荧光定量PCR技术在α地中海贫血基因筛查与诊断中的研究论文_黄勤庆

广西钦州市灵山县人民医院,广西灵山 535400,

摘要:目的:分析探讨荧光定量PCR技术在α地中海贫血基因筛查与诊断中的实际应用。方法:选择2014年1月-2014年12月之间来我院进行α地中海贫血基因筛查诊断的800例孕妇作为观察对象,使用荧光定量PCR技术进行筛查。对其中得到的阳性标本使用传统基因诊断方式测定;同时通过血红蛋白电泳法筛查800例孕妇是否存在α地中海贫血。结果:800例孕妇中有13例为α地中海贫血基因携带者,检出率为1.63%;这13例的基因分型分别为:13例为缺失型、0例为突变型;应用传统经检测方法对孕妇进行筛查,得到与荧光定量PCR技术相同的结果;应用血红蛋白毛细管电泳技术得到的α地中海贫血孕妇有4例,检出率为0.5%。结论:应用荧光定量PCR技术对育龄期的孕妇进行α地中海贫血筛查的结果可靠,对于预防缺陷新生儿的出生具有非常重要的意义。

关键词:荧光定量PCR技术;α地中海贫血;基因筛查;血红蛋白

α地中海贫血是临床中较为多见的常染色体隐性遗传疾病,发病原因主要是由于编码α珠蛋白中α基因缺失【2】,我国南方属于该病的高发区域,尤其是广东、广西地区α地中海贫血的人群携带率有近10%。当前,对于α地中海贫血尚没有有效的治疗方法,科学有效的产前检查是预防该病的主要措施。临床中通过血常规筛查对疾病进行检测,对平均红细胞体积(MCV)与平均血红蛋白含量(MCH)降低的患者进行基因检测,但是该方法对于静止型患者的缺陷不能够很好的检测,容易漏诊。荧光定量PCR技术对于缺失型α地中海贫血基因检测具有较好的敏感性和特异性,其对于仪器的要求不高且操作较为便捷,当前应经广泛的应用在地中海贫血基因的检测中【2】。本文应用荧光定量PCR技术对800例孕妇进行筛查和诊断,现将结果总结如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

选择2014年1月-2014年12月之间来我院进行α地中海贫血基因筛查诊断的800例孕妇作为观察对象,孕妇中年龄最小的为20岁、最大的为41岁,平均(26.52±3.08)岁;孕周最小为9周、最大为15周,平均(12.43±1.12)周。抽取孕妇的静脉血进行抗凝处理,交由医院实验室处理。全部800例孕妇在试验之前均得到通知,且自愿产于本次研究。应用“多色荧光PCR熔解曲线技术”进行检验,血红蛋白电泳使用德国进口的全自动毛细管电泳仪,仪器的配套试剂。

1.2方法

1.2.1DNA的提取:DNA提取应用常规的苯酚-氯仿抽提法,然后经过37℃持续10min的干燥处理,加入30-150μl的去离子水,储存在4℃的恒温箱中待测,在7天之内实施基因扩增处理;

1.2.2荧光定量PCR技术方法:首先进行UNG酶处理,设定好50℃持续2min,1个循环;预变性设置95℃持续10min,同样1个循环;随后是降落循环程序,首先95℃持续30s、然后65℃持续30s,最后是76℃持续45s,设定10个循环;PCR循环程序为:95℃持续30s、继续60℃持续30s,最后是76℃持续45s,设定有50个循环;最后是熔解曲线的分析程序:95℃持续1min、继续35℃持续3min,最后是45-85℃之间,每一个0.4℃采集通道荧光信号,1个循环。

1.2.3gap-PCR方法:应用gap-PCR方法对常见的三种α-珠蛋白基因缺失型进行检测,分别为-α4.2、-α3.7以及-SEA。应用前文中提取的DNA溶液,以1μl作为模板,其中含有100ng的DNA,并将其加入到扩增反应体系中,设置95℃进行15min的预处理,然后为98℃持续45s、64℃持续75s以及72℃持续150s,共设定有35个循环,最后将72℃延长5min,以实现对PCR的扩增处理。

1.2.4电泳检测:将10μl的PCR扩增产物加入到2μl的溴酚蓝上样缓冲液中,使用浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行30min的处理,在凝胶成像仪中可观测结果。结果的判定标准为:α-珠蛋白正常基因的扩增产物应当是长度为1.8kb的条带状物体;α-珠蛋白基因中-α4.2缺失型的条带产物长度为1.6kb;-α3.7缺失型的条带状产物长度为2.0kb;-SEA趋势性扩增产物的长度为1.3kb。

1.2.5血红蛋白电泳技术:选择德国进口全自动毛细管电泳分析仪及配套的试剂等进行血红蛋白电泳检验,电压为9.8kv,缓冲液的酸碱度为9.4,在8条并联的石英毛细管内实施血红蛋白电泳检验,应用长度为425μm的电波直接对血红蛋白含量进行测定。在每一次分析之前必须对仪器配套的质控品进行检测,满足合格要求才能够对标本进行分析。根据实验室标准,正常人的结果范围应为:HBF小于1.0%;HbA2在2.2%-3.2%之间。例如,某一位孕妇的HbA2在2.1%以下,且红细胞平均体积和平均红细胞血红蛋白含量低于正常值,则可以考虑该孕妇为α地中海贫血。

2 结果

2.1 800例孕妇的α地中海贫血基因筛查结果

通过荧光定量PCR熔解曲线法对800例孕妇进行基因筛查,结果发现有13例为地中海贫血基因的携带者,11例为1-2个基因缺失,属于轻型地中海贫血或静止型贫血,2例孕妇为HbH病,具体情况如下表。

2.2应用血红蛋白电泳技术的检验结果

应用血红蛋白毛细管电泳技术对孕妇进行检验发现有20例提示地中海贫血,通过对比基因检测,结果有4例为α地中海贫血基因携带者,另外16例孕妇的基因检测结果正常。

3 讨论

地中海贫血也称为海洋性贫血,其中α-地贫是一种多见的常染色体隐性遗传疾病,在亚热带地区的发病率较高,我国长江以南的各个省市较为常见,以广东省、广西省、四川省、海南省最为多发,发生率在10%左右,是一种危害性较大的遗传病。该病的特点就是珠蛋白基因缺陷,造成血红蛋白中特殊的珠蛋白肽链中一种或者是多种减少、不能够合成,进而造成血红蛋白的构成成分发生改变【3】,当前以实验室检查和基因诊断作为主要预防手段。α地中海贫血主要临床表现为小细胞低色素性贫血,由于基因基础差异大,患者的轻重程度也不一样,部分患者仅表现为轻度贫血,但是当发生感染或者是妊娠期中,贫血症状可能表现的非常严重【4】。有资料显示,地中海贫血的孕妇发生早产、流产、死胎以及产后出血等不良妊娠结局的可能性远高于未患者有地中海贫血的孕妇,因此,做好早期筛查和诊断,预防重型患儿的出生以及不良妊娠解决非常关键【5】。

在本组研究中,对800例孕妇进行检验,共检出13例α地中海贫血基因携带者,其中有11例为1-2个基因缺失,属于轻型地中海贫血或静止型贫血,另外有2例患者为HbH病,提示荧光定量PCR技术对于α地中海贫血基因筛查具有较好的效果,对于检查α地中海贫血基因的蔓延、提高人口素质也起到积极作用。

参考文献:

[1]何平亚,丁忠英,张鑫丽等.荧光定量PCR技术在α地中海贫血基因筛查与诊断中的研究[J].中华实验和临床病毒学杂志,2014,28(6):494-496.

[2] 黄金波,聂能,邵英起等.α-地中海贫血伴嘧啶5′-核苷酸酶缺乏患者的基因检测及其红细胞内酶活性变化[J].中华血液学杂志,2012,33(10):852-855.

[3] 王青青,张媛,章钧等.通过富集母血浆中胎儿游离 DNA无创性产前诊断β地中海贫血[J].中国病理生理杂志,2014,(10):1861-1867.

[4] 唐海深.广州地区α-地中海贫血的新生儿筛查及高分辨率熔解曲线分析技术在非缺失型α-地中海贫血筛查中的应用[D].广州医学院,2012.

[5]陈建,罗比,漆著等.东南亚缺失型α地中海贫血1复合血红蛋白CS家系基因突变检测的方法学探讨[J].中国实验血液学杂志,2010,18(3):675-678.

论文作者:黄勤庆

论文发表刊物:《名医》(学术版)2016年4期

论文发表时间:2016/10/27

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