt基因的生物学活性和大多数病原菌从根、茎、叶等的表皮细胞侵入的特点，选用弱组成兼病菌诱导型，并能在表皮细胞中特异性表达的水稻苯丙氨酸解氨酶基因PAL启动子控制Crypt基因的表达；对突变基因CryK13V则选用35S强启动子控制。由于Crypt蛋白作用的受体位于植物细胞膜上，因此，在Crypt和CryK13V基因前设计了分泌结构(PR1b信号肽序列)；选用具有卡那霉素抗性植物双元表达载体CHF3，构建了两个植物双元表达载体CHF3-PAL-PRs-Crypt和CHF3-35S-PRs-CryK13V。用冻融法将含Crypt和CryK13V基因植物双元表达载体分别转入根癌农杆菌EHA105菌株中，通过PCR鉴定阳性的转化子用于烟草的转化。 3 转基因烟草植株的获得：将含Crypt和CryK13V基因的农杆菌与烟草叶盘共培养。经卡那霉素抗性筛选分别获转Crypt和CryK13V基因的再生植株22株和33株，PCR检测有21株和30株为阳性；部分植株的Southern杂交结果表明Crypt和 C仙JV基因己以低拷贝门～3个）整合到烟草基因组中。N0rthem杂交分析和 RTPCR检测结果表明 Cypt和 C他叁厂基因在转化烟草植株中有低水平的表达。 4 TO、TI代转基因烟草植株的抗病性分析：用不同接种方法测定转基因烟草植株的抗病性，统计分析结果表明，约一半（54．9％）的植株同时对烟草上3种重要病原菌高抗，80％左右的转基因植株对 3种病原菌的抗性比对照增强。引株转基因烟草植株中对烟草黑脏病菌高抗（0级）的有35株，抗病门～二级）的有8株，感病（3级）的有8株。对烟草赤星病菌高抗（0级）的有33株，抗病门～2级）的有9株，感病（3级）的有9株。大部分转基因烟草植株（81．8％）对烟草野火病均表现为高抗（0级）。而未转基因的烟草植株对3种病原菌均表现为感病。表明大部分转Cyp t和Cp 3厂基因烟草植株具有广谱抗病性。转Cyp t和CyK 3厂基因烟草植株对烟草上3种病原菌的抗性反应基本相近。 5 转基因烟草的耐盐性测定：将转基因和非转基因烟草种子播于含200 mMNaCI的1o 培养基上测定耐盐性。结果表明：大部分转基因烟草小苗的耐盐性比对照强，在含 200 mM NaCI的 1o 培养基中生长 40 d左右，转基因烟草小苗生长和生根基本正常；而转未转基因的烟草种于萌发后生长和生根明显被抑制，最后死亡。表明转基因烟草的耐盐性显着增强。 6 转基因烟草植株抗病、耐盐增强的分子机理初探：用Northern杂交对抗病。耐盐分子机理进行了初步探讨。结果表明：具有高水平 PR－la蛋白积累的转基因植株具有更强和更广的抗病性；PR－la等防卫反相关基因快速和超量诱导表达可能是转基因植株抵抗病原菌侵入的另一种机制。转录因子OPBI的活化与转基因烟草植株的耐盐、抗病性有一定的正相关性；渗调蛋白PRJ基因高水平组成型或诱导型表达也是提高转基因烟草植株耐盐性的原因之一。 n Cptogin基因对烟草其它农艺性状的影响：大部分转基因植株生长正常，并在长势、植株高度、生育期等有一定程度的改变，表现为苗期促进发棵，生长期长势旺盛、植株高度增加，生育期缩短，开花提早。也有少数转基因植株表现为矮化，不能正常现蕾、开花、结籽等异常现象。 8 TI代转基因烟草遗传分析：以卡那霉素抗性为筛选标记结合PCR检测，对部分＊代转基因烟草进行分离比测定，同时结合Southern杂交估算整合的拷贝数。结果转基因烟草TI代的分离基本符合孟德尔 3：1、15：1和 64：1的遗传规律。大多数转基因植株以单拷贝整合，少数为2个或3个拷贝整合。TO代抗病的转基因植株 TI代普遍表现为抗病，表明整合的 Cypt和 CIyK二厂基因己稳定遗传和表达。
王新乐[9]2008年在《大豆疫霉RXLR效应分子的筛选及Avh238的功能研究》文中提出大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann)侵染大豆引起的大豆根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一,每年造成大豆10多亿美元的损失。大豆疫霉隶属卵菌门,在进化上与真菌相差甚远,和藻类同属于茸鞭生物界,尽管和其他真菌一样呈丝状生长,但是其致病机理与其他真菌差异显着。RXLR类效应分子的发现促使本研究就大豆疫霉RXLR效应分子进行了功能筛选,并对其中一个引起烟草细胞死亡的效应基因Avh238进行了功能研究。利用PVX病毒表达载体对大豆疫霉RXLR效应分子的功能研究。卵菌含有RXLR-dEER基序的效应蛋白在病原物与植物互作过程中具有抑制植物防卫反应的作用。生物信息学分析表明大豆疫霉的基因组中含有超过350个的RXLR类效应分子。为了确定这些候选效应分子中哪些真正具有抑制植物防卫反应的功能,本研究以老鼠细胞凋亡蛋白诱导因子Bax为激发子,采用双元病毒表达载体Potato virus X vector(PVX)在本氏烟Nicotiana benthamiana中表达了32个候选效应分子,通过分析这些效应分子对BAX诱导HR的抑制作用,从中筛选了13个RXLR效应分子能够抑制老鼠凋亡蛋白Bax诱导的过敏性反应;另外得到10个效应蛋白可以诱导烟草发生细胞死亡,对这10个效应分子在烟草上引起的表型进行了详细的研究,同时对它们在大豆疫霉发育阶段的转录水平进行了分析。本研究结果表明大豆疫霉RXLR效应分子既可能起到毒性功能抑制植物的防卫反应,同时有一些效应分子也可激活寄主防卫反应。大豆疫霉RXLR效应蛋白Avh238的功能研究。大豆疫霉含RXLR-dEER基序蛋白除了包含许多能够抑制植物细胞过敏性反应的效应分子之外,也有部分蛋白可以直接诱导植物过敏性反应。本章就一个含有RXLR基序能够诱导烟草细胞死亡的效应分子Avh238的功能进行了详细的分析。本研究构建了Avh238基因的PVX表达系统,发现该基因编码产物能够在本氏烟和W38烟草上发生过敏性反应。同时,利用基因枪粒子轰击法表明该基因表达产物也能导致大豆细胞死亡。RT-PCR分析表明该基因能够诱导烟草PR基因PR1aPR1bPR1c的上调表达。其具有RXLR家族的保守结构域包括信号肽序列及RFLR-dEER基序。将序列在Swiss-Prot,EMBL,和GenBank中比对发现此蛋白与已知蛋白序列无明显同源性。功能域分析表明此蛋白诱导细胞死亡的主要位置在其C末端,不需要信号肽、RXLR-dEER基序的参与。RT-PCR及Microarray分析结果表明Avh238在休止孢萌发阶段特异表达,同时该基因在侵染早期6-24h高度上调表达,而在互作的48小时后表达量显着下降。揭示该基因在病原菌从活体寄生到死体营养的转变过程中可能起非常重要的作用。将该基因在大豆疫霉菌株中过量表达,转化子的致病性显着下降,提示该基因编码产物可能起到胞内激发子的功能。
王群青[10]2010年在《RxLR效应分子协同互作控制大豆疫霉对寄主侵染过程》文中指出大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性的病害之一,每年导致全球高达十几亿美元的直接经济损失。大豆疫霉是一类营半活体营养的病原卵菌,在侵染寄主的初期营活体营养,待成功侵入之后转入死体营养阶段。因此大豆疫霉的侵染过程中必然存在着复杂的分子机制来操纵植物的细胞死亡。目前的研究发现,大豆疫霉分泌的RxLR类效应分子如Avrlb等能够进入寄主细胞内,抑制植物的防卫反应,从而促进自身的侵入和扩展。生物信息学发现大豆疫霉基因组中RxLR家族效应分子有超过350个之多,如此众多的效应分子如何在大豆疫霉的致病过程中相互协调发挥作用目前还缺乏系统的研究。本研究通过对大豆疫霉RxLR类效应分子的转录谱的分析、抑制植物过敏性细胞死亡及与之相关关键氨基酸位点的功能筛选、不同生理小种间序列多态性分布等进行了多方面的研究,初步阐明了大豆疫霉RxLR家族效应分子在大豆疫霉致病过程中通过相互协调抑制植物防卫反应的机制。大豆疫霉RxLR类效应分子的程序化转录和功能相互作用抑制植物的防卫反应：本研究对170个RxLR效应分子的功能进行了初步分析。研究中发现虽然有少数效应分子(11个)能够直接激发植物的免疫反应,但有超过75%的效应分子对老鼠细胞凋亡前体蛋白Bax引起的植物细胞死亡具有抑制作用,而其中具有C端保守W结构域的RxLR效应分子对Bax触发的PCD(BT-PCD)具有更显着的抑制活性。系统比较分析了W结构域各氨基酸组成与抑制BT-PCD之间的关系,鉴定了8个与之相关的位点。而氨基酸位点突变实验证明位于W结构域第二个α螺旋的疏水性氨基酸与抑制BT-PCD的功能显着相关。研究中还发现RxLR效应分子的功能与其表达水平有显着关联,随着表达时间和表达丰度的积累,抑制BT-PCD的活性也随之增强。本文利用MicroArray数据对大豆疫霉的效应分子进行转录水平的研究,鉴定出20个在大豆疫霉侵染前期受诱导高量上调表达的效应分子。按照这些效应分子的表达丰度和转录调节进行划分,将其分为叁种表达模式,即侵染前期表达量持续较高(][mmediately-Early effectors, IE)和侵染早期6-12h受诱导上调表达(Early effectors,E)以及虽然在前期诱导表达但是表达量和上调量都相对较低(Early-weak)叁种表达模式。利用Real-time PCR对亲和互作中的效应分子表达模式进行验证,发现在不同菌株中的效应分子表达模式基本一致,推测这种表达模式是程序化的,可能与其功能实现有关。而利用大豆疫霉转化技术干扰两类表达量较高的效应分子中的关键基因Avh238和Avh172的转录水平,破坏其转录表达模式,则导致菌株致病力明显下降。说明这种程式化的转录模式一旦发生紊乱,就会影响菌株的毒性,同时也证明两类高表达的效应分子在侵染过程中都具有重要作用。对不同表达模式的效应分子的功能做进一步研究分析发现,E类的效应分子能够特异性抑制PAMP触发的植物免疫反应,而IE类效应分子则特别对效应分子触发的PCD有活性。两类效应分子分别针对植物免疫系统的不同层面,推测可能合作抑制植物防卫反应。本研究在烟草上成功模拟了两类效应分子的合作模式：卵菌的PAMP被植物的膜上受体识别激发PTI,诱导E类效应分子如Avh238在侵染前期高量上调表达,引起植物包括非寄主烟草和寄主大豆的PCD,而在侵染过程中一直表达量较高的Avh172则能够抑制Avh238引起的PCD,而两者的同时存在还能够抑制INF1以及MAPK信号通路在烟草上引发的过敏性细胞死亡,证明两类效应分子能够依靠功能互补来广泛抑制植物的防卫反应。本研究还发现Avh238在不同菌株中的等位基因存在着高度的序列多态性。其中来自菌株P7076的Avh238等位基因产物在烟草中的表达产物不能引起HR。功能实验则证明Avh238P7076能够抑制在烟草叶片上瞬时表达卵菌PAMP-INF1以及下游的MAPK信号通路所引起的HR反应。证明这种序列的多态性能够帮助RxLR效应分子逃避植物对其的识别作用,但不会影响其本身的毒性功能。对所有已知的无毒基因和两类在侵染中高表达的效应分子序列进行分析比较也发现,这种序列多态性在RxLR家族成员中普遍存在,说明其作为卵菌直接与植物互作的蛋白,面临着巨大的选择压力,所以进化速度非常快。而对Avh238的进一步研究发现,其蛋白序列第51及第76位氨基酸与其触发植物免疫反应显着相关,但这两个氨基酸并不位于已知的功能域上。说明这种序列的多态性能够帮助RxLR效应分子逃避植物对其的识别作用,但不会影响其本身的毒性功能。
参考文献：
[1]. 寄生疫霉Elicitin基因克隆、表达及Elicitin诱导植物抗病防卫的机制研究[D]. 梁元存. 山东农业大学. 2002
[2]. 烟草表皮毛蛋白NtTTG1与转录因子AtMYB44调控植物防卫反应信号传导的机制[D]. 刘若雪. 南京农业大学. 2010
[3]. 生物激发子与氧化还原相关信号对植物生长和抗病性的调控作用[D]. 任海英. 南京农业大学. 2006
[4]. 生防绿色木霉工程菌的构建及其诱导植物抗病性研究[D]. 刘士旺. 浙江大学. 2003
[5]. 灰葡萄孢菌激活蛋白的纯化、基因克隆与功能研究[D]. 张云华. 沈阳农业大学. 2008
[6]. 非寄主对大豆疫霉菌抗性的分子机理[D]. 孙果忠. 中国农业科学院. 2007
[7]. 辣椒疫霉elicitin基因及白菜BpERF1基因的功能分析[D]. 黄木坤. 福建农林大学. 2010
[8]. 隐地疫霉（Phytophthora cryptogea） Cryptogein基因的克隆及其功能的研究[D]. 蒋冬花. 浙江大学. 2002
[9]. 大豆疫霉RXLR效应分子的筛选及Avh238的功能研究[D]. 王新乐. 南京农业大学. 2008
[10]. RxLR效应分子协同互作控制大豆疫霉对寄主侵染过程[D]. 王群青. 南京农业大学. 2010