骨伤洗剂微生物限度检查法适用性试验研究论文_巫繁菁,韦玮,唐林,姚金娥(通讯作者)

(广西骨伤医院药剂科 广西 南宁 530012)

【摘要】目的:建立骨伤洗剂微生物限度检查方法。方法:根据骨伤洗剂的用药途径和制法,按照2015年版《中国药典》四部规定对其进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定,及控制菌的检查。结果:确定采用稀释法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定,采用常规法进行控制菌的检查。结论:建立的微生物限度检查方法合理可行。

【关键词】骨伤洗剂;微生物限度检查方法;适用性实验研究

【中图分类号】R917 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752(2019)24-0246-02

我院骨洗方从上世纪80年代末沿用至今已有近三十年,方含桂枝、荆芥、紫草等七味中药,具有祛风通络、消炎、消肿止痛的功效,用于风湿肿痛、软组织损伤等骨科疾病,属外用制剂,禁内服。根据骨洗方使用特点将骨洗方经水提取而成骨伤洗剂,合约0.55g生药材·ml-1,本文按照2015年版《中国药典》四部的规定[1]对骨伤洗剂进行微生物限度检查法适用性实验研究,结果稳定可行,该方法可用于骨伤洗剂的微生物限度检查。

1.仪器与材料

1.1 仪器

生物安全柜(HR40-ⅡA2,青岛海尔特种电器)、生化培养箱(DNP-9162,上海比朗仪器)、全自动压力灭菌器(LMQ.C-80E,山东新华医疗器械)、电热恒温干燥箱(FY-SY-4,吴江富宇烘箱设备)、电冰箱(LG4-688,广州施乐华)、微波炉(EM-3011EB1,合肥三洋荣事达)、恒温水浴箱(HH-8,常州中捷实验)、电子天平(TP-3102,感量0.1g,赛多利斯)、涡旋振荡器(maxi mixⅡ,Thermo Scientific)、气浴恒温振荡器(ZD-85,金坛市精达)。

1.2 培养基

沙氏葡萄糖液体培养基(批号:150821)、胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA,批号1709152)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号170103)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号170509),北京三药科技开发公司提供。胰酪大豆胨液体培养基(TSB,批号20171212),青岛海博生物技术有限公司提供。沙式葡萄糖琼脂培养基(SDA,批号1064381),广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.3 供试品

骨伤洗剂(规格:500ml/瓶,批号:20180408,20180409,20180410,广西骨伤医院提供)。

1.4 菌种

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[GDMCC1.220](中国工业微生物菌种保藏管理中心)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003](中国医学细菌保藏管理中心)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Sulticis)[CMCC(B)63501](广东环凯微生物科技有限公司),白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspeigillus niger)[CMCC(F)98003](中国食品药品检定研究院)。以上菌种均为第五代。

2.方法与结果

2.1 菌液制备

将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌在33℃的TSB中培养24h,白色念珠菌在25℃的SDB中培养24h,黑曲霉在25℃的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养7d,然后分别用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成含菌数为1000~10000cfu·ml-1的菌悬液,备用。

2.2 供试液制备

取供试品,混匀,作为供试液。取供试液10ml,加入45℃的TSB至100ml,作为1:10供试液。

2.3 微生物计数法建立及回收率实验

2.3.1常规法 实验组:吸取5份供试液,每份9.9ml,分别加入0.1ml实验菌液,使含菌量为10~100cfu·ml-1,混匀后吸取1ml置平皿中,倾入TSA,每株实验菌平行制备2个平皿,另从加入真菌的供试液吸取1mL置平皿中,倾入SDA,每株真菌平行制备2个平皿。菌液对照组:取TSB5份,每份9.9ml,分别加入0.1ml实验菌液,摇匀后吸取1ml至平皿中,倾入TSA,每株实验菌平行制备2个平皿,另从加入真菌的TSB吸取1ml置平皿中,倾入SDA,每株真菌平行制备2个平皿。供试品对照组:吸取4份供试液1ml至平皿,2份倾入TSA,2份倾入SDA。稀释剂组:吸取4份TSB1mL至平皿,2份倾入TSA,2份倾入SDA。

回收率计算方法:回收率=(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/(菌液组平均菌落数-稀释剂组平均菌落数)

2.3.2稀释法(1:10) 实验组:取供试液(1:10)进行实验,其余操作同常规法。菌液对照组:操作同常规法。供试品对照组:取供试液(1:10)进行实验,其余操作同常规法。稀释剂组:同常规法。

回收率计算方法:同常规法。

2.3.3微生物计数法及回收实验结果 由微生物计数法及回收率实验结果可知,需氧菌总数、霉菌和酵母菌的总数测定采用常规法不可行,而采用稀释法回收率均在0.5~2之间,表明稀释法可行,见表1、表2。

表1 霉菌及酵母菌的回收实验比值测定结果

2.4 控制菌检查法适用性实验

2.4.1菌悬液制备 取2.1项下含菌量为1000~10000 cfu·ml-1的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌悬液,用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释至含菌数为 10~100 cfu·ml-1的菌悬液,备用。

2.4.2金黄色葡萄球菌 供试品组:取1:10供试液10ml接种至100ml TSB中,33℃培养24h。阳性对照组:取含菌量为10~100cfu·ml-1的菌液1ml加入100ml TSB中,于33℃培养24h。阴性对照组:取稀释液10ml加入100ml TSB中,于33℃培养24h。取上述培养物分别划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板,33℃培养24~48h。

2.4.3铜绿假单胞菌 供试品组:取1:10供试液10ml接种至100ml TSB中,33℃培养24h。阳性对照组:取含菌量为10~100cfu·ml-1的菌液1ml加入100ml TSB中,于33℃培养24h。阴性对照组:取稀释液10ml加入100ml TSB中,于33℃培养24h。取上述培养物分别划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板,33℃培养24~48h。

2.4.4控制菌检查验证结果 控制菌检查验证结果见表4。

表4 控制菌检查方法的适用性实验结果

3.讨论

骨伤洗剂药物组成中含有挥发性成分的桂枝、荆芥,紫草以及少量的聚山梨酯80和苯甲酸钠,这些成分对金黄色葡萄球菌等有一定的抑制作用[2-6],常规法实验结果表明骨伤洗剂对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及枯草麦芽杆菌有一定的抑制作用,所以选择采用稀释法(1:10)来降低和消除减弱骨伤洗剂中的抑菌物质对氧菌、霉菌和酵母菌的抑菌作用,微生物计数法三次验证实验回收值均在0.5~2之间,说明方法可行,可用于骨伤洗剂的微生物限度检查。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:25

[2]万里江,范正达,唐风雷,等.桂枝挥发油的提取及抗菌实验的考察[J].海峡药学,2008,20(12):32-34

[3]解宇环,沈映君.荆芥挥发油抗炎作用的实验研究[J].中国民族民间医药,2009,18(11):1-2

[4]黄贵莲,周月广,金鑫,等.紫草素体外抗菌活性的实验研究[N].三峡大学学报(自然科学版),2017,6(39):8-10

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[6]胡春红,葛红莲,李季平,等.苯甲酸钠对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的影响[J].食品工业科技,2011(4):180-181

基金项目:广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项,项目编号:GZZJ14-12。

作者简介:巫繁菁,女,硕士研究生,主管中药师,主要从事医院制剂开发。

通讯作者:姚金娥,女,副主任药师,主要从事药事管理和医院制剂开发。

论文作者:巫繁菁,韦玮,唐林,姚金娥(通讯作者)

论文发表刊物:《医药前沿》2019年24期

论文发表时间:2019/9/27

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骨伤洗剂微生物限度检查法适用性试验研究论文_巫繁菁,韦玮,唐林,姚金娥(通讯作者)
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