潘敏慧[1]2001年在《家蚕病原性微孢子虫SCM_8的研究及Endoreticulatus bombycis SSUrRNA核酸序列的分析》文中认为微孢子虫是一类专营细胞内寄生，无线粒体的单细胞原生动物。微孢子虫的动物学分布范围非常广，能感染寄生脊椎动物和无脊椎动物，是经济昆虫、鱼类、兔类、皮毛动物、啮齿类及灵长类的致命病原。从1857年Nageli在家蚕中发现家蚕微粒子（Nosemabombycis）后，近二十年来，已相继从家蚕体内分离到微粒子虫属（Nosema）、具褶孢虫属（Pleistophora）、泰罗汉孢虫属（Thelohania）、变形孢虫属（Vairimorpha）和内网虫属（Endoreticulatus）等其它病原性微孢子虫。由于家蚕微粒子能经卵传染危害家蚕子代而被列为蚕种生产的检疫对象，因此对家蚕病原性微孢子虫的病理生物学、分类及鉴定等的研究就显得尤其重要。微孢子虫因被认为是与生物进化有关的最原始的真核生物而倍受关注，由于SSUrRNA普遍存在于真核生物和原核生物的核糖体中，其一级结构种系的保守性表现在所有种系中，比编码蛋白质的基因保守100倍以上，且碱基长度适中，碱基变化的积累以一种类似计时器的方式进行，因此，SSUrRAN在生物进化和系统演化研究中是一个良好的分子指标，已被广泛应用于生物的进化分析和分类，对微孢子虫的SSUrRNA核酸序分析也成为研究的热点。本研究以1997年从蚕体分离到一种次小形微孢子虫SCM_8（SC—四川、M_8—微孢子虫的分类编号）为研究对象，对其病理生物学和分类等进行研究，同时，本研究还对微孢子虫SCM_7（Endoreticulatus bomybicis）的SSUrRNA基因进行克隆和分析，并对微孢子虫门的系统发育和进化进行研究。现将研究结果报告如下： 一、家蚕病原性微孢子虫SCM_8的病理生物学及分类 1、家蚕病原性微孢子虫SCM_8孢子单核，卵圆形，大小介于SCM_7和Nosema bombycis之间，并随继代数的增加而趋小，到第叁代时大小稳定，与SCM_7相近，其第一代大小为2.82±0.21×1.89±0.13μm，第叁代大小为2.31±0.21×1.25±0.18μm。成熟孢子的孢壁由外壁（EX）、内壁、质膜等叁层组成，外壁较薄，表面粗糙。极膜层前部结构致密，后部结构相对疏松。孢子的极丝单列，9～10圈，极丝倾角为：42℃。后极泡圆形，较大。 电镜下的生活史表明，SCM_8的生活史单型，所有时期核不成对，发育周期为9—10天。蚕体内发育的裂殖体生殖呈带状分裂，核大而细胞质较少，以多分裂的方式进行增殖。裂殖体生殖形成的裂殖体近椭圆形，外被寄主细胞的内质网膜（HER）。母孢子原生质团的质膜与HER分离，并以出芽方式进行原生质团的分割，形成多个单核孢子母细胞，在孢子母细胞内可观察到诸如极丝形成等孢子的成熟过程，内质网膜成为多孢孢囊膜。孢囊内有几个至数十个孢子不等，孢囊破裂后可游离出单个孢子。 2、家蚕病原性微孢子虫SCM_8仅感染寄生家蚕的中肠上皮组织，具食下传染，无胚种传染能力，致病力较弱，感染中量（IC_(50)）为：1.29×10~5，病程12天以上。 3、通过对微孢子虫分类的检索，由于微孢子虫SCM_8无双核，在所有阶段核不成对，符合单倍用纲的特征，应归周于单倍用纲：既M。有前抱子生殖期增殖，抱子卵圆形或梨形，这与伍留目的特点相似，应归用于格留目。 SCN与格留目中的内冈虫回澈抱子虫SCM，（EndNticufot。ho咖ids）有相似之处，二者均寄生家蚕，寄生组织均为中肠上皮组织，界面膜均为寄主细胞的内质网膜，二者的典型发生地均在中国重庆。不同之处为：SCMe ％于的大小发生了变化，抱子成戮不同步，由出芽的先后顾序而定，抱于的极丝田数9l0四；而SCM7的抱子大小未发生变化，原生质团分割时，核与原生质的分界明显，抱子母细胞形成成熟抱子同步，抱子的极丝回技卜－9圈；并且二者的SSUrtu序列的酶切位点也有很大的差异，而SCM与同用的blcettculatus schubeof的ssur删序列的酶切位点完全相同。鉴于此，目前还不能准确确定S皿的科、属．故Spe的分类地位为： 砌1啊 Microsnora CI山．11 H8ploPhasea of．n orforl Glop6ida ISSi，棚6 F－fly Uncertain G巴ifer巴 ＊lC6Yt81R ＾、戳胞于虫 SCM7（Ende～or一 hope）88U删A fN的克回和分析 卜采用Percoll法对叁种微抱子虫Nbo帆is、SCMI和SCMS进行纯化，用不同方法分别制备叁种微抱子虫的DNA，虽然获得量变化不大，但TEK 法（用KOH＋Tris－HCI＋EDTA＋KCI进行发芽处理）对叁种微抱子虫的DNA损伤小，抽提的DNA较完鳖，而常规方法（用NaCO。waAC进行发芽处理）则对小型微抱子虫的洲A损伤较大，容易引起小型徽抱子虫基因组DNA的断裂，对进一步的实验和研究极为不利。因此，TEK法不仅适用于家蚕撇粒子抱子DNA的抽提，而且适合于小型微泡子虫DNA的制备。 2、利用徽抱子虫SSUrMA ＄因共有的保守序列对徽抱子虫SCM7的SSUrRNA核心序列的引物进行了设计，N b删js、SCM和 SCK叁种徽抱子虫的 PCR扩槽产物均为一条分子量1200hP左右的特异片段，将经回收的SCM，、SCN的PCR产物用限制性内切酶EcoRy、BcoRI、Xbal、Apall、Smal、Hae
万永继[2]2005年在《家蚕病原性微孢子虫若干种群的研究与控制》文中研究说明微孢子虫(Microsporidia)是一类专营细胞内寄生、无线粒体的单细胞真核生物,是昆虫、鱼类及哺乳动物的病原微生物。家蚕微粒子(Nosema bombycis Naegeli 1857)是人类最初认识的微孢子虫,由于能通过胚胎传染从母代传染危害子代而被列为检疫对象。近数年来我国蚕种生产由于微孢子虫的感染损失惨重,过去一直认为家蚕微粒子Nosema bombycis是唯一的寄生病原。本研究以四川蚕区为研究对象,对家蚕微粒子病及其病原的发生状况进行了流行病学研究,构建了时间流行曲线、病害管理模型和病原种类的地域分布,发现了其他寄生家蚕的微孢子虫的新种群,从家蚕体内分离出两种新型微孢子虫并进行了分类鉴定,即大型微孢子虫SCM_6(Nosema sp)和小型微孢子虫SCM_7(Endoreticulatus bombycis sp. nov.)。 大型微孢子虫SCM_6孢子卵园形,大小为3.91±0.25μm×2.56±0.28μm,极丝长度126±8.35μm;孢子双倍核,极丝绕核排列14～15圈,偶有16圈;发育过程具有裂殖体和孢子形成期,产孢体以二分裂形成两个孢子母细胞,然后形成成熟孢子,表现为Nosema属的发育特征;可寄生蚕体的多数组织,寄生程度以后部丝腺为重,但在中肠的寄生繁殖和孢子的形成较弱,生殖腺偶有寄生;胚传率低于家蚕微粒子Nosema bombycis 10倍以上,为1.44±0.75%,对蚕子代群体的发育无明显影响;生物学分类与家蚕微粒子Nosema bombycis同属异种,记录为Nosemasp。 小型微孢子虫SCM_7孢子卵园形,大小2.26±0.21μm×1.19±0.81μm,极丝长度39.90～60.18μm;孢子单核,极丝绕核排列7～9圈,裂殖体和孢子的发育均包被在宿主内质网膜形成的孢囊内,并在孢囊内形成许多孢子,表现为内网虫属Endoreticulatus的发育特征;只寄生中肠上皮组织,不感染生殖腺;无胚传致病性。分类检索表明该微孢子虫为一新种,鉴定记录为家蚕内网虫(Endoreticulatus bombycis sp nov);其16S rRNA的核心序列为1230pb,与修氏内网虫Endoreticulatus schubergi有98%以上的同源性。 根据大型微孢子虫SCM_6和小型微孢子虫SCM_7弱度胚传和不胚传的特点,进一步研究制定了与家蚕微粒子Nosema bombycis不同的检验技术、母蛾的病率计算方法及合格标准,并成功地应用于疫区。据蚕种生产和检验机构反馈的应用结果,已挽回了大量的蚕种损失和巨大的经济效益。对家蚕病原性微孢子虫的新种群的研究取得了在理论和实践上的突破性进步,为国内外创新成果,解决了长期困扰我国蚕种生产的一个重大难题。 另一方面,从四川省阆中市蚕桑生态系统周围的林木害虫龙眼裳卷蛾幼虫体内发现分离到一种新的微孢子虫。孢子卵圆形(3.1±0.3μm×1.6±0.2μm),孢子发育中呈现出八孢子囊孢和二孢子母细胞类型,为变形孢虫属的典型特征,分别形成单核孢子和双核孢子,极丝圈数分别为7～9圈和10～12圈;从宿主、大小、极丝、发育等的差异检索表明:为微孢子虫门变形孢虫属(Vairimorpha Pilly 1976)一新种,记录为裳卷蛾变形孢虫新种(Vairimorpha Ceracessp. nov.)。通过对裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp. nov.)转家蚕、鱼类的感染试验,本文研究了微孢子虫的感染生态问题。同时,对微孢子虫感染性变异机制研究的重要性进行了讨论。
潘秋玲, 李田, 何强, 马振刚, 范晓东[3]2015年在《家蚕微孢子虫中小RNAs的全基因组鉴定与分析（英文）》文中进行了进一步梳理【目的】家蚕Bombyx mori微粒子病是蚕业生产上的毁灭性病害,家蚕微孢子虫Nosema bombycis是该病的病原,可经卵垂直传播和经口水平传播。为了探索家蚕微孢子虫中对重复元件的抵御以及对基因转录调控的潜在方式,本研究拟在基因组水平上对该物种的小RNAs进行全面系统的分析,鉴定与转座子相关的小RNAs和潜在的miRNAs。【方法】从感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠中提取总RNA,分离小片段RNA并反转录后,进行Solexa高通量测序。通过生物信息学方法对小RNAs进行分类及功能注释,鉴定起源于家蚕微孢子虫不同类型转座子的小RNAs,并对潜在的miRNA进行预测分析。【结果】家蚕微孢子虫小RNAs的长度主要是24和25 nt,其中大部分序列表现出5'末端的尿嘧啶偏好性。家蚕微孢子虫中存在丰富的与转座子相关联的小RNAs,并且与转座子标准序列匹配的反义小RNAs明显多于正义小RNAs。同时,鉴定获得了31个候选miRNAs,部分为Nosema属的其他孢子虫中所共有,暗示其在微孢子虫基因组进化上具有保守性。【结论】首次鉴定到家蚕微孢子虫的转座子相关性小RNAs,暗示小RNAs在家蚕微孢子虫基因组对转座子防御过程中起到作用,31个潜在的miRNAs为家蚕微孢子虫miRNAs的功能验证提供了后续靶标。
马强[4]2013年在《家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究》文中研究说明微孢子虫作为专性的细胞内寄生生物,其生活史的完成必须严格依赖于宿主提供的营养和能量。家蚕微孢子虫是家蚕微粒子病的病原,其侵染和致病机理目前仍不清楚。普遍的观点认为,家蚕微孢子虫通过释放蛋白酶,水解寄主细胞内容物,掠夺宿主营养物质,完成其在宿主家蚕细胞内的增殖。因此,分泌性蛋白酶被认为是致病性真菌重要的毒力因子。这些蛋白酶不仅参与孢子的入侵过程,还可以与宿主的免疫系统相互作用。类枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin-like protease,SLP)为丝氨酸蛋白酶家族成员,广泛存在于细菌、真菌和寄生虫等生物中。近年研究表明,类枯草杆菌蛋白酶与病原性细菌、真菌的致病性相关,在真菌孢子形成、蛋白质降解及细胞自噬等方面起着非常重要的作用。随着家蚕微孢子虫基因组测序的完成,通过序列比对发现在家蚕微孢子虫中也存在类枯草杆菌蛋白酶。因此,我们推测家蚕微孢子虫可能在入侵过程中会分泌类枯草杆菌蛋白酶,通过降解昆虫体壁帮助其入侵宿主细胞。基于此,木研究在已鉴定报道的叁个类枯草杆菌蛋白酶基因(Nbslpl, Nbslp2-1和Nbslp2-2)的基础上,分析了第二个类枯草杆菌蛋白酶基因Nbslp2的序列特征和转录情况,并对其进行了原核克隆表达和抗体制备,利用制备的抗体对提取到的家蚕微孢子虫膜蛋白和总蛋白进行了免疫印迹分析,随后采用间接免疫荧光及免疫共沉淀技术对NbSLP2的亚细胞定位和功能进行了初步探索。主要研究结果如下：1.家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶基因Nbslp2的序列特征及转录情况分析NbSLP2具有557个氨基酸,预测蛋白质分子量为63.84kDa,等电点为7.29,不具有抑制结构域,具有Peptidase_S8结构域。C端第494～516位氨基酸为跨膜结构域。有4个糖基化位点,推测家蚕微孢子虫NbSLP2可能为糖蛋白。亚细胞定位预测显示NbSLP2不仅具有膜定位信号,可能也会分泌到胞外发挥作用。此外,以感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠组织为材料的转录活性分析表明,Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72h检测到转录,并且该转录活性会随着感染时间的延长有逐渐减弱的趋势,暗示Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥重要作用。2.家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶NbSLP2的原核表达、抗体制备及免疫印迹分析对Nbslp2的全长基因和去除跨膜结构域的Nbslp2(TM-)基因进行原核表达。以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板,利用特异性引物进行PCR扩增,得到,Nbslp2和Nbslp2(TM-),并将目的片段构建到表达载体pET30a中,进行原核表达。NbSLP2融合蛋白与预测的偏大近21kDa,推测可能是由于蛋白本身的修饰造成的；而NbSLP2(TM-)融合表达蛋白与预测分子量相符,该蛋白不仅表达量比较高,而且主要以可溶形式表达。利用纯化的重组蛋白免疫小鼠,获得了相应的多克隆抗体。经效价测定,制备得到的多克隆抗体能够满足后续的实验。免疫印迹分析显示,在家蚕微孢子虫总蛋白中检测到了一条特异的、分子量大小与NbSLP2预测一致的蛋白质条带。由于家蚕微孢子虫Nbslp2预测有跨膜结构域,暗示着其可能是一个膜蛋白,为了验证NbSLP2是否为膜蛋白,我们采用破碎抽提异步法提取到了家蚕微孢子虫膜蛋白组分,利用该组分进行western blotting,检测到相应的蛋白条带,且杂交信号比总蛋白中的信号强,进一步说明NbSLP2极有可能是一个膜蛋白。3.家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶NbSLP2的亚细胞定位分析应用间接免疫荧光技术对NbSLP2在家蚕微孢子虫成熟孢子与发芽孢壳内的亚细胞定位特点进行了研究。在成熟家蚕微孢子虫中,荧光信号分布于孢壁周围,暗示NbSLP2在成熟的家蚕微孢子虫体内有表达；再经NbSLPIC和NbSLP2(TM-)两种不同来源的抗体同时标记后,进行荧光信号迭加的结果发现它们的定位信号分布于孢子虫体两端,推测NbSLP2和NbSLP1在孢子体内一起发挥着协同作用。发芽孢壳的IFAT结果表明NbSLP2蛋白在孢壳中有信号,且定位特征较为明显,呈点状分布于孢壳的两端或一端。这一定位结果与已报道的家蚕微孢子虫NbSLP1的定位结果相似；进一步的共定位结果显示,NbSLP2与NbSLP1有部分定位信号能够重合,而未能重合的信号分布于孢壳的质膜上,提示NbSLP2不仅是一个膜蛋白,可能会经过一定的分泌途径分泌到孢子外面,与NbSLP1一起在极丝弹出的位置发挥蛋白水解功能,共同参与极丝弹出过程。4.感染家蚕微孢子虫的BmE细胞中NbSLP2的检测利用间接免疫荧光技术检测感染家蚕微孢子虫的家蚕BmE细胞中NbSLP2的表达。结果显示,荧光信号分布于孢子内部及感染细胞的周围,暗示着NbSLP2不仅是一个膜蛋白,而且可能会分泌到孢外发挥作用；进一步的共定位结果显示,NbSLP2与NbSLPl蛋白有部分定位信号能够重合,暗示这两个蛋白酶在孢子入侵宿主细胞或在宿主细胞体内增殖的某段时期内可能具有协同作用或发挥着相同的功能。免疫印迹分析显示,在感染家蚕微孢子虫BmE细胞总蛋白的上清中检测到了NbSLP2蛋白,表明NbSLP2能分泌至宿主细胞内发挥功能。5.家蚕微孢子虫NbSLP2的功能初探本章主要利用免疫共沉淀技术寻找NbSLP2在家蚕微孢子虫内的互作靶蛋白。将差异性条带进行质谱鉴定,得到两个可能的候选靶蛋白,分别是NBO_48g0012和NBO_34g0016,但从覆盖度,分子量大小以及匹配上的肽段数来分析,NBO_48g0012基因比较符合目的条带。该基因在其基因组数据库中没有找到注释信息。该序列与其它种属的微孢子虫序列进行比对后,发现该基因含有典型的septin结构域,因此将该基因命名为家蚕微孢子虫Nbseptin基因Septin在绝大多数真核生物和哺乳动物中都参与了胞质分裂。据报道,酵母的septin定位于出芽的芽颈处。为了进一步验证Nbseptin与NbSLP2的互作,我们借助模式生物酵母对该基因进行了定位研究,结果发现,Nbseptin能定位到酵母出芽的芽颈处及下一个即将出芽的位置,并且Nbseptin组装过程总是沿着酵母内膜向出芽芽体的顶端聚集,这一定位特征与NbSLP2的分布相似,暗示NbSLP2可能参与了Nbseptin的剪切加工成熟。但NbSLP2与Nbseptin是如何互作的等等一系列的问题还有待深入研究。
晏育伟[5]2016年在《家蚕微孢子虫Septins和EB1生物信息学分析与转录表达研究》文中提出家蚕微粒子病是养蚕生产中必检的疫病,其典型病原家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是一种专营细胞内寄生的真核生物,一直是蚕病学家关注的重点。随着家蚕微孢子虫在基因组学、转录组学研究的深入,为全面揭示和认识微孢子虫侵染增殖过程中关键基因调控的分子机理提供了可能。本论文在课题组开展N.bombycis(广东株)转录组学研究基础上,对转录组测序分析的结果进行了初步验证,选取了可能与N.bombycis侵染、繁殖相关的Septins和EB1基因进行了较深入的研究。在对N.bombycis的Septins和EB1基因序列的PCR克隆测序基础上,应用生物信息学技术对基因特征和系统发育关系等进行了分析;并对感染N.bombycis的家蚕幼虫、卵等不同发育阶段进行了septin1和EB1基因的表达差异分析,探讨了septin1和EB1基因在N.bombycis侵染和增殖过程中可能的作用。研究结果如下:(1)验证了N.bombycis(GD)转录组测序分析结果是可靠的在N.bombycis(GD)转录组学的结果中选取了HSWP、α-tubulin、β-tubulin、hsp70、Met-AP2、PTP、HMG、RPB1、Septins和EB1等19个基因,共设计了41对PCR引物,进行了扩增验证,结果均扩增出目的条带,其中38对引物扩增条带的测序结果与转录组测序结果的比对相似性在97%以上,证明本次N.bombycis(GD)转录组学的结果是可信的。(2)首次发现并推定了N.bombycis Septins基因家族含有3个亚基N.bombycis(GD)转录组学的分析结果发现,N.bombycis的3个Septins基因,即septin1(KF421133)、septin2(KJ451481)和septin3(KJ451482),基因序列全长分别为912 bp、1020bp、735 bp,分别编码303、339、244个氨基酸。Septins蛋白均是亲水性蛋白,无信号肽和跨膜区域,但含有高度保守的GTPase结构域;生物信息学分析认为septin1可能分布于细胞质中,与孢子形成有关,septin2和septin3位于细胞核中,其中septin2可能与孢子的分裂有关,septin3可能与孢子的细胞周期调控有关;微孢子虫Septins基因家族保守性高,在四种昆虫微孢子虫中均发现了高度相似性97%以上的septin1和septin3基因。(3)首次在N.bombycis发现了与细胞分裂相关的EB1基因N.Bombycis EB1(KF421134)基因全长762bp,编码253个氨基酸,为亲水性蛋白,C-端具有保守的EB同源结构域,没有信号肽和跨膜区域,其可能分布于细胞核,推测其与孢子的裂殖有关。系统发育分析表明EB1基因高度保守,在N.bombycis等五种昆虫微孢子虫中发现了相似性98%以上的EB1基因。(4)N.bombycis septin1基因在感染家蚕不同时期的转录表达分析以感染N.bombycis不同发育阶段的家蚕组织c DNA为模板,对septin1基因进行了RT-PCR和q-PCR检测,结果表明,septin1基因在感染家蚕的前2天基本无转录活性,从感染家蚕第3天到五龄熟蚕以及蚕卵发育前7天,均能检测到septin1基因的转录表达活性;且在同一龄期内随N.bombycis侵染时间的延长而表现出表达量上调,在家蚕滞育阶段表达量有所下降,在五龄末期表达量是对照孢子的6.07倍;在感病蚕卵前滞育阶段,蚕卵胚胎中的septin1基因表达量下调;但从第3天开始,表达量上调,第5天升高到对照孢子表达量的11.19倍,随后的表达量下降;推测N.bombycis的septin1基因转录表达可能与孢子的形成以及寄主的发育有关。(5)N.bombycis EB1基因在感染家蚕不同时期的转录表达分析N.bombycis侵染家蚕后第3天起到感病母蛾刚产下蚕卵1 h时,EB1基因的RT-PCR检测结果均为阳性。在四龄第5天检测到EB1基因转录活性最高,为对照孢子表达量的5.84倍,但在眠期表达量有所下降;而在宿主的胚胎发育阶段,EB1基因的表达量逐渐下调,在感病母蛾刚产下蚕卵1 h时,表达量为对照的1.86倍,到蚕卵胚胎发育至第7天,发现EB1的表达量最低。证明了EB1基因与孢子的细胞分裂以及寄主的发育经过有关有关,为有毒蚕卵的早期检测提供了理论参考。
周成[6]2002年在《家蚕微孢子虫表面蛋白P32.7的分离纯化及P30.4基因相关领域分析》文中进行了进一步梳理微孢子虫是一类专营细胞内寄生，无线粒体的单细胞原生动物。微孢子虫的动物学分布范围非常广，能感染寄生脊椎动物和无脊椎动物，是经济昆虫、鱼类、兔类、皮毛动物、啮齿类及灵长类动物的致命病原。从1857年Nageli在家蚕中发现家蚕微粒子(Nosema bombycis)后，近二十年来，已相继从家蚕体内分离到微粒子虫属(Nosema)、具褶孢虫属(Pleistophora)、泰罗汉孢虫属(Tbelobania)、变形孢虫属(Vairimorpha)、和内网虫属(Endoreticulatus)等其它病原性微孢子虫。展开对有关微孢子虫的研究对于稳定生产、卫生防疫和环境生态诸方面都有着重要意义。养蚕业作为我国的传统产业，在农业上一直占有重要的经济地位。而由家蚕微孢子虫N.bombycis引起的家蚕微粒子病则是养蚕业的毁灭性病害。由于家蚕微孢子虫能经卵传染危害家蚕子代而被列为蚕种生产唯一的检疫对象，因此这一领域一直是蚕病学的研究重点和热点。本研究以家蚕微孢子虫N.bombycis的蛋白质尤其是表面蛋白为研究对象，对其进行分离纯化及其相关领域的分析研究。得出如下研究结果： 一、家蚕微孢子虫N.bombycis表面蛋白P32.7的分离纯化及测序 采用Percoll法对感染家蚕的微孢子虫N.bombycis进行纯化，得到的微孢子虫均一性和折光性一致，无组织碎片和杂菌，纯度高，对微孢子虫活性影响小，适合进一步实验的要求。然后用SDS法提取家蚕微孢子虫的表面蛋白，经SDS-PAGE电泳，结果显示，家蚕微孢子虫表面蛋白有叁条主带，而且分子量较为接近。 将SDS处理前后的家蚕微孢子虫镜检，发现SDS处理后微孢子虫的形态没有大的改变，只是孢子个体变小，活动能力下降，对家蚕的致病力明显减弱。 通过制备性SDS-PAGE、高效液相色谱反相HPLC层析对家蚕微孢子虫N.bombycis表面蛋白P32.7进行了分离纯化。经过SDS-PAGE分析表现为单带，反相HPLC检测表现为单峰，符合测序的要求。 对表面蛋白P32.7采用Edman降解法进行了N端氨基酸测序，其N端10个氨基酸的序列为N-Glu Pro Thr Arg His His Asp Arg Tyr Ala-C。 二、家蚕微孢子虫N.bombycis总蛋白的电泳分析 采用极丝激发-冻融法提取家蚕微孢子虫N.bombycis的孢子总蛋白，通过SDS-PAGE对孢子总蛋白进行分析。电泳结果显示家蚕微孢子虫总蛋白呈现复杂的带型，总共出现有30多条条带。 叁、家蚕微孢子虫N.bombycis表面蛋白P30.4基因5’末端外延区段的分析 本研究室曾克隆出家蚕微抱子虫N bohoCcfs表面蛋白 P30．4的 cDNA序列，但经分析，发现该序列缺少起始密码子，且对其的功能分析不完全。本实验在过去研究的基础上，对家蚕微抱子虫表面蛋白P30．4基因的5’末端外延区段进行了进一步的分析。以该 CDNA序列为基础合成引物，利用快速扩增 CDNA末端 RACE技术（5’－RACE），以家蚕微抱子虫 N b孤吟网拈 RNA反转录的 CDNA为模板进行扩增。得到一个大小约为400hP的DNA特异片段。 采用TA克隆法对该目的片段进行了克隆测序，测出的序列具有引物，共395hP。通过BLAST等软件与己克隆的家蚕微泡子虫表面蛋白P30．4的cDNA序列比较分析，发现该片段与其同源性为 97％，但包括于其序列中，没能得到表面蛋白 P30．4基因 5’末端外延区段的序列。分析其原因，可能与材料、引物的设计和扩增等诸多方面的因素有关。四、家蚕微抱子虫 N bm吨比拈表面蛋白 P30．4基因内含子序列的研究 为进一步了解家蚕微抱子虫表面蛋白P30．4基因的结构等问题，对其内含子序列进行了分析。以家蚕微泡子虫表面蛋白P30．4的CDNA序列为基础，在其两端合成引物，以家蚕微抱子虫八： bhajs的基因组 DNA为模板进行扩增。得到两条 DNA特异片段：一条大小约为750hP，另一条大小约为400hP。 采用TA克隆法对两条特异片段进行了克隆测序。其中7 50hP的片段测出的序列共 78fop，经NCBI卜较，该片段和鼠疫杆菌 （Yersini pestis strain）中的 168个核昔酸有84％的同源性。而400hP的片段测出的序列共360hP，但仅有引物，NCBI数据库中没有和其同源的序列。这两个片段的结构和功能还有待于进一步的研究。 由于家蚕微抱子虫是比较低等的原生动物，根据越是低等的生物其内含子及基因间序列越少的原则，家蚕微抱子虫表面蛋白P30·4基因内含子序列的有无还有待于进。一步的论证。
王林玲[7]2007年在《柞蚕微孢子虫核糖体基因及家蚕、柞蚕微孢子虫蛋白质组以及侵染家蚕后中肠的比较蛋白质组学研究》文中进行了进一步梳理微孢子虫是一种专营细胞内寄生的单细胞生物,能感染从原生动物到哺乳动物,包括昆虫,鱼类和人类在内的几乎所有的动物。家蚕、柞蚕微孢子虫是引起家蚕和柞蚕微粒子病的病原,微粒子病对养蚕业来说是一种毁灭性的病害。我国每年因为微粒子病烧掉的蚕种价值上亿元,特别是近两年微粒子病在中国蚕业生产上又有回头的趋势。因此,对微孢子虫的研究既具有理论意义,也具有经济价值。本研究以家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫为实验材料,克隆测序了柞蚕微孢子虫的核糖体基因,为柞蚕微孢子虫的分类和系统进化分析提供分子生物学的依据,也从分子水平上分析了家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的进化关系。结合二维电泳和质谱技术分离、鉴定了家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的总蛋白,在整体水平上分析了微孢子虫的蛋白质组成。用比较蛋白质组学的方法比较了家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫接种五龄家蚕后不同时间段家蚕中肠的蛋白质变化,分析了家蚕中肠对微孢子虫的应答模式,从蛋白质组的水平上筛选与感染相关的特异性蛋白标志物和抗性功能相关的蛋白。一、柞蚕微孢子虫的核糖体基因用特异引物进行PCR扩增,克隆和测序了柞蚕微孢子虫的核糖体基因,得到柞蚕微孢子虫LSU rRNA基因的部分序列,SSU rRNA,5S rRNA和转录间隔区(ITS1和ITS2)的全序列(Genbank登录号为DQ073396)。柞蚕微孢子虫的核糖体基因排列顺序为LSU—ITS—SSU—ITS—5S,和家蚕微孢子虫的排列顺序相同,是一种即不同于真核生物,也不同于原核生物的排列顺序。用SSU rRNA和ITS序列进行同源比对和进化分析,柞蚕微孢子虫属于Nosema属,是和家蚕微孢子虫进化关系很近的一个种。本研究为柞蚕微孢子虫的分类提供了分子生物学的证据,将微孢子SSU rRNA基因和ITS结合起来分析微孢子虫的亲缘关系是一个很好的尝试。二、家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的蛋白质组学研究用蛋白质组学的方法研究了微孢子虫的蛋白质组。纯化的微孢子经液氮研磨和超声波破碎,用蛋白抽提液抽提微孢子总蛋白,然后二维电泳,质谱鉴定。家蚕微孢子虫鉴定到16个蛋白,其中有4种酶,2种转录调控因子,2种膜通道蛋白,1种细胞骨架结构蛋白,1种信号分子相关的蛋白,1种核糖体蛋白和5种功能未知蛋白。柞蚕微孢子虫鉴定到9个蛋白,其中有3种酶,3种转录调控因子,1种外膜糖蛋白,1种钙离子相关的膜通道蛋白和1种热激蛋白。结合生物信息学和文献检索的方法,初步分析了这些蛋白的功能。在家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫鉴定的蛋白质中发现,酶、转录调控因子和膜蛋白占了较大的比例,说明酶、转录调控因子和膜蛋白确实是微孢子虫孢子时期大量表达和存在的蛋白质,这也与孢子的结构和生理吻合。叁、家蚕微孢子虫,柞蚕微孢子虫和清水接种家蚕后家蚕中肠的比较蛋白质组学研究取接种家蚕微孢子虫,柞蚕微孢子虫和清水对照处理后的24h,48h,72h家蚕(品种:C108)中肠总蛋白,进行二维电泳和质谱鉴定。用比较蛋白质组的方法对接种不同微孢子虫后不同时间段的中肠蛋白质的变化和家蚕中肠对微孢子的应答机制进行了研究。总的来说,许多酶类表现出表达量的差异,在取材的叁个时间段中,大部分参与碳水化合物代谢的酶在接种家蚕微孢子虫的家蚕中肠中呈现下调的趋势,如烯醇酶和羟基丙酮酸异构酶;而参与蛋白质和氨基酸降解的酶类却呈上调的趋势,如蛋白酶和延胡索酰乙酰水解酶。在接种家蚕微孢子虫的家蚕中肠的H+通道V-ATPase比接种柞蚕微孢子虫和清水的有减少的趋势。有趣的是参与免疫和应答反应的一些蛋白,接种家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫24h后的家蚕中肠中的表达量都比对照高,在72h后,接种家蚕微孢子虫的表达量比接种柞蚕微孢子虫和对照的低。这个结果和PD-QUEST软件分析的二维电泳图谱的结果一致。肌动蛋白解聚合因子4(actin-depolymerizing factor 4),硫氧化/还原蛋白过氧化物酶(thiol peroxiredoxin)和抗胰糜蛋白酶前体(antichymotrypsin precursor)是差异蛋白中最值得研究和重视的蛋白。肌动蛋白解聚合因子是一种在真核生物中广泛存在的肌动蛋白结合蛋白,在调控细胞内肌动蛋白纤丝的解聚合和再聚合中起着关键作用。在接种微孢子实验中,肌动蛋白解聚合因子4表现出明显的差别,在接种了家蚕微孢子虫24h和72h时的家蚕中肠的二维电泳银染图中没有肌动蛋白解聚合因子4,而接种柞蚕微孢子虫和对照中却有该蛋白明显的染色。说明感染了家蚕微孢子虫的中肠细胞的肌动蛋白纤丝的解聚合和再聚合平衡被打破,中肠细胞的细胞骨架遭到破坏。肌动蛋白纤丝的解聚合和再聚合平衡被打破是家蚕微孢子虫在家蚕中肠细胞中生长发育的前提还是微孢子虫感染后的病理反应还需进一步的研究。肌动蛋白解聚合因子4有可能成为治疗和鉴定家蚕感染微孢子虫的目标蛋白。硫氧化/还原蛋白过氧化物酶是一种抗氧化酶系,在生物体对活性氧族的防御系统中和在宿主与寄生虫之间的相互影响中起着主要作用。硫氧化/还原蛋白过氧化物酶在取材的24h,48h和72h都被鉴定出表达量上的差异。接种家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫24h时后,该蛋白在家蚕中肠中表达量都比对照高,48h时后,接种家蚕微孢子虫比接种柞蚕微孢子虫的表达量高,72h时后接种家蚕微孢子虫比接种柞蚕微孢子虫以及对照表达量低。说明硫氧化/还原蛋白过氧化物酶参与了家蚕中肠对微孢子虫的免疫应答。抗胰糜蛋白酶前体是抗胰糜蛋白酶因子的前体形式,没有活性,经加工后才能形成具有活性的抗胰糜蛋白酶因子。抗胰糜蛋白酶因子(antichymotrypsin)属于抑丝酶家族(serpins),参与蛋白质的加工、细胞凋亡、细胞外基质重构、以及保护细胞免受损伤等。人类细胞质中的抗胰糜蛋白酶因子的升高是烧死,外伤和一些癌症急性期的标志物。抗胰糜蛋白酶前体在接种家蚕微孢子虫72h后,家蚕中肠中的表达量远远高于在接种柞蚕微孢子虫以及对照的表达量,说明该时期的家蚕微孢子虫在中肠细胞中的快速发育。因此抗胰糜蛋白酶表达的增高有希望成为家蚕感染微孢子虫的标志。
肖圣燕[8]2015年在《家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25互作蛋白的筛选及Endoreticulatus sp.Zhenjiang α-微管蛋白的研究》文中研究说明微孢子虫是一类专营细胞内寄生的单细胞真核生物,该病原体具有广泛的寄主域,从原生生物到哺乳动物,包括人类都能够被其感染。家蚕微粒子病作为蚕桑业中的重要病害,每年给蚕业生产造成巨大的经济损失。随着N.bombycis基因组学、相关分子侵染机制以及检测防控技术体系构建等研究工作的开展与推进,近10年来,有关N.bombycis的研究取得了较大的进展。但是,明确N.bombycis的侵染机制,攻克微粒子病这一顽症,目前依然是世界蚕业界研究领域的重点和难点。微孢子虫的孢壁位于孢子的最外层,主要由蛋白质和几丁质构成,孢壁蛋白是孢子壁的主要组成成分。在对N.bombycis孢壁蛋白的研究中,发现并获得了与侵染寄主、稳定孢壁结构及增殖等活动相关的重要蛋白质。目前,已发现并报道的N.bombycis孢壁蛋白主要有:SWP5、SWP11、SWP12、SWP16、SWP25、SWP26、SWP30与SWP32。其中,SWP5不仅能够与微孢子虫极管相互作用,还参与细胞吞噬作用;SWP26参与了N.bombycis对宿主家蚕的粘附过程,进而影响了孢子对宿主细胞的侵染,该蛋白中的肝素结合基序(heparin binding motif,HBM)在介导N.bombycis孢子对宿主细胞的粘附和侵染中起到了重要作用。N.bombycis孢壁蛋白SWP25位于N.bombycis孢子壁的内壁,有一个含有20个氨基酸的信号肽。此外,该孢壁蛋白也含有一个能够参与孢子粘附的肝素结合基序。我们希望通过本研究,筛选与SWP25相互作用的家蚕蛋白,探索孢壁蛋白SWP25在N.bombycis侵染宿主过程中可能发挥的生物学功能。本研究中我们利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将绿色荧光蛋白报告基因EGFP和N.bombycis孢壁蛋白SWP25基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中,随后转化大肠杆菌BmDH10Bac感受态细胞,经同源重组获得vBmEGFP-SWP25质粒,随后将此杆状病毒穿梭质粒转染家蚕卵巢细胞(BmN)获得重组杆状病毒。转染成功的细胞可观测到明显的绿色荧光信号,同时利用Western blot方法,可在被重组杆状病毒感染的BmN细胞中检测到大小约55 kDa蛋白条带的存在。结果表明,N.bombycis孢壁蛋白SWP25基因可与EGFP基因融合,并在BmN细胞中成功表达,这为研究SWP25的生物学功能以及筛选与之互作的宿主蛋白奠定了基础。随后,为了进一步探索孢壁蛋白SWP25的生物学功能,我们利用EGFP作为抗原决定簇通过免疫共沉淀技术在细胞水平筛选可能与SWP25具有相互作用的宿主家蚕蛋白。通过质谱鉴定结合生物信息学分析,初步筛选出8种候选互作蛋白,为家蚕硫氧还蛋白过氧化物酶(BmTpx)、家蚕蛋白激酶C受体l(BmRACK1)、家蚕Rab-11蛋白(BmRab11)、家蚕Rab-18蛋白(Bm Rab18)、家蚕泛素结合蛋白4(Bm Ubcd4)、家蚕热休克蛋白(BmHSP40/BmDna J)、家蚕BTB/POZ结构域及MATH结构域蛋白(Bombyx mori BTB/POZ and MATH domain-containing protein)、家蚕TBC1D15蛋白(BmTBC1D15),并对它们进行了分析和讨论。此外,本研究通过RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆得到了一种从家蚕分离出的内网虫属微孢子虫Endoreticulatus sp.Zhenjiangα-微管蛋白基因的cDNA全长。该内网虫属微孢子虫α-微管蛋白基因的cDNA全长为1382 bp,其开放阅读框(open reading frame,ORF)为1320 bp,编码一个含439个氨基酸残基的蛋白,预测蛋白分子量为48.6 k Da,等电点为5.1,无信号肽序列,是一个稳定的结构蛋白;在线BLAST同源性分析和多序列比对结果显示,Endoreticulatus sp.Zhenjiang与内网虫属微孢子虫Endoreticulatus sp.CHW-2004 Taiwan的α-微管蛋白具有明显同源性,它们之间的核苷酸相似性为99.4%,氨基酸序列的相似性为99.5%。依据所得到的c DNA全长设计引物Spe-F/Spe-R进行特异性PCR诊断,结果只有Endoreticulatus sp.Zhenjiang能够扩增出α-微管蛋白基因,几种Nosema属微孢子虫(N.bombycis,N.philosamiae,N.hemerophila,N.phyllobrotica,N.antheraeae)无法扩增出特异性条带。这一结果为我们诊断因Endoreticulatus sp.Zhenjiang等内网虫属微孢子虫感染引起的家蚕微粒子病奠定了基础。
徐小芳[9]2011年在《家蚕微孢子虫与菜粉蝶微孢子虫的形态学与系统发育研究》文中研究表明微孢子虫(Microsporidia)是一类能感染经济昆虫、鱼类、兔类、皮毛动物、灵长类的常见病原,属于细胞内专性寄生的单细胞真核生物。目前发现的微孢子虫有1 300多种,分属于160多个属。家蚕微粒子病就是由微孢子虫寄生引起的蚕病,它通过胚种传染和食下传染对蚕业生产造成了很大的影响,是世界上所有养蚕国家作为检疫对象的蚕病。本文从家蚕中分离纯化得到一种小型孢子Endoreticulatus sp. Zhenjiang,孢子形状为卵圆形,大小为(2.9±0.2)μm×(1.2±0.2)μm,对家蚕的致病力较弱,半数感染浓度IC50为85 363个/mL。用特异性PCR方法扩增克隆其核糖体基因全序列,全长为4 432 bp,包括核糖体大亚基基因(LSU rRNA) 2 460 bp,内转录间隔区(ITS) 187 bp,核糖体小亚基基因(SSU rRNA) 1 254 bp,基因间隔区(IGS) 276 bp和5S区域115 bp。研究表明,Endoreticulatus sp. Zhenjiang具有与Nosema bombycis, Glugoides intestinalis相同的核糖体基因反向排列顺序,即5′-LSU-ITS-SSU-IGS-5S-3′。采用MEGA4.0软件构建系统进化树,发现Endoreticulatus sp. Zhenjiang应归纳为内网虫属,且与Glugoides intestinalis有很高的亲缘性。本研究表明,核糖体的反向排列顺利并不仅仅出现在Nosema属,也会出现在包含内网虫属和格留虫属的这一类群上。虽然微孢子虫的传播范围广,但有关菜粉蝶感染微孢子虫的报道目前还比较少。我们对从在镇江地区捕捉到的菜粉蝶中分离的微孢子虫进行了研究,通过SSU rRNA基因的大量克隆测序,结果表明:镇江地区菜粉蝶中微孢子虫种类较多,形态各异,其SSU rRNA基因大小不同,分别为1 227 bp,1 229 bp,1 232 bp,1 233 bp,1 234 bp和1 245 bp。这与前人研究的结果相一致。我们对其中的一种微孢子虫(Nosema sp. MPr)进行进一步的分离纯化,研究结果发现:通过体外感染家蚕BmN细胞,发现该种微孢子虫并不侵染家蚕细胞,对其进行添食实验也不感染家蚕。用特异性PCR方法对其进行核糖体基因核心序列的克隆分析,发现其核糖体基因排列顺序属于传统微孢子虫核糖体基因排列顺序,即SSU rRNA-ITS-LSU rRNA。用MEGA4.0软件对SSU rRNA和LSU rRNA构建系统进化树,其拓扑结构表明, Nosema sp. MPr与Nosema属第二类群微孢子虫处于同一分支中,从分子水平上证实该种微孢子虫归属于Nosema属,暂命名为Nosema sp. MPr。
齐晓冉[10]2014年在《家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究》文中提出微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,能够感染几乎所有的动物,是人类和多种经济动物的重要病原。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是家蚕微粒子病的病原,因其能够经卵垂直传播,对蚕业生产危害极大,所以它一直被各养蚕国家和地区列为法定检疫对象。凝集素是许多病原的重要毒力因子,具有介导细胞间粘附、病原感染宿主、机体的天然免疫防御、宿主吞噬细胞清除入侵病原等作用。比较基因组分析发现,家蚕微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、蜱虫微孢子虫、肠道微孢子虫、柞蚕微孢子虫及东方蜜蜂微孢子虫等微孢子虫中均具有编码Ricin B-凝集素蛋白的基因,并且这些基因均为多拷贝,以串联重复形式存在。这类基因分布如此之广、拷贝数如此之多,它们在微孢子虫生命活动以及在侵染宿主过程中扮演着什么样的角色?它们以什么样的形式发挥作用?目前尚不清楚。本研究聚焦家蚕微孢子虫Ricin B-凝集素蛋白的基因Nbrbl3,首先利用生物信息学方法对其序列特征及亚细胞定位进行了预测,并对其进行了分子克隆和原核表达,利用获得的重组蛋白制备了多克隆抗体,通过间接免疫荧光技术分析了家蚕微孢子虫凝集素蛋白NbRBL3在家蚕微孢子虫成熟孢子中以及所侵染的宿主细胞内的亚细胞定位特征。通过对提取的家蚕微孢子虫孢壳蛋白、发芽液蛋白及感染家蚕微孢子虫细胞总蛋白进行免疫印迹分析,进一步探明了其在家蚕微孢子虫中的存在形式和定为特征。同时,利用杆状病毒表达系统在家蚕BmE细胞中高量表达NbRBL3,观察NbRBL3过量表达后对BmE细胞生长及增殖的影响,为下-步阐明NbRBL3在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的作用提供了参考。主要研究结果如下：1. NbRBL3的序列及转录特征分析NbRBL3由204个氨基酸构成,预测分子量为22.81kDa,等电点为7.86。NbRBL3的N端1～14位氨基酸为其信号肽,56-172位氨基酸为Ricin B-lectin结构域。预测翻译后修饰发现第168位的天冬氨酸为N-糖基化位点,此外,预测还发现了16个磷酸化位点和5个C端微体靶向信号。亚细胞定位预测发现NbRBL3无跨膜结构域,无GPI-膜锚定位点,而具有偏向胞外分泌的特征,暗示NbRBL3可能为分泌性蛋白。二级结构预测结果显示,该蛋白具有一个α螺旋,且该螺旋位于其信号肽区域,13个p折迭及15个无规则卷曲,这与典型的蓖麻毒素B链具有非常相似的结构。设计Nbrbl3基因的特异性PCR扩增引物,以感染家蚕微孢子虫1-10天的家蚕中肠为材料,RT-PCR分析结果表明感染家蚕微孢子虫后1～10天的材料中均能检测到Nbrbl3基因的转录。这暗示着Nbrbl3可能在家蚕微孢子虫侵染家蚕的过程中发挥着重要功能作用。2. NbRBL3的原核表达、抗体制备及免疫印迹分析以家蚕微孢子虫Nbrbl3基因为模板设计PCR扩增引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板进行PCR扩增和分子克隆,构建Nbrbl3的融合表达载体pKT30-Nbrbl3。转化大肠杆菌Rosetta菌株,诱导表达后获得了陔基因的重组蛋白,利用纯化的蛋白作为抗原免疫动物,制备了NbRBL3的多克隆抗体。玻璃珠震荡破碎法提取家蚕微孢子虫的总蛋白,利用制备的多克隆抗体为一抗进行Western blotting分析,结果发现在25kDa附近有一特异性条带,这表明在成熟家蚕微孢子虫中存在NbRBL3蛋白,但其较NbRBL3的理论分子量偏大,推测该蛋白可能存在翻译后修饰。3. NbRBL3的亚细胞定位为了检测家蚕微孢子虫成熟孢子内NbRBL3的表达分布特征,以纯化的成熟孢子进行间接免疫荧光分析(IFA),结果表明：灭菌水处理的孢子中没有荧光信号,2%SDS处理的孢子外周出现弥散荧光信号,而且经过1%Triton处理的孢子外周信号较强,经28℃、0.1MK2CO3处理的孢子中荧光信号变弱,经37℃、0.1MK2CO3处理6h后获得的孢壳中没有发现荧光信号。这表明NbRBL3蛋白可能位于成熟孢子的孢原质中,发芽后被分泌出孢原质。以纯化的成熟家蚕微孢子虫的孢壳为材料,提取孢壳蛋白,利用NbRBL3的抗体进行Western blotting分析,结果并未发现有杂交信号,而经0.1M K2CO3发芽处理获得的发芽液蛋白中,Western blotting检测发现在25kDa附近有一特异性条带。这进一步表明NbRBL3可能存在于成熟孢子的孢原质内,孢子发芽后可能被分泌到孢原质外。4.感染的家蚕BmE及血细胞中NbRBL3的检测基于家蚕微孢子虫成熟孢子中NbRBL3的定位信息,我们推测该蛋白为分泌蛋白。本研究以感染家蚕微孢子虫的BmE细胞及血细胞为材料,利用间接免疫荧光技术,以NbRBL3的鼠抗及兔抗对NbRBL3在感染细胞中的表达进行共定位。激光共聚焦结果显示,荧光信号除了分布于家蚕微孢子虫成熟孢子内部以外,还存在于家蚕细胞的细胞膜及核膜上。这一结果表明NbRBL3为外泌性蛋白,能够被分泌到宿主细胞的原生质体膜和核膜上从而发挥其生物学功能。收集感染家蚕微孢子虫的家蚕BmE细胞,裂解细胞后收集总蛋白上清液及沉淀。免疫印迹分析显示,在上清液中存在NbRBL3蛋白,这再次印证了NbRBL3作为一种分泌型蛋白在孢子侵染宿主细胞过程中发挥作用的结论。5. NbRBL3的功能初探本研究利用杆状病毒表达系统,将Nbrbl3基因克隆到斜纹银翅夜蛾核型多角体病毒转移载体pFastBacHTB上,将pFastBacHTB-Nbrbl3转化到DH1OBac感受态细胞,与Bacmid发生同源重组,最终获得重组转座子Bacmid-Nbrbl3;将构建的杆状病毒粒子感染家蚕BmE细胞,利用该系统在家蚕BmE细胞中获得可溶性分泌型重组蛋白NbRBL3,观察发现该蛋白高量表达能够导致家蚕BmE细胞的凝集。但这种凝集意味着什么,与NbRBL3发挥的功能作用有什么样的联系,还需要进一步研究。
参考文献：
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[8]. 家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25互作蛋白的筛选及Endoreticulatus sp.Zhenjiang α-微管蛋白的研究[D]. 肖圣燕. 江苏科技大学. 2015
[9]. 家蚕微孢子虫与菜粉蝶微孢子虫的形态学与系统发育研究[D]. 徐小芳. 江苏科技大学. 2011
[10]. 家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究[D]. 齐晓冉. 西南大学. 2014
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