刘丽鑫
（黑龙江省农垦北安管理局中心医院 黑龙江 农垦 164000）
【摘要】 探讨炭疽芽胞杆菌的微生物学检验的方法与鉴定。炭疽芽胞杆菌是炭疽病的病原菌，炭疽病的病原菌，为人、畜共患性疾病，快速有效的检验和鉴定炭疽牙孢杆菌是最为重要的。采取直接涂片染色镜检，分离培养与鉴定及药物敏感试验方法进行检查。快速的病原学诊断在控制疾病流行中有重要意义。
【关键词】 炭疽牙胞杆菌；微生物学；检查方法
【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）21-0397-02
炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)俗称炭疽杆菌，是炭疽病的病原菌，为人、畜共患性疾病，常在牧区暴发流行。由于炭疽杆菌宿主广泛，传播方式多样，芽胞的抵抗力极强，故恐怖分子可利用该菌制造“生物恐怖”危害人类。炭疽芽胞杆菌是需氧芽胞杆菌属中致病力最强的革兰阳性大杆菌。引起人与动物炭疽病。
1.炭疽芽胞杆菌的生物学特性
1.1 形态与染色
本菌为致病性细菌中最大的革兰阳性杆菌。大小为5～10μm×1～3μm，两端平切，无鞭毛。新鲜标本直接涂片常单个存在或呈短链。经培养后则形成长链，呈竹节状排列。细菌在有氧条件下可形成芽胞，芽胞小于菌体、椭圆形、位于菌体中央。有毒菌株可有明显的荚膜。
1.2 培养特性
本菌为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，最适生长温度为30～35℃。无毒菌株在普通琼脂培养基上形成灰色、扁平、干燥、粗糙型(R)菌落，低倍镜下观察菌落边缘呈卷发状。在血液琼脂平板上培养12～15h菌落周围不溶血，24h后有轻度溶血[1]。在肉汤培养基中由于形成长链而呈絮状沉淀生长。在明胶培养基中37℃培养18～24h，由于细菌沿穿刺线向四周扩散生长，使明胶表面液化成漏斗状。有毒菌株在NaHCO3血琼脂平板上置5％的CO2环境中37℃培养24～48h可产生荚膜，变为黏液型(M)菌落。用接种针挑取时呈黏丝状。
1.3 生化反应
能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、蕈糖，有些菌株迟缓发酵甘油和水杨酸，产酸不产气；不发酵鼠李糖、半乳糖等其他糖类；能还原硝酸盐为亚硝酸盐；不产生吲哚和硫化氢，不利用枸橼酸盐，不分解尿素；卵磷脂酶弱阳性、触酶阳性。
1.4 抗原性
炭疽杆菌的抗原可分为细菌性抗原和炭疽毒素。菌体多糖抗原与毒力无关。耐热、耐腐败，与相应免疫血清发生沉淀反应(Ascoli热沉淀反应)。荚膜多肽抗原与细菌毒力有关，具有抗吞噬作用，有助于细菌在体内定植、繁殖和扩散，故称为侵袭因子。以高效价抗荚膜多肽血清与细菌作荚膜肿胀试验，对临床实验室鉴定有一定意义[2]。芽胞抗原具有免疫原性和血清学诊断价值。炭疽毒素由保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)3种蛋白质形成的毒素复合物，单独皆无致病性。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆炭疽毒素由毒素质粒pXO1(176 kb)编码而成，具有抗吞噬作用和免疫原性。抵抗力本菌芽胞的抵抗力很强，煮沸10min或干热140℃经3h、高压蒸汽灭菌121℃环境中15min才能杀灭。在干燥土壤或皮毛中常温下可存活数十年。
2.标本的采集与处理
2.1 标本的采集
炭疽病变部位多样，可根据不同病变采集不同标本，由于炭疽杆菌芽胞抵抗力强，能经多种途径传染，检验时除遵守常规实验室规则外，还应特别注意：①检验时必须按烈性传染病检验守则进行操作。②操作台应铺来苏而湿布，操作完后收起湿布置来苏而水中浸泡；动物尸体、病变组织和脏器必须焚烧或高压蒸汽灭菌，禁止掩埋以免污染环境。③涂片染色用水冲洗时应置入容器中，经高压蒸汽灭菌后再倾倒。④检验应有专用实验室或划定区域[3]。
2.2 处理
固体标本取10～20g，液体标本取50～100mL；新鲜渗出液、血液和脏器(用无菌操作技术制成悬液)，可直接接种于2％兔血清肉汤中快速增菌培养，或在固体培养基上画线分离培养；污染的固体标本可加10倍量生理盐水充分浸泡，振荡10～15min，静置10min，取上层悬液置65℃水溶30min或85℃环境中经5min，将非芽胞菌杀死，保留芽胞活性，再分离培养。
3.检查方法
3.1 直接涂片染色镜检
3.1.1直接显微镜检查 将可疑材料涂片，组织脏器作压印片，干燥后固定，作革兰染色、荚膜染色和芽胞染色。若新鲜材料中发现革兰阳性大杆菌、两端平切、竹节状排列，并有明显荚膜，可作初步报告。培养后涂片可见芽胞，芽胞为卵圆形，位于菌体中央，不膨出菌体，可形成长链。在含有血清或牛乳的培养基培养后可见荚膜。
3.1.2荚膜荧光抗体染色 在固定好的涂片或印片上，滴加抗炭疽荚膜荧光抗体，置37℃环境中染色30min，按试剂盒说明浸泡、冲洗，晾干后置荧光显微镜下可见链状大杆菌，周围有绿色荧光荚膜者为阳性。
3.2 分离培养与鉴定
3.2.1分离培养 将处理后标本接种血琼脂平板，35℃环境下经18～24h，可观察到较大、灰白色、边缘不整齐和有轻微溶血的菌落。在普通琼脂平板上形成灰白色、扁平、干燥、无光泽的菌落。污染标本经处理后可接种于选择培养基(喷他脒多黏菌素B)等进行培养[4]。
3.2.2形态学特征 包括菌落形态和镜检形态。
3.2.3生化试验 与其他芽胞杆菌的鉴别。
3.2.4噬菌体裂解试验 取用37℃环境下经4～6h待检肉汤培养物一接种环，涂布于普通琼脂平板，滴加AP631炭疽噬蔺体于平板中央37℃培养18h，观察出现噬菌斑阳性。每份标本应作2～3个同样的试验，同时滴种肉汤液作阴性对照。
3.2.5串珠试验 将待检菌接种于含青霉素0.05～0.5U／mL的培养基上，37℃环境中培养6h后，炭疽杆菌可发生形态变化，显微镜下见大而均匀的圆球状菌体，成串样排列，为串珠试验阳性。
3.2.6青霉素抑制试验 将待检菌分别接种于含青霉素5、10、100U／mL的普通琼脂平板，37℃环境中培养24h，炭疽芽胞杆菌一般在含5U／mL的青霉素平板上仍能生长，在含10、1 00U／mL青霉素的平板上受到抑制而不生长。
3.2.7串珠和青霉素抑制联合试验 将待检菌新鲜肉汤培养物0.1mL滴于预温的兔血琼脂平板上，用L形玻棒均匀涂布，干后用含青霉素1U／片的纸片贴于平板，37℃经1～2h，打开平皿置低倍镜下观察，可见纸片周围有一无菌生长的抑菌环，其外周由于青霉素浓度低，菌体细胞壁受损而成为串珠。平板继续37℃孵育8～12h，测量抑菌环直径。
3.2.9毒力试验 将待检菌接种于含0.5％NaHCO3和10％马血清的琼脂平板上，置10％CO2、37℃环境中经24～48h，有毒株形成荚膜，菌落呈黏液型，无毒株不形成荚膜，呈粗糙型菌落。
4.临床特征
炭疽病是人、畜共患的急性传染病，曾对人类健康造成极大的危害。炭疽病主要是牛、羊等食草类动物的传染病，人可通过接触或摄食病畜及畜产品而感染；也有因吸入干燥菌粉或气溶胶而感染。人类感染后以皮肤炭疽多见，也可引起肠炭疽、肺炭疽等，3种炭疽病均可并发败血症，甚至炭疽性脑膜炎荚膜和炭疽毒素是本菌的主要致病物质，荚膜和毒素均由质粒编码，质粒丢失后就成为减毒株或无毒株。炭疽病感染后可获得持久免疫力，再次感染罕见。炭疽病是一种死亡率较高的烈性传染病，快速的病原学诊断在控制疾病流行中有重要意义。
【参考文献】
[1]杨瑞馥，韩延平，宋亚军，杜宗敏，翟俊辉，炭疽芽孢杆菌检测鉴定技术研究进展[J].微生物学免疫学进展，2002.30(2):53-56
[2]刘炬，徐俊杰，陈薇.炭疽杆菌检测方法的研究现状与展望[J]. 微生物学报，2012.52(7):809-810
[3]王争强，何君，苏裕心，朱虹，端青.突发疫情中炭疽芽孢杆菌的分离及鉴定[J]. 微生物学报，2006.43(3):460-462
[4]何湘，黄留玉.炭疽杆菌治病性研究进展.微生物学通报，2004.31（4）101-105.
论文作者:刘丽鑫
论文发表刊物:《医药前沿》2016年7月第21期
论文发表时间:2016/8/3
标签：炭疽论文; 杆菌论文; 琼脂论文; 菌落论文; 平板论文; 涂片论文; 标本论文; 《医药前沿》2016年7月第21期论文;