易宏波[1]2016年在《抗菌肽CWA对断奶仔猪肠道炎症和肠道屏障功能的作用及其机制》文中进行了进一步梳理断奶造成仔猪肠道功能紊乱,导致腹泻、生长性能下降甚至死亡,严重影响养猪业的健康发展。虽然腹泻的影响因素较多,但多数研究表明肠道炎症和肠道屏障功能损伤是断奶仔猪易发生腹泻的主要内在原因。大量抗生素用于防治断奶仔猪腹泻,引发细菌耐药性、肉产品中药物残留及环境污染等严重问题；同时抗生素滥用会损害机体肠道屏障功能,破坏肠道稳态。抗菌肽是重要的先天免疫分子,因其广谱抗菌活性、破膜杀菌机制以及不易产生耐药性等特点而受到关注。最新研究表明,抗菌肽不仅具有免疫调节作用,还具有肠道上皮屏障保护功能。然而,抗菌肽应用于防治断奶仔猪腹泻的效果及其对断奶仔猪肠道炎症和肠道上皮屏障功能的作用如何还不得而知。因此,在前期获得了抗菌活性高、安全性好的抗菌肽CWA的基础上,本研究开展了抗菌肽CWA对断奶仔猪腹泻的防治效果试验,同时阐明了抗菌肽CWA对肠道炎症和肠道屏障功能的作用；进一步在小鼠上探究了抗菌肽CWA对细菌感染导致的肠道炎症和肠道屏障功能损伤的作用；最后体外细胞试验初步探讨了抗菌肽CWA缓解肠道炎症和保护肠道屏障功能的作用机制。主要研究结果如下：试验一抗菌肽CWA对断奶仔猪肠道炎症和肠道屏障功能的作用(1)抗菌肽CWA对断奶应激仔猪肠道炎症的作用选择18头健康的杜长大仔猪,21日龄断奶后分别腹腔注射3次生理盐水(对照组)和抗菌肽CWA(抗菌肽CWA组),后续饲养7天,研究抗菌肽CWA对仔猪断奶应激腹泻及其肠道炎症的作用。结果表明,抗菌肽CWA降低了断奶仔猪腹泻指数(P<0.05),提高了断奶仔猪ADFI (P<0.05)和ADG (P<0.05)。同时,抗菌肽CWA降低了血清IgG、TNF-α、IL-6、IL-22含量(P<0.05),且提高了血清中TGF-β含量(P<0.05)。在肠道形态方面,抗菌肽CWA提高了空肠的绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度比值(P<0.05),提高了回肠的绒毛高度/隐窝深度比值(P<0.05),降低了回肠的隐窝深度(P<0.05)。在肠道炎症方面,抗菌肽CWA降低了肠道中促炎因子的基因表达,其中对空肠的效果最为显著；同时抗菌肽CWA减少了肠道嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润；提示抗菌肽CWA能够缓解断奶仔猪肠道炎症。在肠道炎症信号通路蛋白表达方面,抗菌肽CWA显著降低空肠组织炎症信号通路中关键蛋白NF-κB、IκB-α的磷酸化水平,提示抗菌肽CWA可能通过下调NF-κB信号通路缓解肠道炎症。(2)抗菌肽CWA对腹泻断奶仔猪肠道炎症和肠道屏障功能的作用选择108头腹泻的杜长大断奶仔猪,分别腹腔注射4次生理盐水(对照组)、恩诺沙星(抗生素组)、抗菌肽CWA(抗菌肽CWA组),研究抗菌肽CWA对腹泻断奶仔猪肠道炎症和肠道屏障功能的作用。结果表明,抗菌肽CWA和抗生素均降低了断奶仔猪的腹泻指数(P<0.05)和腹泻率(P<0.05),均提高了断奶仔猪ADFI (P＜0.05)和ADG (P＜0.05),且两者无显著差异。在肠道形态方面,抗菌肽CWA和抗生素对小肠绒毛形态损伤均有缓解作用,其中对空肠的作用最显著；扫描电镜和透射电镜观察发现,抗菌肽CWA和抗生素改善了空肠微绒毛数量与长度,且抗菌肽CWA的改善作用优于抗生素。在肠道炎症方面,抗菌肽CWA组和抗生素组均降低了空肠中促炎因子IL-6、IL-8、IL-22的含量(P<0.05),对血清也有类似规律；同时,抗菌肽CWA和抗生素均缓解了腹泻断奶仔猪空肠嗜中性粒细胞浸润；进一步,抗菌肽CWA组和抗生素组均降低了空肠组织中炎症相关蛋白NF-κB、IκB-α、AKT的磷酸化水平及上游调控关键蛋白TLR4、MyD88的表达；且抗菌肽CWA缓解肠道炎症的作用与抗生素相当。在肠道上皮屏障功能方面,抗生素组不仅降低了空肠粘液素和防御素的表达,而且降低了空肠中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达(P<0.05)；然而,抗菌肽CWA却提高了空肠中ZO-1和Occludin的表达(P<0.05)；提示抗菌肽CWA可能提高肠道上皮屏障功能而抗生素却损害肠道上皮屏障功能。在肠道微生物菌群及SCFAs含量方面,与对照组相比,抗菌肽CWA组和抗生素组均降低了粪便中大肠杆菌比例(P<0.05),均提高了粪便中乳酸杆菌/大肠杆菌比值(P<0.05)；然而,抗菌肽CWA提高了粪便中乳酸杆菌比例(P<0.05),抗生素却降低了粪便中乳酸杆菌比例(P<0.05)；进一步,抗菌肽CWA提高了粪便中乙酸、丙酸及丁酸的浓度(P<0.05),而抗生素降低了粪便中丁酸的浓度、丁酸/乙酸比值及丁酸/丙酸比值(P<0.05)。试验二 抗菌肽CWA对细菌感染小鼠肠道炎症和肠道屏障功能的作用在发现抗菌肽CWA缓解断奶仔猪肠道炎症和肠道屏障功能损伤的基础上,进一步在小鼠上研究抗菌肽CWA对细菌感染引起的肠道炎症和肠道屏障功能损伤的影响。选择36只断奶小鼠分为对照组、E.coli组、E.coli+Enro组、E.coli+CWA组,EHEC O157:H7感染后分别腹腔注射生理盐水、恩诺沙星(Enro)、抗菌肽CWA。结果表明,抗菌肽CWA和恩诺沙星均提高了染菌小鼠的存活率,缓解了染菌导致的小鼠体重下降。在肠道形态方面,抗菌肽CWA和恩诺沙星均缓解了染菌导致的小鼠空肠绒毛萎缩、隐窝增生和结肠粘膜上皮破损、杯状细胞数量增加。在炎症方面,E.coli+Enro组和E.coli+CWA组均缓解了染菌导致的小鼠血清和结肠中TNF-α、IL-6、IL-10含量升高(P<0.05)；同时均缓解了染菌导致的小鼠空肠中IL-6含量的升高(P<0.05)；抗菌肽CWA在缓解炎症方面与恩诺沙星无显著差异。在肠道抗菌蛋白表达方面,E.coli+Enro组和E.coli+CWA组均缓解了染菌导致的空肠中REG3y基因表达升高和结肠中Remlβ基因表达升高(P<0.05)。然而,抗菌肽CWA组了小鼠空肠和结肠中TFF3基因表达水平(P<0.05)。同时,E.coli+Enro组和E.coli+CWA组均缓解了染菌导致的小鼠空肠中杯状细胞数量减少、粘液层厚度降低和结肠中杯状细胞数量增加。进一步,Western blot和免疫荧光的结果表明,E.coli+Enro组和E.coli+CWA组均缓解了染菌导致的小鼠空肠MUC-2表达的降低和结肠MUC-2表达的升高(P<0.05)。在肠道上皮屏障功能方面,E.coli+CWA组缓解了染菌导致的小鼠空肠中ZO-1和Occludin蛋白表达的下降(P<0.05),而E.coli+Enro组仅缓解了ZO-1蛋白表达的下降(P<0.05),抗菌肽CWA的效果优于抗生素。在肠道微生物菌群及SCFAs浓度方面,不同处理小鼠盲肠内容物中总菌、双歧杆菌、芽孢杆菌的数量无显著差异,E.coli+Enro组和Ecoli+CWA组均缓解了染菌导致的盲肠中乳酸杆菌数量的降低和大肠杆菌数量的升高(P<0.05),同时Ecoli+CWA组缓解了染菌导致的盲肠中乳酸杆菌/大肠杆菌比值的下降(P<0.05)。同时,Ecoli+CWA组和E.coli+Enro组均对染菌导致的SCFAs浓度的降低具有一定程度的缓解作用。以上结果进一步证明了抗菌肽CWA能够缓解肠道炎症和改善肠道屏障功能,与断奶仔猪的试验结果一致。试验三抗菌肽CWA对肠道炎症和肠遒上皮屏障功能的调控机制(1)抗菌肽CWA缓解肠道炎症的作用机制利用LPS诱导的猪巨噬细胞炎症模型发现,恩诺沙星对LPS导致的炎症反应无缓解作用,而抗菌肽CWA可以缓解LPS导致的炎症反应且呈浓度依赖效应。同时,抗菌肽CWA缓解了LPS导致的IL-6、IL-8、IL-22表达升高和NF-κB、IκB-α磷酸化水平升高(P<0.05)。利用siRNA技术沉默猪巨噬细胞TLR4和MyD88后,抗菌肽CWA缓解炎症的作用受到抑制。利用FITC标记的葡聚糖和流式细胞检测技术发现,抗菌肽CWA可以增强巨噬细胞吞噬FITC-葡聚糖的能力,而使用STAT-1抑制剂后,抗菌肽CWA对巨噬细胞吞噬功能的增强作用受到抑制。以上结果表明,抗菌肽CWA缓解肠道炎症可能是通过TLR4-MyD88-NF-KB信号通路调控炎症反应和通过STAT-1途径增强巨噬细胞吞噬功能等机制发挥作用。(2)抗菌肽CWA改善肠道上皮屏障功能的作用机制利用Caco-2细胞刮伤模型发现,抗菌肽CWA提高了刮伤细胞的愈合速度,改善受损肠道上皮细胞的修复功能。利用猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)屏障功能损伤模型发现,抗菌肽CWA缓解了LPS导致的IPEC-J2单层细胞TER值的下降,同时缓解了LPS导致的肠道上皮细胞中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白表达的下降。单独添加抗菌肽CWA提高了IPEC-J2细胞中ZO-1和Occludin的表达,而添加Rac1抑制剂NSC 23766时,抗菌肽CWA对ZO-1和Occludin的提高作用受到抑制,且抗菌肽CWA对粘附IPEC-J2细胞的减少EHEC O157:H7作用也被抑制。以上结果表明,抗菌肽CWA能够改善受损肠道上皮细胞的修复功能,通过Racl途径调控肠道上皮细胞紧密连接蛋白表达,增强肠道上皮屏障功能。上述研究不仅为抗菌肽应用于防治断奶仔猪腹泻,实现减少抗生素在畜禽养殖中的使用提供了重要的基础数据与指导意义；而且为由肠道炎症和肠道屏障功能损伤引起人类或者动物的多种肠道疾病提供了新的防治策略。
吴宇[2]2016年在《药物性肝损伤体外筛选模型和何首乌致肝损伤的初步研究》文中指出药物性肝损伤(Drug-induced liver injury, DILI)常常是药物研发失败、上市后被撤市或限制使用的主要原因之一。因此,无论是上市前还是上市后,对有肝损伤风险的药物,建立有效、灵敏、特异的体外DILI筛选模型显得尤为重要。何首乌作为传统补益类中药的一种,使用十分广泛。药物不良反应数据显示,它具有明显的肝损伤风险。虽然国内外近年来进行了一些基础性研究,但毒性成分目前仍不清楚。因此,需要对何首乌致肝损伤毒性成分及其可能的作用机制进行研究。首先,开展五种肝细胞体外模型的比较研究。选择对乙酰氨基酚、卡马西平、双氯芬酸钠、异烟肼、丙戊酸钠、盐酸胺碘酮、盐酸四环素、利福平、依托泊苷、盐酸拉贝洛尔、达那唑、雷公藤甲素、野百合碱和黄独素B共14个药物为DILI阳性对照,盐酸班布特罗、盐酸丁螺环酮和丁溴酸东莨菪碱共3个药物为DILI阴性对照,采用CCK-8细胞毒性筛选、高内涵筛选和肝相关生化指标筛选等方法,对L-02、 HepG2、 HepaRG和hiHeps等四种人源肝细胞系和一种原代大鼠肝细胞(Primary rat liver cells, PRLs)进行比较研究。结果表明,HepaRG肝细胞系鉴别DIIL药物的能力最高,并依鉴别DILI药物的能力将其排序为HepaRG> L-02> HepG2= hiHeps> PRLs. HepaRG肝细胞在检测氧化应激、线粒体损伤以及内质网应激等方面灵敏性较高,呈剂量依赖性,优于其他四种肝细胞。在相关性分析和显著性检验中,谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)、苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase, MDH)可同时反映双氯芬酸钠、盐酸丁螺环酮和达那唑对HepaRG肝细胞的影响,提示可以作为探索DILI药物的肝损伤相关生物标志物。其次,对何首乌致肝损伤成分进行研究。一方面,我们对何首乌药材进行提取和分离,得到何首乌70%总醇提物和8个提取组分；另一方面,选择易于获得的何首乌所含的16个单体成分作为研究对象。采用CCK-8细胞毒性筛选、UPLC-PAD含量测定以及肝相关生化指标测定等方法,对何首乌70%总醇提物、8个提取组分和16个单体成分进行毒性组分和毒性成分的研究。结果表明,第四组分(Fraction 4, Fr.4)可能为何首乌致肝损伤的毒性组分,没食子酸、白藜芦醇、大黄素、大黄酸为何首乌中具有明显细胞毒性的单体成分。结合L-02肝细胞损伤特征分析和含量分析,推测没食子酸可能是何首乌致肝损伤的主要成分之一。此外,谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase, GLDH)和γ-谷氨酰转肽酶(y-Glutamyl transferase, y-GT)都反映何首乌70%总醇提物和没食子酸对肝细胞的损伤作用。最后,对没食子酸致肝细胞损伤的初步机理进行研究。分别从细胞周期、细胞凋亡、高内涵筛选(活性氧、线粒体膜电位、内质网应激、中性脂代谢和钙离子稳态)、二维凝胶电泳技术结合分子生物学验证,探索没食子酸在不同剂量和不同时间下对HepaRG肝细胞损伤的机理。结果表明,没食子酸对HepaRG肝细胞的细胞周期没有显著影响;没食子酸呈剂量依赖性的诱导HepaRG肝细胞凋亡；没食子酸呈剂量依赖性和时间依赖性的诱导HepaRG肝细胞内质网应激、降低细胞内活性氧水平和钙离子浓度,对线粒体膜电位和中性脂代谢没有显著影响；没食子酸(0.5mM)在不同时间(24h和48h)处理HepaRG肝细胞,共筛选出11个差异蛋白,其中24h组有6个差异蛋白,48h组有5个差异蛋白。结合GO和Pathway分析,发现24h处理组主要集中在内质网中功能蛋白的折叠和加工方面,48 h处理组主要集中在功能蛋白折叠加工、功能蛋白前体RNA核糖核酸的调控、炎症过程、宿主防御等方面；分子生物学验证结果表明肽基脯氨酰顺反异构酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A, PPIA)的蛋白表达一致性和基因水平表达的一致性,推测PPIA可能是没食子酸潜在的调控靶点。结论：HepaRG在鉴别DILI药物方面优于其他四种肝细胞(L-02、 HepG2、 hiHeps和PRLs肝细胞)；AST、LDH和MDH可以作为在体外反映DILI药物肝损伤作用的潜在生物标志物。没食子酸可能为何首乌致肝损伤的主要成分之一,其机制可能是通过抑制PPIA的转录和翻译,引起功能蛋白的错误折叠和加工,造成内质网应激,进而导致肝细胞凋亡。
刘彦廷[3]2016年在《长链非编码RNA RP11-838N2.4通过miR-10a调控脑胶质瘤替莫唑胺耐药性的机制研究》文中研究说明研究背景胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是目前中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,患者整体中位数生存时间仅约15个月。目前该疾病的治疗方案主要为手术切除结合术后化疗及放疗。在临床化疗用药中,以替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)的应用最为广泛。药理学研究显示,替莫唑胺是一种DNA烷化剂,通过对胶质瘤细胞DNA片段进行破坏性修饰,促使肿瘤细胞趋于凋亡或坏死。然而,在治疗过程的中后期,部分患者对替莫唑胺的敏感性逐渐降低,疾病根治难度逐渐增大。因此,有效的保持神经胶质瘤患者对替莫唑胺的敏感性至关重要。研究表明,替莫唑胺耐药的形成主要与两个蛋白酶活性增强有关：即甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶和核酸错配修复蛋白酶。此外,与之相关的蛋白还包括谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase, GST)、DNA核酸剪切修复酶(nucleotide excision repair, NER)、多药耐药性蛋白(ATP-binding cassette subfamily B member 1, ABCB1)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, bcl-2)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)等等。然而,目前越来越多的实验结果显示：有效控制上述单个或几个蛋白酶活性后,部分胶质瘤细胞对替莫唑胺仍表现出较高的耐受性。提示替莫唑胺耐药是一个多分子参与的复杂过程,对其机制进行更加深入的研究极有必要。长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNAs)是一种转录长度超过200bp,无蛋白编码功能的核酸序列。目前研究表明, lncRNAs在调节细胞增殖、凋亡、侵袭及血管生成中发挥重要功能。越来越多的研究表明,lncRNAs参与肿瘤细胞的形成和发展。例如,在肝癌、白血病、肺腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌组织中均发现lncRNAs差异性表达。LncRNA与肿瘤化疗耐药性的相关研究也日益受到重视,有研究发现,在骨肉瘤细胞中,lncRNAs (ENST00000563280,nr-036444)通过调控ABCB1、低氧诱导因子-1A(Hypoxia inducible factor-1, HIF-1A)和人叉头框蛋白(Forkhead box protein C2, FOXC2)等活性,在化疗药物多柔比星的耐药形成中发挥重要作用。LncRNA UCA1 (urothelial cancer associated 1)通过激活Wnt信号通路,增强膀胱癌细胞对顺铂的耐受性。此外,在原发性肉瘤中,lncRNA HOTAIR (HOX transcript antisense RNA)表达水平与化疗敏感性呈正相关性。因此,有学者提出在基因水平调控lncRNAs,可能是降低脑胶质瘤化疗耐药的新策略。目前已经有研究者针对术后接受替莫唑胺化疗的脑胶质瘤患者进行随访,并将胶质瘤复发患者组织与首次胶质瘤手术切除组织进行lncRNAs基因芯片分析,结果显示：约1000多个lncRNAs存在差异性表达,提示lncRNAs极有可能参与替莫唑胺耐药性的形成,并在此过程中发挥重要作用。最近研究显示,lncRNAs可作为竞争性内源RNA (competing endogenous RNAs, ceRNA),参与调控肿瘤细胞的多个生物学功能。LncRNAs可作为天然的海绵支架与多个miRNAs结合,从而对]miRNAs下游靶点进行转录后水平调控。例如lncRNA NEAT1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1)可通过减弱miR-449b对靶基因c-Met的抑制作用,促进神经胶质瘤发生发展。LncRNA H19过表达后,通过与miR-675相互作用,促使miR-675靶基因TGF-β1蛋白含量上调,诱导成骨细胞分化。此外,lncRNA UCA1通过抑制miR-216b活性,激活FGFR1/ERK信号通路,抑制肝癌恶性进展。然而,此机制是否存在于lncRNAs对脑胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药性的调控,还有待研究。在本研究中,首先构建胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药细胞株U87TR和U251TR。通过基因芯片技术,筛选耐药细胞株U87TR与亲本细胞株U87之间差异性表达的lncRNAs,通过生物信息学分析,选定lncRNARP11-838N2.4为本研究的关键lncRNA。验证其对胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药性的调控作用,并探讨其可能机制。材料和方法1.人脑胶质瘤标本收集收集自2014年1月—-2015年6月期间南方医科大学第二临床医学院神经外科收治脑胶质瘤患者手术切除标本53例,整理临床资料并进行术后随访。标本切除后送病理科,按病理诊断设定纳入标准。按WHO脑胶质瘤分级标准,其中I级2例,II级10例,III级3例,Ⅳ级38例。在IV级38例受试患者中,所有患者术后均接受替莫唑胺化疗处理,其中23例患者在1年内复发。所有组织标本在手术切除后立即置于液氮中保存。本研究经南方医科大学第二临床医学院伦理委员会批准,所有受试患者均以书面形式告知并签署知情同意书。2. RT-PCR法检测lncRNAs, miRNAs和mRNAs将组织样本或细胞样本采用Trizol法提取RNA。按说明书要求将一般RNA反转录为cDNA; miR-10a的检测采用miRNAs Qpcr Quantitation Kit试剂盒(富能基因公司),mRNAs与lncRNAs均采用RT-PCR试剂盒(Takara公司), mRNAs以GAPDH为内参,lncRNAs和miRNAs以U6为内参。按20ul体系配制成混合液后,置于ABI 7500仪器运行,取三次独立实验所得数据均数为结果。引物序列见下表：RT-PCR中的引物序列3. Western blotting法细胞/组织蛋白提取后,BCA法测蛋白浓度。配10%分离胶行SDS-PAGS电泳,转膜后依次孵育一抗、二抗。EphA8、TGFβ1、smad2和smad4抗体均来自CST公司,β-action抗体源于中彬金桥,以β-action为内参。将胶片扫描,用凝胶图像处理系统分析目的条带光密度值及分子量,完成统计分析。4.CCK-8法待细胞在对数生长期时,用0.25%胰酶短暂消化,接种于96孔板。按细胞正常生长周期及速度计算接种细胞量,每孔1500～2000个细胞为宜。每组6-8个副孔,待12h细胞完全贴壁后,将待测样本每孔加入CCK8试剂10ul,放入细胞培养箱孵育3h,分别在24h,48h,72h,96h和120h时间点用酶标仪检测待测孔A450处吸光度值。并绘制细胞增殖曲线。每组至少重复检查3次。5.流式细胞术检测胶质瘤细胞凋亡取对数生长期细胞,转染lncRNA或阴性对照,只加lipofectamine 3000组设为空白对照组,每个中皿培养体系为3ml。收集细胞后,采用400ul Binding Buffer重悬细胞。每管细胞样本加入等比例的Annexin V-FITC与Propidium Iodide3-5ul,可根据细胞数量多少适当调整。室温下避光反应10～15分钟后冰上放置。振荡混匀,无明显细胞团块情况下上流式细胞仪检测。6. TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法取对数生长期细胞,调整细胞比例为20～30%,制作细胞爬片。4%多聚甲醛固定后,采用1%Triton-X液处理。待细胞通透性改变后,依次将样本置于TdT酶反应液、Streptavidin-TRITC反应试剂处理后,滴加含有DAPI的甘油封片剂,室温下避光反应15-20分钟后,荧光显微镜下观察。7.裸鼠成瘤实验选4周龄BALB/C裸鼠,在SPF级别环境下培养。分别在左侧／右侧皮下注射入胶质瘤细胞。细胞皮下注射后每3-5天测量一次瘤体直径,估算肿瘤体积。待5-6周或荷瘤小鼠出现死亡时,处死小鼠,拍照、皮下分离肿瘤,统计其体积和重量。8.荧光素酶报告首先psiCHECK-2-lncRNA-3'UTR-R载体构建后,行PCR扩增反应,PCR产物胶回收分离纯化。待电泳结束后,将DNA琼脂糖块置于水平透亮玻璃板,在紫外灯指引下,切除目的琼脂糖片段。将切除的胶带转移至高压灭菌处理过的1.5ml EP管中。按1.2ul融化液对应lmg琼脂糖胶带比例,向1.5ml EP管中加入DR-I Buffer缓冲液。将菌落(wt-lncRNA)提交于广州锐博生物公司进行检测,后续检测结果将在NCBI数据库进行BLAST分析后,采用lipofectamine3000阳离子脂质体法对人脑胶质瘤细胞进行转染。将pisCHECK-2-lncRNA-3'UTR-R, lncRNA-3'UTR-mut、pisCHECK-2转染至人脑胶质瘤细胞；共转染miR-10a minics、anti-miRs或miR-control;细胞裂解后上机检测荧光素酶活性强度。Luciferase活性检测原则上参考Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System E1910荧光酶活性检测说明书,适当做调整。将萤火虫荧光素酶的荧光值进行归一化(海肾荧光素酶荧光值),每组实验重复3次,取平均值进行后统计分析。9.免疫组化将脑胶质瘤组织置入组化石蜡包埋缸中进行石蜡包埋后,切除组织。将载玻片用75%酒精消毒,并擦拭干净后,垂直置入恒温展片箱中,使组织切片与载玻片紧密贴附。尽量避免组织皱褶及中间夹层气泡形成。将组织切片脱蜡10分钟。确保脱水后和抗原修复后,在载玻片上滴加正常非免疫动物血清1滴,将载玻片按预设分组分阴性对照组和阳性对照组。在载玻片上依次滴加一抗、二抗,并在载玻片上滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液一滴,完成后滴加预先配制好的DAB显示液,室温下水平放置孵育6分钟,倒置显微镜下观察。去除DAB显示液,用苏木精染色10～15秒,完成后立即完成盐酸酒精分化,氨水返蓝。按预先设定的乙醇梯度及作用时间,将载玻片进行乙醇脱水干燥,待其自然晾干后用进行载玻片封闭。显微镜下观察。10.过表达质粒或si-lncRNA转染人脑胶质瘤细胞-脂质体(lipofectamine 3000)法本研究中利用过表达质粒或RNA干扰片段(siRNA)改变lncRNAs细胞内含量。在转染后的人脑胶质瘤细胞中,通过在细胞培养基中滴加链霉素筛选慢病毒阳性转染细胞。本研究中所用的过表达质粒及siRNA干扰质粒由广州锐博公司合成,按照预先设定分组,lncRNAs RT-PCR检测lncRNAs表达情况,进行后续实验。11.统计分析所有数据资料用SPSS21.0软件统计分析。计量资料以均数±标准差显示,两组间样本比较采用独立样本t检验,多组间样本比较采用单因素方差分析。所有计量资料计算P值前检验方差齐性。所有实验重复3次cLncRNA RP11-838N2.4与miR-10a表达水平相关性用Pearson法分析。临床样本中,GBM患者生存时间与lncRNA RP11-838N2.4表达水平采用log rank分析。设置P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.构建胶质瘤耐药细胞株U87TR和U251TR并验证其对替莫唑胺的耐药性首先通过亲代GBM细胞系U251和U87构建TMZ耐药细胞株U251TR和U87TR。CCK-8结果显示：在TMZ 50ug/ml浓度下,U87TR和U251TR细胞增值能力高于比亲本U87和U251细胞。半数抑制浓度(IC50)结果显示：U87TR细胞IC50为289.53±5.54 ug/ml,是U87细胞(98.104±2.63 ug/m1)的2.95倍；U251TR细胞IC50为269.57±16.98 ug/ml,是U251细胞(109.48±1.82 ug/ml)的2.46倍。同时,流式细胞仪结果显示：在TMZ 50ug/ml浓度下,细胞培养48小时后,U87+TMZ的细胞凋亡率为20.42%+0.52%,是U87TR+TMZ(5.86%±1.17%)的3.49倍；U251+TMZ的细胞凋亡率为19.05%+3.04%,是U251TR+TMZ(7.65%±0.87%)2.49倍,差异具有统计学意义。2. LncRNA RP11-838N2.4在TMZ耐药细胞株U87TR及U251TR中低表达基因芯片分析提示：lncRNA RP11-838N2.4 (ENST00000581442)在U87TR细胞中较U87细胞下调7.65倍(p值=0.0002299)。RT-PCR结果显示：lncRNARP11-838N2.4在TMZ耐药细胞株U251TR及U87TR中的表达水平低于U251和U87细胞,差异具有统计学意义。3. LncRNA RP11-838N2.4与脑胶质瘤患者预后存在相关性对比15例原发性胶质母细胞瘤患者和23例复发性患者组织样本,RT-PCR结果显示：lncRNA RP11-838N2.4在复发组中表达水平低于原发性脑胶质瘤组织。临床资料显示：lncRNA RP11-838N2.4表达水平与胶质瘤病理级别呈正相关性(P=0.001),与患者性别或年龄无关。Kaplan meier描述分析显示：lncRNARP11-838N2.4表达水平高的GBM患者存活时间超过表达水平较低的患者(p=0.032)。4.上调lncRNA RP11-838N2.4可增加U87TR和U251TR对TMZ的敏感性LncRNA原位杂交实验证实：lncRNA RP11-838N2.4主要位于细胞质中。在U87TR和U251TR细胞中,转染pcDNA-lncRNA RP11-838N2.4 (pcDNA-RP)或lncRNA-NC (pcDNA-NC)。CCK-8结果显示：pcDNA-RP组细胞对TMZ的敏感性高于pcDNA-NC对照组；pcDNA-RP组细胞IC50值低于对照组；流式细胞仪和TUNEL结果均显示：U87TR和U251TR中,pcDNA-RP组细胞凋亡比例均高于pcDNA-NC组。差异具有统计学意义。将U87TR细胞转染lncRNA RP11-838N2.4 (pcDNA-RP)或lncRNA-NC (pcDNA-NC)后,分别接种于裸鼠皮下。同时接受TMZ 50 ug/g或PBS尾静脉注射治疗,结果显示：TMZ 50ug/g尾静脉治疗组中,pcDNA-RP组细胞皮下肿瘤增长速度低于pcDNA-NC.接种5周后,U87TR细胞pcDNA-RP组肿瘤的平均重量为217±17mg,pcDNA-NC组肿瘤的平均重量为592+32mg；pcDNA-RP组肿瘤重量及体积低于pcDNA-NC组,差异具有统计学意义。5. LncRNA RP11-838N2.4下调miR-10a表达并减弱miR-10a对靶基因的抑制在U87TR和U251TR细胞分别转染lncRNA RP11-838N2.4 (pcDNA-IRP)或lncRNA-NC (pcDNA-NC)后。RT-PCR结果显示：miR-10a在pcDNA-RP组细胞中,表达含量低于pcDNA-NC组。胶质瘤组织样本结果显示：miR-10a在复发型组织中表达量高于原发性组织。RNAhybird2.0序列分析结果显示：野生型序列lncRNA RP11-838N2.4与miR-10a"seed"区存在碱基互补。荧光素酶结果证实pMIR-lncRNA RP11-838N2.4-wt中,miR-10a组相对荧光素酶含量低于miR-control组。Western blotting结果表明：U87TR和U251TR细胞中,EphA8为miR-10a靶基因。miR-10a与pcDNA-RP共转染组EphA8蛋白含量高于与miR-10a+pcDNA-NC组。差异均具有统计学意义。6. LncRNA RP11-838N2.4通过抑制miR-10a活性,参与调控GBM细胞TMZ耐药性U87TR和U251TR过表达miR-10a后,分别转染pcDNA-RP或pcDNA-NC。CCK-8结果显示：在TMZ 50ug/ml浓度下,miR-10a+pcDNA-RP组细胞增殖能力低于miR-10a+pcNA-NC组。miR-10a+pcDNA-RP组细胞IC50低于miR-10a+pcDNA-NC组。流式细胞仪和TUNEL结果显示：在TMZ 50ug/ml浓度下,miR-10a+pcDNA-RP组细胞凋亡比例高于miR-10a+pcDNA-NC组。差异均具有统计学意义。7. LncRNA RP11-838N2.4抑制TGFβ信号通路部分蛋白表达U87TR和U251TR细胞过表达lncRNA RP11-838N2.4后,western blotting结果显示：pcDNA-RP组细胞TGFβ1和smad2蛋白含量低于pcDNA-NC组,差异均具有统计学意义。结论1. LncRNA RP11-838N2.4表达含量与胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药性为负性相关。GBM患者lncRNA RP11-838N2.4表达水平越低,复发率越高,预后越差。2. LncRNA RP11-838N2.4与miR-10a"seed"区域存在碱基互补,负性调控细胞miR-10a的表达含量,对miR-10a下游靶基因EphA8的mRNA及蛋白水平均表现为正性调控作用。3. LncRNA RP11-838N2.4可作为ceRNA,通过结合miR-10a,参与调控胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药。综上所述,长链非编码RNA RP11-838N2.4可作为ceRNA,通过调控miR
王晓宇[4]2016年在《玉米冷响应相关基因的克隆、功能鉴定及定量蛋白质组学研究》文中研究说明非生物胁迫,如低温、干旱和盐胁迫等严重限制了植物的生长与产量。其中低温影响植物的生长、发育、空间分布和作物产量。许多重要的粮食作物,如玉米、水稻、大豆、番茄等,对冷比较敏感,冷适应性差。中国东北地区是玉米的主要产区,由于地理条件等因素,春季经常遭受冷害的侵袭,导致玉米大面积减产。随着玉米需求量的不断扩大,如何提高玉米的综合产量成为当务之急。传统育种和分子标记辅助的有效结合能够选育出抗逆和广泛适应性的玉米新品种。为了挖掘参与低温响应的潜在基因和揭示逆境响应机制,本研究以玉米抗冷自交系W9816为实验材料,选取三叶期的叶片和根部组织,采用c DNA-AFLP(c DNA amplified fragments length polymorphism)的方法,利用174对引物组合,比较低温处理前后基因的差异表达情况。根据c DNA-AFLP分析,叶片中发现6829条TDFs(Transcript-derived fragments),根部6955条TDFs。每对引物组合30-50个AFLP扩增带,其大小介于70-600 bp之间。尽管大多数条带在冷胁迫后没有发生明显变化,但在叶片中仍然检测到620个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),根部531个DEGs。这些差异表达基因显示出不同的表达模式。其中,仅61个上调的DEGs和32个下调的DEGs在两种组织中同时具有一致的表达趋势。大多数DEGs冷胁迫后在两种组织中体现出不同的表达趋势。通过NCBI BLASTX和Maize GDB数据库分析,根据其功能将差异表达基因分为5类:信号转导(10,15%)、转录调控(9,13%)、翻译和翻译后修饰(10,15%)、细胞代谢与组织(24,36%),6个DEGs推测为编码蛋白(9%),8个DEGs在数据库中没有匹配(12%)。利用q RT-PCR的方法验证了16个玉米抗冷相关的候选基因。Sec14-like蛋白参与必要的生物学过程,例如磷脂代谢、信号转导、膜运输以及逆境响应。本研究采用RACE(Rapid amplification of c DNA ends)PCR的方法首次成功克隆了一个磷脂酰肌醇转运相关蛋白Zm SEC14p(accession no.KT932998)。Zm SEC14p基因全长包括一个完整的开放阅读框,推测编码295个氨基酸。染色体定位表明Zm SEC14p基因定位于玉米基因组1号染色体上,横跨3420 bp,包括5个外显子。多重序列比对表明玉米Zm SEC14p与高粱Sb SEC14p氨基酸同源性最高;进化树分析表明Zm SEC14p属于UCSH的一个成员,仅仅包含一个SEC14 domain。I-TASSER结构预测表明Zm SEC14p蛋白包括10个α螺旋、5个β折叠、3个310螺旋,其中,7个α螺旋、5个β折叠以及2个310螺旋可形成磷脂结合口袋。基因表达模式研究发现,Zm SEC14p基因转录受低温、盐以及ABA诱导表达;组织特异性分析表明Zm SEC14p在玉米叶片中表达最高。亚细胞定位表明Zm SEC14p蛋白主要定位于细胞核。对过表达Zm SEC14p转基因拟南芥植株在不同生长发育时期抗逆表型鉴定发现:在种子萌发阶段,转基因植株能够显著降低对低温的敏感性,提高了对Na Cl和ABA的敏感性;在苗期,转基因植株在低温胁迫下具有更快的初生根生长速率;对生殖生长发育时期Zm SEC14p转基因株系的抗冷表型鉴定结果表明,转基因株系较野生型株系存活率提高了约38%。活性氧组织定位以及抗氧化酶(SOD、POD)活性测定实验表明,低温胁迫后,相比于野生型株系,转基因株系能够显著提高POD和SOD抗氧化酶的活性,酶活的提高与Zm SEC14p调控抗氧化相关基因的表达有关。脯氨酸含量测定实验表明,低温处理48 h后,Zm SEC14p转基因株系的脯氨酸含量分别是野生型的1.35和1.61倍。低温胁迫下,转基因拟南芥中一些逆境胁迫应答基因(如CBF3、COR6.6、RD29B)的表达量较野生型显著上调。上调表达的逆境响应基因推测与Zm SEC14p调节磷脂酶C(PLC)基因的表达与酶的活性相关。利用i TRAQ(Isobaric tags for relative and absolute quantification)定量蛋白质组学方法比较低温处理前后玉米叶片蛋白质丰度变化情况。实验结果表明低温胁迫共鉴定到173个差异丰度蛋白(Differential abundance protein species,DAPS)。这些DAPS被分为以下功能类别:碳和能量代谢(38,22.0%)、转录后调节(13,7.51%)、翻译、核糖体的结构与合成(15,8.67%)、翻译后修饰、蛋白折叠与分子伴侣(14,8.09%)、氨基酸转运和代谢(13,7.51%)、逆境响应(12,6.94%)、信号转导(9,5.20%)、脂类代谢(5,2.90%)、次生代谢的生物合成(6,3.47%)、无机离子的转运和代谢(2,1.16%)、复制、重组和修复(2,1.16%)、其它生物学过程(22,12.71%)和未知生物学过程(22,12.71%)。生物信息分析表明159个DAPS被注释到38个GO(Gene Ontology)功能组;108个DAPS被分为20个COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)类别;99个DAPS参与60个KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路。抗氧化实验证明了i TRAQ实验结果的可靠性。转录谱与蛋白谱的关联分析表明低温胁迫玉米叶片中存在转录后调节和翻译后修饰等过程。基于蛋白的功能性分析,玉米苗期低温胁迫响应的适应性机制可能包括缓解由于叶绿体膜能量过剩引起的光损伤;通过糖酵解产生更多的能量;增加逆境响应蛋白的丰度;提高清除ROS的整体能力。转录后调节和翻译后修饰在玉米低温胁迫响应中也扮演重要的角色。目前还未见到有关玉米苗期低温胁迫蛋白质丰度变化的研究报道。综合以上研究表明,Zm SEC14p作为逆境胁迫响应基因在逆境调控网络中起正向调控作用,同时,本研究从转录水平、蛋白质水平进行研究,增加了对玉米冷响应机制的理解,为今后通过基因工程改良玉米抗逆性提供了重要的候选基因。
申迎宾[5]2016年在《四种谷物多酚抗氧化、降血脂作用评价研究》文中认为研究表明,摄入全谷物及其产品对慢性病,如:心血管疾病、糖尿病和高血脂症等具有预防和治疗作用,这与全谷物中富含天然多酚类物质有关。谷物多酚类化合物可分为游离型和结合型,结合型多酚因难以从谷物中分离纯化而常被忽视,造成谷物体外抗氧化活性被严重低估,而且迄今为止,全谷物及其多酚成分在体内抗氧化作用的机制仍未被阐明。所以本论文以高粱、青稞、紫米和大黄米为原料,分析了常规成分、VE、谷维素及脂肪酸组成,从游离酚和结合型多酚的角度,检测了多酚类成分组成及存在形式,同时采用体外化学模型和人肝癌细胞HepG2细胞模型评价了谷物的抗氧化活性,研究了谷物总多酚提取物对PC12神经元细胞氧化应激的保护作用及其分子机制。最后,通过动物实验,进一步评价了全谷物粉及其总多酚提取物对高脂小鼠氧化应激和血脂水平的影响。主要研究结果如下:(1)以高粱(抗四高粱,京都小白人,辽甜1号,黄河高粱)、青稞(藏青2000,循化蓝青稞,香格里拉绿青稞)、紫米和大黄米为原料,分析谷物的常规成分、VE、谷维素的含量和脂肪酸组成。结果表明,香格里拉青稞的膳食纤维含量最高,为12.88%。紫米中的VE和谷维素含量最高,分别达到7.38 mg/100 g DW和92.67 mg/100 g DW。循化蓝青稞棕榈酸和硬脂酸含量最高,分别为36.29%和22.81%。黄河高粱的油酸含量最高,为31.00%。大黄米的亚油酸含量最高,为62.83%。藏青2000的亚麻酸含量最高,为4.19%。(2)分析了谷物不同提取物的总酚、总黄酮、总花色苷和酚酸组成。结果表明,辽甜1号的结合型总酚和总黄酮含量最高,所选谷物的阿魏酸和p-香豆酸多以结合形式存在,而儿茶素多以游离型式存在。辽甜1号总多酚提取物中主要成分为儿茶素、表儿茶素、p-香豆酸、阿魏酸和绿原酸。藏青2000总多酚提取物中主要成分为芦丁、阿魏酸、p-香豆酸和表儿茶素。紫米总多酚提取物中的主要成分为槲皮素、阿魏酸、p-香豆酸和儿茶素。大黄米总多酚提取物中检测到的主要成分为阿魏酸和p-香豆酸。(3)采用体外模型探究了谷物不同提取物的抗氧化活性。结果表明,辽甜1号的结合型多酚的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、FRAP总抗氧化能力和ORAC抗氧化能力最强。高粱、青稞的结合型多酚的人肝癌细胞HepG2细胞抗氧化活性比游离型多酚强,而紫米的游离型高于结合型,大黄米的游离型和结合型无差异。(4)阿魏酸、p-香豆素、辽甜1号总多酚提取物、藏青2000总多酚提取物、紫米总多酚提取物、大黄米总多酚提取物能够在不同程度上保护AAPH引起的PC12细胞损伤。阿魏酸、辽甜1号总多酚提取物、紫米总多酚提取物能通过显著降低脂质抗氧化水平,通过调控细胞内的抗氧化酶活性,显著降低ROS的水平,来减轻细胞的氧化损伤。同时,辽甜1号总多酚提取物能够进一步的显著的稳定胞内Ca2+的浓度,并阻止细胞线粒体膜电位发生变化,显著降低Capase-3酶活提高的程度,显著降低了细胞的凋亡。可见,谷物多酚可通过调节细胞内的抗氧化系统和线粒体介导的细胞凋亡通路两种方式来减轻对细胞的氧化损伤。(5)膳食高粱(辽甜1号)全谷物粉可显著降低TC和AI水平,显著提高HDL-C水平,比紫米和大黄米效果好。进一步研究发现灌胃辽甜1号总多酚提取物、紫米总多酚提取物、藏青2000总多酚提取物、阿魏酸和p-香豆素对血脂有显著的调节作用。其中以辽甜1号总多酚提取物和阿魏酸的降血脂效果最好。(6)膳食辽甜1号全谷物粉可显著提高血清和肝脏中的T-AOC水平、CAT酶活性、GSH-Px酶活性(P<0.5),同时显著降低丙二醛水平(P<0.5),对肝脏有保护作用,而对心脏组织无显著影响。进一步研究发现,灌胃阿魏酸、辽甜1号总酚提取物和藏青2000总酚提取物可以显著改善高脂小鼠的氧化应激状态,同时,灌胃谷物多酚提取物均可可显著上调抗氧化基因的表达(P<0.5),如:谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、血红素氧合酶1(HO-1)、依赖还原型辅酶/П醌氧化还原酶1(NQO1)、核因子NF-E2(nuclear factor erythyroid 2-related factor 2,Nrf2)。这表明,谷物多酚提取物很可能通过上调Nrf2通路上的几种抗氧化基因表达水平来调控体内抗氧化的作用。本研究表明,谷物多酚是一种良好的天然抗氧化剂,具有“高效低毒”的特点,具有作为保健食品或药品用于血脂紊乱及氧化应激相关疾病治疗的巨大潜力,应用前景十分广阔。
张宁宁[6]2016年在《非小细胞肺癌靶向治疗和耐药机制研究》文中认为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibition, EGFR-TKI)和间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)抑制剂的临床应用显著改善了非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的生存。但最终不可避免的发生耐药。因此,本研究将在晚期NSCLC患者中检测ALK融合基因并分析其临床预后意义,为NSCLC靶向治疗的临床实践提供数据参考。另外,建立EGFR-TKI耐药细胞系,分析其生物学性状,开展组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)或联合EGFR-TKI对NSCLC的抗肿瘤作用研究,为NSCLC治疗新策略的开展提供思路。本论文研究内容分为两个部分：第一部分：晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因的检测和临床意义分析第一章：晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因的检测。采用FISH、IHC和qRT-PCR技术分别检测139例晚期非鳞NSCLC患者的ALK状态,以FISH检测结果为参考,比较IHC和qRT-PCR检测ALK的敏感度和特异度。结果显示,IHC和FISH检测结果的一致性为96.9%,qRT-PCR和FISH检测结果的一致性为95.7%。IHC检测的敏感性和特异度分别为97.7%和96.6%,qRT-PCR检测的敏感性和特异度分别为89.2%和98.7%。结果提示,在临床实践中IHC技术可作为筛选ALK的有效方法,qRT-PCR技术可作为区分ALK具体变异类型的一种补充诊断手段。第二章：晚期非小细胞肺癌中ALK融合基因临床意义分析。采用FISH.IHC和qRT-PCR技术分别检测173例选择性晚期非鳞NSCLC患者的ALK状态。分析患者的临床病理学特征,基因变异类型和临床预后。结果显示FISH、IHC和qRT-PCR检测ALK的阳性率分别为35.5%(59/166)、35.7%(61/171)和27.9%(34/122)。ALK融合基因阳性更倾向发生于不吸烟或轻度吸烟、年轻、伴有印戒细胞特征、分化差的腺癌患者。ALK FISH阳性服用克唑替尼患者的中位无进展生存时间(progression free survival, PFS)为7.6个月,总生存时间长于未接受克唑替尼治疗和基因突变野生型患者,但与EGFR基因突变接受靶向治疗患者的生存时间无显著差异。与IHC 1+患者相比, IHC 3+/2+患者具有较长的生存时间(P=0.026)。结果提示根据临床病理特征选择性富集NSCLC患者能够提高ALK融合基因阳性检出率,并能高效筛选合适的患者进行ALK抑制剂治疗。ALK蛋白的表达强度对患者治疗方案的选择具有一定的参考意义。第二部分：非小细胞肺癌靶向治疗耐药相关研究第一章：非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药细胞系的建立及其生物学性状分析和耐药后治疗新策略探索研究。采用埃克替尼低浓度持续加量法诱导,建立EGFR-TKI耐药NSCLC细胞系。对其生物学性状进行分析,探索其耐药机制及治疗新策略。结果发现成功构建的耐药细胞系其个别生物学性状不同于亲代细胞,对另外两种EGFR-TKI类药物吉非替尼和厄洛替尼呈高度交叉耐药性,MET基因扩增是引起耐药的重要原因。耐药前后两株细胞系对西达本胺均敏感,耐药后细胞对克唑替尼敏感。克唑替尼或联合埃克替尼能够明显抑制耐药细胞的增殖,减弱耐药细胞中MET及其信号通路中相关调配分子的活化程度,阻滞细胞在G2/M期并诱导细胞凋亡,同时能明显抑制HCC827IR细胞裸鼠移植瘤的生长。研究结果为临床EGFR-TKI类药物的应用及耐药后治疗方案的选择提供了实验参考,也为EGFR-TKI耐药机制研究及耐药逆转药物筛选等提供了必要的实验模型。第二章：组蛋白去乙酰化酶抑制剂或联合表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用研究。体内外实验研究西达苯胺或联合埃克替尼对携有不同遗传背景NSCLC的抗肿瘤作用及其相关分子机制。结果发现西达本胺单药对A549、HCC827、HCC827IR具有明显的增殖抑制作用,联合埃克替尼对H1975细胞具有明显的协同抑制作用。西达本胺单药或联合埃克替尼能抑制细胞中RAS/MAPK、PI3K/AKT和／或JAK/STAT信号通路的活化,阻滞细胞周期,激活caspase家族凋亡相关蛋白表达,诱导细胞凋亡。西达苯胺单药或联合埃克替尼能通过降低HCC827、HCC827IR和H1975细胞中P-catenin的表达而发挥抗肿瘤作用。西达苯胺能够上调H1975细胞中E-cadherin的表达而增强其对埃克替尼的敏感性。另外,西达本胺能够明显抑制HCC827IR细胞裸鼠移植瘤的生长,联合埃克替尼能够明显抑制H1975细胞裸鼠移植瘤的生长,且未发生体重减轻及其他毒副反应。本研究结果将为HDACi在NSCLC中的临床应用提供实验数据参考。以上两部分研究明确了不同检测技术检测ALK融合基因的临床适用性,揭示了ALK融合基因在中国NSCLC患者中的临床病理学特征及预后意义：同时,建立了NSCLC EGFR-TKI耐药细胞模型,分析了其生物学性状及耐药分子机制,并对耐药后治疗新策略进行了初步探索研究；另外,通过体内外实验揭示了西达苯胺或联合埃克替尼对携有不同遗传背景NSCLC的抗肿瘤作用及其相关分子机制。本研究结果能为NSCLC靶向治疗的临床实践和治疗新策略的开展提供思路。
邢世华[7]2015年在《基于胃肠道代谢的黄芩、连翘药效物质基础研究》文中提出传统中药多以水煎剂形式口服给药,中药经口服进入机体内发挥药效的物质可能不仅有原型成分,也有体内代谢产物。为了阐明中医临床常用清热中药黄芩、连翘的药效物质基础,本研究从胃肠道代谢角度出发,通过体外模拟、体内代谢研究相结合,考察黄芩、连翘水煎液及其主要成分的胃肠代谢物并对代谢产物进行抗补体、抗菌及抗内毒素活性评价,结果证明水煎液及其主要成分经肠道菌代谢后活性增强(去甲汉黄芩素/羟基酪醇)。采用伪无菌动物模型,结合代谢组学、血清药物化学及药物代谢动力学考察肠道菌群对黄芩、连翘主要成分体内代谢和吸收,结果发现并证明了肠道菌代谢产物为黄芩、连翘发挥药效的物质基础。本研究为中药药效物质基础研究以及中药现代化研究提供新的思路。1.本研究首先采用ERIC-PCR指纹图谱分析技术对常用的两种肠道菌孵育方法进行比较,确立了一种与新鲜粪便的肠道菌群结构相似且较稳定的肠道菌孵育方法。2.黄芩体外模拟人胃肠代谢及活性代谢产物的研究,发现黄芩水煎液的主要成分在人肠道菌中发生代谢,代谢后抗补体、抗菌及抗内毒素活性增强,活性最强的为代谢产物去甲基汉黄芩素。首次从黄芩药材中分离得到去甲基汉黄芩苷,对黄芩中8个主要黄酮类成分进行含量测定,黄芩苷、汉黄芩苷、去甲基汉黄芩苷、千层纸素A苷、去甲基汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A在黄芩水煎液中含量分别为110.72±4.25、35.49±2.78、7.52±0.04、16.34±0.51、1.53±0.22、39.27±2.93、12.10±0.15、3.25±0.21 mg/g生药。研究发现黄芩水煎液在人工肠液、人工胃液中稳定,没有代谢产物生成。通过UPLC-QTOF/MS分析黄芩水煎液中主要成分黄芩苷、汉黄芩苷及千层纸素A苷在人肠道菌中代谢过程发现,黄芩苷转化成苷元黄芩素以及黄芩素甲基化产物千层纸素A,汉黄芩苷转化成苷元汉黄芩素及脱甲基产物去甲基汉黄芩素,千层纸素A苷转化成苷元千层纸素A及脱甲基产物黄芩素。黄芩水煎液在人肠道菌中发生的主要代谢变化为各黄酮苷代谢生成其苷元,代谢速率较单体化合物慢。体外活性测试证明黄芩水煎液对补体系统不具有抑制作用,经肠道菌代谢后显示该作用;肠道菌代谢产物黄芩素、千层纸素a及去甲基汉黄芩素经典途径和旁路途径均对补体系统有抑制作用,且对凝血系统无显著影响,其中去甲基汉黄芩素活性(cp50=0.138±0.004mg/ml;ap50=0.147±0.008mg/ml)最强。同样,黄芩水煎液经肠道菌代谢后抗菌、抗内毒素活性增强。黄芩中主要黄酮苷类成分及相应肠道菌代谢产物抗菌活性研究表明,黄芩苷及代谢产物黄芩素、去甲基汉黄芩素、黄芩素及千层纸素a具有抗菌活性,代谢产物抗菌、抗内毒素活性强于原型黄酮苷类成分,其中抗菌活性最强的是去甲基汉黄芩素,抗内毒素活性最强的是去甲基汉黄芩素和黄芩素。去甲基汉黄芩素为黄芩经肠道菌代谢后活性最强的代谢产物,可能经体内过程富集而发挥药效。3.连翘体外模拟人胃肠代谢及活性代谢产物的研究,发现连翘水煎液的主要成分在人肠道菌中发生代谢,代谢后抗补体、抗菌及抗内毒素活性增强,活性最强的为代谢产物羟基酪醇。从连翘药材中分离得到6个化合物,分别为木脂素类成分(+)-连翘苷、(+)-松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷、(+)-松脂素单甲基醚-4-o-β-d-葡萄糖苷、(-)-罗汉松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷、(-)-松脂素单甲基醚-4-o-β-d-葡萄糖苷及苯乙醇苷类成分连翘酯苷e。对连翘药材中含量较高的苯乙醇苷类成分连翘酯苷a及木脂素类成分连翘苷、松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷进行含量测定,其在连翘水煎液中含量为28.37±0.03、3.74±0.02、3.512±0.01mg/g生药。研究发现连翘水煎液在人工胃液、人工肠液中稳定,没有代谢产物生成。连翘中最主要的苯乙醇苷类化合物连翘酯苷a在人肠道菌中首先水解为羟基酪醇和咖啡酸,咖啡酸在肠道菌群作用下还原生成3,4-二羟基苯丙酸。木脂素类化合物连翘苷在人肠道菌代谢作用下生成苷元连翘脂素、连翘脂素脱甲基产物lantibetin、lantibetin单键断裂产物1,2-benzenediol,4-[(2s,3r,4r)-4-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]tetrahydro-3-(hydroxymethyl)-2-furanyl]和肠内脂;松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷在人肠道菌中代谢生成苷元松脂素、开环异落叶松脂素、落叶松脂醇、肠内脂、(2r,3r)-2,3-bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)butyrolactone、(-)-(2r,3r)-3-(3′′-hydroxybenzyl)-2-(4′-hydroxy-3′-methoxybenzyl)butyrolactone。连翘肠道菌代谢主要反应类型有水解、脱甲基、还原、缩合、氧化、脱羟基化;水煎液在人肠道菌代谢速率较单体成分慢。连翘水煎液对补体系统不具有抑制作用,其肠道菌代谢后样品显示该作用。木脂素类成分及相应肠道菌代谢产物不具有抗补体活性,苯乙醇苷类成分连翘酯苷a的肠道菌代谢产物羟基酪醇、3,4-二羟基苯丙酸具有抑制补体系统的作用,对凝血系统无显著影响,活性最强的是羟基酪醇(cp50=0.096±0.007mg/ml;ap50=0.121±0.012mg/ml)。同样,体外活性测试表明连翘水煎液经肠道菌代谢后抗菌、抗内毒素活性增强。木脂素类成分及相应肠道菌代谢产物不具有抗菌、抗内毒素活性;苯乙醇苷类成分连翘酯苷a及肠道菌代谢产物羟基酪醇、3,4-二羟基苯丙酸具有抑菌、抗内毒素活性,羟基酪醇活性最强。羟基酪醇为连翘经肠道菌代谢后活性最强的代谢产物,可能经体内过程富集而发挥药效,连翘药理作用的发挥依赖于肠道菌群的代谢作用,真正起作用的药效物质基础可能为经肠道菌代谢后的代谢产物而非原型成分。4.肠道菌对黄芩、连翘主要成分代谢、吸收影响研究发现,其主要成分在大鼠体内主要发生水解、葡萄糖醛酸结合、甲基化/脱甲基反应;肠道菌群可以通过影响肝肠循环/肠道菌代谢作用影响中药成分体内代谢及吸收过程。使用广谱抗生素塑造伪无菌大鼠模型,比较黄芩、连翘主要成分在伪无菌大鼠及普通大鼠肠道菌中代谢差异,结果显示肠道菌群结构紊乱影响其肠道菌代谢产物的种类及生成速率。比较黄芩、连翘主要成分在普通大鼠及人肠道菌体外代谢过程,结果显示由于人与大鼠肠道菌间存在差异,导致中药代谢产物生成速率、种类在人、鼠肠道菌代谢过程中有所不同。通过uplc-qtof/ms技术分析黄芩、连翘主要成分灌胃给予普通大鼠及伪无菌大鼠的盲肠内容物、尿液代谢产物,结果证明中药成分在普通大鼠体内主要发生葡萄糖醛酸结合、甲基化/脱甲基及水解反应,而伪无菌大鼠中没有代谢产物生成。对伪无菌大鼠和普通大鼠灌胃给予黄芩、连翘主要成分后尿液样品进行多元统计分析,筛选引起两组间尿液差异的代谢标记物。结果显示差异代谢标记物包括氨基酸代谢产物和中药成分体内代谢产物,表明肠道菌群对维持宿主健康及正常代谢具重要意义。黄芩及连翘主要成分灌胃给予伪无菌大鼠及普通大鼠后其血浆中原型成分及肠道菌代谢产物的药代动力学比较结果显示,肠道菌受到抑制后会通过影响肝肠循环、肠道菌水解作用影响中药成分及肠道菌代谢产物的体内吸收及代谢过程,进而影响药效发挥。5.复方制剂中黄芩、连翘血中移行成分研究,验证活性肠道菌代谢产物为双黄连制剂中黄芩、连翘发挥药效的活性物质基础。以双黄连(金银花、黄芩、连翘)制剂为材料进行大鼠灌胃给药、入血成分分析,证明黄芩、连翘的肠道菌活性代谢产物存在于含药血清中,验证了肠道菌群代谢作用在双黄连药效发挥过程中的关键性作用。
徐记迪[8]2015年在《柑橘全基因组DNA甲基化分析及调控作用研究》文中认为表观遗传是指DNA序列不发生变化,但基因表达却发生了可遗传的改变。真核生物中,表观遗传通过调控染色质构象进而影响基因表达来控制植物的发育,其调控机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和小干扰RNA。近年来,表观遗传在植物发育和环境互作中的调控作用被广泛研究,但在柑橘上的研究尚少。为了揭示表观遗传在柑橘生长发育中的调控作用,本课题研究了DNA甲基化在柑橘果实发育过程和愈伤类胡萝卜素代谢的调控作用,并对柑橘基因组中组蛋白修饰酶基因进行了鉴定和分析。另外,本研究还以柑橘胚珠为材料,利用表观组的研究方法解析了柑橘多胚发育过程中的表观变化。主要研究结果如下:1.果实发育过程中DNA甲基化的变化通过毛细管电泳测定6个果实发育时期的DNA甲基化水平,发现DNA甲基化修饰随着果实发育和成熟是动态变化的。进一步克隆了DNA甲基化控制基因,包括3类DNA甲基转移酶基因(CsMET1,CsCMTs and CsDRM1),一个染色质重塑基因(CsDDM1)和去甲基化基因(CsDMEs)。对上述基因在不同组织以及不同果实发育时期的表达分析发现,CsDRM1在幼苗、叶片和花中呈现高表达;在果实发育过程中,CsMET1、CsCMT1、CsCMT2、CsDRM1、CsDMEs在果皮中偏好表达。通过对全基因组甲基化水平的测定和DNA甲基化相关基因的表达分析,说明全基因组甲基化图谱的建立是由甲基化和去甲基化共同作用形成的,且随着生长发育过程而变化。2.5-氮胞苷处理诱导愈伤中类胡萝卜素的降解为了探究DNA甲基化在类胡萝卜素中的调控作用,本研究利用去甲基化试剂5-氮胞苷(5azaC)对高积累类胡萝卜素的愈伤系进行了梯度处理。随着处理浓度的升高,愈伤中类胡萝卜素的含量逐渐降低。上游类胡萝卜素的降解也造成了下游ABA含量的下降。对类胡萝卜素代谢途径中的基因表达分析发现,CpCCD1被大量诱导上调表达。原核表达CpCCD1蛋白到类胡萝卜素工程菌中的实验证实,CpCCD1对玉米黄质、β-胡萝卜素、番茄红素有较强的降解作用。此外,本研究发现5azaC处理虽然造成了全基因组范围内的去甲基化作用,但仍然有一些位点的甲基化水平升高。进一步对控制DNA甲基化的基因进行表达分析发现,5azaC处理可以诱导DNA甲基转移酶基因的表达,推测这些基因的上调表达造成了处理后某些位点甲基化水平的升高。对处理前后愈伤的表达谱分析发现,3380个基因在处理后差异表达,其中2047个基因上调表达,1333个基因下调表达,同时发现MYBs、WRKYs、NACs等大量的转录因子在处理后被激活。进一步的甲基化组分析发现5azaC的去甲基化作用主要发生在基因间区和基因的上游2kb和下游2kb区域。通过筛选,共鉴定出3082个甲基化差异基因(包括基因的启动子区和基因区),其中包含682个上调基因和2400个下调基因,说明5azaC处理造成了广泛的全基因组范围内的去甲基化作用。对甲基化差异基因的功能分类进行分析发现,差异基因主要分布在蛋白质水解、转录因子、信号转导、逆境响应、激素代谢等途径。3.柑橘胚珠发育过程中发生了全基因组范围内的甲基化修饰本研究利用甲基化免疫共沉淀结合高通量测序(MeDIP-seq)的方法首次对柑橘胚珠发育过程中的甲基化组进行了解析。以红夏橙开花前10天(多胚起始前)和开花后15天不授粉(多胚起始后)的胚珠为材料进行甲基化组分析,共鉴定了2349个甲基化差异基因,其中2245个基因上调,104个基因下调,大部分基因的甲基化水平上调说明在这两个时期发生了全基因组范围内的加甲基化修饰。克里曼丁(单胚)受精前后(开花前~1天;开花后15天)的胚珠中也发现了全基因组范围内的加甲基化现象。推测在配子形成过程中发生去甲基化重排后,本研究选取的胚珠组织正处于重新恢复甲基化的阶段。对红夏橙多胚起始细胞发育前后两个时期胚珠的转录组分析共得到1361个上调表达基因和1126个下调表达基因。功能分类显示差异表达基因主要参与激素信号转导、蛋白质水解以及微管等生物学过程。进一步基于前人通过遗传学定位的多胚控制区域,分析了该区域内甲基化变化的基因,并在该区域筛选出了可能与胚发育相关的候选基因。4.全基因组范围内鉴定和分析组蛋白修饰基因基于已测序的甜橙基因组序列,共鉴定了136个组蛋白修饰基因,其中包括四类修饰基因:组蛋白甲基转移酶基因(47个)、组蛋白去甲基化基因(23个)、组蛋白乙酰化基因(50个)以及组蛋白去乙酰化基因(16个)。根据序列特点,将上述基因分为11个基因家族,并对这些基因的染色体分布、基因聚类、基因结构以及保守结构域进行了分析。为了研究这些基因在柑橘果实发育过程中的潜在作用,对筛选出的42个果实高表达基因在6个果实发育时期进行了表达分析,鉴定出了一系列与果实成熟相关的组蛋白修饰基因。进一步对这些基因在响应青霉菌(Penicillium digitatum)侵染果实过程中的表达进行了分析,共筛选出了20个青霉菌侵染响应基因。基于这些分析结果,从中挑选候选基因CsSDG7进行转基因功能验证,发现在山金柑中干涉CsSDG7后,转基因系可以出现早花的表型。
杨双艳[9]2016年在《内质网应激介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路在牵张力作用下牙周膜干细胞成骨向分化中的作用研究》文中认为研究背景及目的正畸治疗过程中,外力通过矫治器作用于牙齿,传递至牙周膜,引起牙周组织、牙槽骨的生物力学反应,最终移动牙齿而达到矫正的目的。力学刺激由牙齿传递到牙周组织,牙周膜发挥了重要的桥梁作用。牙周膜是位于牙根和牙槽骨之间的一层质地紧密的结缔组织膜,由细胞和基质纤维构成。作用到牙齿上的力刺激经牙周膜进一步传递至牙根周围的牙槽骨。牙周组织改建成功与否关键在于牙周膜干细胞(periodontal ligaments stem cells, PDLSCs),它既是正畸矫治力的直接感应细胞,能将机械应力转化为胞内外的生物化学信号；又是正畸力的效应细胞,在外力作用下可分泌并释放多种细胞因子及生长因子,还可能同时参与骨吸收和骨形成过程。有研究表明,PDLSCs含有具备分化潜能的成纤维细胞群,正畸机械作用力可诱导PDLSCs向成骨细胞向分化,进一步参与骨形成与骨吸收,这是正畸牙槽骨改建重塑的关键所在。当PDLSCs受到力学刺激后,机械和物理信号转换为细胞内生化信号的分子机制是十分复杂的,包括多条信号转导途径。例如,一氧化氮(NO)、骨形成蛋白2(BMP2)、转化生长因子β1 (TGF-β1)、前列腺素12(PGl2)、前列腺素E2 (PGE2)、动力敏感钙离子通道等。近来也有研究表明细胞核内调控基因转录的相关骨形成转录因子也参与了这一复杂的调控途径。我们的前期实验已经证实了转录激活因子4(Activating transcription factor-4, ATF4)参与了正畸牙齿移动这一过程,在施加正畸力后ATF4的表达上调,过表达ATF4后成骨相关因子表达量也升高,进一步促进PDLSCs成骨分化。ATF4是cAMP反应元件结合转录因子家族成员之一,它能调节成骨细胞分化和骨形成,而蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase, PERK)在ATF4的上游发挥作用。PERK是一种位于内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白,它的结构包括信号肽、跨膜结构域,其N端位于内质网腔内,C端位于胞浆侧。内质网是真核细胞内一种很重要的细胞器,是蛋白质翻译合成和储存钙离子的场所。当细胞受到缺氧、钙离子平衡失调等刺激时,内质网内一些未折叠或错误折叠的蛋白质累积,内环境的Ca++浓度改变,进而导致内质网结构和功能的失衡,此时相应的信号通路将激活,引发内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress, ERS)。 ERS主要由内质网膜上的三种蛋白-PERK, ATF6,肌醇酶1 (inositol requiring enzym E1, Ire1)介导,其中PERK的激活处于内质网应激的中心地位,作用涉及PERK-eIF2a-ATF4信号通路。在ERS条件下,PERK被激活,导致真核细胞起始因子2a (Eukaryotic initiation factor 2a, eIF2α)磷酸化,进而减弱下游的因子的翻译表达来抑制蛋白质的合成。但与其他因子不同的是,ATF4能够“躲避”eIF2α磷酸化的作用,在eIF2α磷酸化的情况下能够上调ATF4,产生一系列效应。有学者发现在心血管、肾脏等组织器官内以及软骨细胞增殖分化过程中,力学刺激上调ATF4表达涉及PERK,也有研究表明PERK-eIF2a-ATF4信号通路介导的ERS参与成骨细胞的成骨向分化；正畸牙移动有赖于力刺激下牙周组织和骨组织的改建,其中成骨细胞在骨形成和破骨细胞附着分化方面有重要作用,受力PDLSCs的PERK、ATF4表达上调,而二者均与细胞内蛋白质的氧化折叠有关,是内质网应激中的重要信号分子。由此推测内质网应激介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路可能参与正畸加力时牙周组织改建过程,并发挥重要的调节作用。但关于内质网应激介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路在正畸牙齿移动中牙周膜干细胞成骨分化的作用国内外均未见报道。本研究通过人牙周膜干细胞的原代培养,构建牙周膜干细胞体外培养-力学刺激模型,并检测不同加力时间点后内质网应激相关因子和成骨相关基因的表达的水平变化,并在此基础上,采用慢病毒质粒包装构建过表达、沉默表达PERK的稳定细胞系,对正常牙周膜干细胞和病毒转染的牙周膜干细胞实施应力刺激,研究ERS介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路在牵张力作用下牙周膜干细胞的成骨向分化过程中的作用。本课题试图阐明力学因素下PERK-eIF2a-ATF4信号通路在调控人牙周膜干细胞成骨分化过程中的作用,为临床矫治提供理论依据,为进一步研究正畸牙槽骨改建的分子生物学机制提供科学依据,提高矫治效果提供新的思路和方向。研究方法1.人牙周膜干细胞分离培养及鉴定采用传统的组织块法分离培养人牙周膜干细胞,从而获得原代人牙周膜干细胞。传代后对细胞进行形态学观察,并利用血细胞计数板对细胞进行计数,绘制生长曲线。通过免疫细胞化学染色和流式细胞术对培养的人牙周膜干细胞进行鉴定。2.观察牵张力加载下人牙周膜干细胞内质网应激相关因子及成骨相关因子的表达变化选择第4-6代生长旺盛,性质稳定的人牙周膜干细胞进行实验。将细胞以2.5×105/孔的密度接种于BioFlex弹性膜六孔培养板上,培养24小时后换用含2%胎牛血清的条件培养基,继续培养24小时后将培养板置于多通道细胞牵张应力加载系统中,对细胞施加振幅10%,频率0.5HZ的周期性牵张力,加力作用时间为1h,3h,6h,12h,18h,24h。在相应的时间点,提取总RNA和核蛋白,采用荧光定量PCR和Western Blot测定内质网应激相关因子(Bip, Xbp1, PERK, eIFα, p-eIF2α)及成骨相关基因ATF4, OCN, BSP的表达变化。3.分析PERK-eIF2α-ATF4信号通路在牵张力作用下牙周膜干细胞成骨分化中的作用利用上海吉凯公司设计合成并进行慢病毒包装获得过表达PERK基因的慢病毒,干扰PERK基因的慢病毒以及阴性对照的慢病毒。对人牙周膜干细胞进行病毒转染,构建过表达和沉默PERK的牙周膜干细胞模型,随后进行靶细胞感染预实验以及病毒感染复数(MOI)值得摸索,利用最佳MOI值对靶细胞进行感染,通过荧光定量PCR以及Western Blot证实稳定转染过表达和干扰PERK的牙周膜干细胞内PERK的mRNA和蛋白水平。采用茜素红染色来评价基质矿化的程度,同时对感染病毒的细胞也进行了牵张力的加载,拉伸强度10%,频率0.5HZ,加力12h。采用荧光定量PCR和Western Blot检测p-eIF2α和成骨相关基因-ATF4, OCN和BSP的表达水平来进一步分析PERK-eIF2α-ATF4信号通路在牙周膜干细胞成骨分化中的作用。结果1.采用组织块法成功分离培养了原代的人牙周膜干细胞,传代后牙周膜干细胞生长旺盛,状态良好,形态上具备成纤维细胞的特性,约传代后2-3天开始指数增长,8天达到峰值。人牙周膜干细胞通过染色发现波形丝蛋白阳性,角蛋白染色阴性证明其为来源于间充质的细胞群,并通过成骨诱导和成脂诱导表明人牙周膜干细胞具有多向分化能力。2.人牙周膜干细胞在牵张力作用下形态发生一些变化,细胞明显被拉伸,在培养板上逐渐呈方向性生长。细胞加力后内质网应激相关因子(Bip,Xbpl,PERK, eIF2α, p-eIF2α)及成骨相关基因(ATF4,OCN, BSP)的表达均发生了一些变化。Bip在加力后6h之内变化不明显,12h-24h后表达量逐渐增加；Xbp1的变化略有一些波动,在加力3h和6h后表达略有下降,但12h后表达又开始上升。PERK表达量在加力后逐渐增加,加力3h和6h时表达达一个峰值,随后随时间延长逐渐恢复到一个稳定的水平；p-eIF2α的表达在加力早期升高不明显,随加力时间增加而表达量升高,6h达峰值,而eIF2α基本没变化。另一方面,成骨相关基因-ATF4,骨钙素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的表达水平基本上随加力时间延长而升高。ATF4在加力早期1h后就急剧升高并达到峰值,3h和6h时有所下降,后随加力时间逐渐升高；OCN和BSP变化比较有规律,随加力时间延长而表达量逐渐增加。结果证实了周期性张应力可以促使内质网应激相关因子的表达以及牙周膜干细胞相关成骨基因的表达。3.采用慢病毒对细胞进行转染处理,荧光显微镜下可见在转染后72h后病毒转染效率最高。荧光定量PCR以及Western Blot证实稳定转染牙周膜干细胞在过表达PERK后PERK mRNA和蛋白水平都得到显著的提高,而在PERK干扰后PERKR的mRNA和蛋白水平显著下降,并且单独转染阴性载体的牙周膜干细胞与正常牙周膜干细胞无明显差异,慢病毒转染成功。茜素红染色实验发现了PERK过表达的牙周膜干细胞体外培养3周后可以观察到钙结节,说明PERK的过表达促进了牙周膜干细胞的成骨分化；而PERK干扰的牙周膜干细胞体外培养3周后几乎看不到钙结节,说明PERK干扰抑制了牙周膜干细胞的成骨分化。通过荧光定量PCR和Western Blot对牙周膜干细胞内相关成骨基因的水平进行测定,证实了PERK过表达可以有效促进p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表达,牵张力刺激增加这一效应,而PERK抑制减少了p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表达,在牵张力刺激下,对p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表达有所升高但不如PERK过表达组和PERK过表达同时加力组。结论1.牵张力刺激促进内质网应激相关因子(Bip, Xbp1, PERK, p-eIF2a)及成骨相关基因(ATF4, OCN, BSP)的表达变化,牵张力刺激可以在一定程度上诱发内质网应激的发生,从而进一步激活PERK-eIF2a-ATF4信号通路。2. PERK过表达可以促进钙离子的沉积和基质矿化程度,进而促进牙周膜干细胞成骨分化；而PERK干扰则减少钙离子的沉积和基质矿化程度,抑制牙周膜干细胞成骨分化。3.内质网应激介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路参与了牵张力作用下牙周膜干细胞成骨分化的过程。PERK过表达可以有效促进p-eIF2P, ATF4, OCN和BSP的表达,牵张力刺激增加这一效应,牵张力刺激和PERK过表达对牙周膜干细胞成骨基因表达有协同作用；而PERK抑制减少了p-eIF2α, ATF4, OCN和BSP的表达。意义和创新点本课题首次研究了由内质网应激所介导的PERK-eIF2α-ATF4信号通路在牵张力作用下牙周膜干细胞成骨分化过程中的作用,提出了周期性牵张力作为一种应激刺激可以激活内质网应激反应；并建立了体外加力刺激模型,更好的模拟了体内受力环境和受力条件；同时我们采用了过表达和干扰目的基因片段的技术方法,从细胞力学角度和分子生物学角度证明了PERK-eIF2α-ATF4信号通路参与了牵张力作用下牙周膜干细胞的成骨分化,并且过表达PERK可促进周期性牵张力介导的牙周膜干细胞向成骨向分化。这有助于我们更好地理解牙周膜干细胞成骨分化的细胞生物学机制以及进一步探索牙齿移动过程中牙周组织重塑的机理,为临床上实现牙齿快速移动提供一定的理论依据。
王芳[10]2015年在《广西巴马长寿老人肠道菌群及其与膳食纤维多糖饮食关联性研究》文中认为膳食纤维是多糖的重要组成成分,虽其本身不能被宿主消化吸收利用,但对胃肠功能、其他重要营养素和宿主肠道菌群的平衡都具有重要作用,也是保证人体健康的重要物质之一。广西巴马是世界著名的长寿之乡,从其饮食结构研究入手,探索膳食纤维多糖饮食和广西巴马长寿老人肠道菌群相关性,对深入了解膳食纤维多糖功效,阐明饮食与健康长寿关系,服务社会具有重要的意义。目前,世界各个地区长寿老人肠道菌群特征正在不断被报道。然而,对于广西巴马这样一个世界著名的长寿乡,历史悠久且生活饮食独具特色的人群,迄今为止仍没有关于该人群肠道菌群与其饮食结构相关性的研究报道。本研究利用流行病学饮食调查问卷FFQ23、Illumina MiSeq高通量测序技术、变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、属特异性克隆文库和种特异性荧光定量PCR技术,对广西巴马百岁老人、巴马80-99岁老年人和南宁80-99岁老年人饮食情况、肠道菌群结构、双歧杆菌群落结构、乳酸菌群落结构进行探索研究,旨在揭示广西巴马长寿老人肠道菌群结构特征,深入分析饮食结构与巴马长寿老人肠道菌群的密切联系。饮食调查结果表明,广西巴马长寿地区饮食特点是以粥类、粗杂粮类、深色蔬菜类、家畜肉类食物摄入为主的膳食纤维多糖饮食模式。与《中国居民膳食指南》推荐量相比,除百岁老人饮食中谷物摄入量达标率为71.43%和巴马80-99岁老年人蔬菜摄入量达标率为52.63%外,长寿地区老年人饮食模式中其他食物摄入量达标率均小于15%,其中畜禽肉类摄入水平显著高于非长寿地区老年人(p<0.05)。营养结构分析显示长寿地区膳食纤维摄入量显著高于非长寿地区老人(p<0.05),且相比于2004年中国居民膳食营养素参考摄入量,长寿地区百岁老人饮食结构中其他营养素达标率很低的情况下,仅维生素A摄入量达标率为100%。百岁老人三大营养素供能比为：蛋白质17.94%,脂肪35.82%,碳水化合物52.23%,结果显示我国居民膳食指南的推荐量不适合健康高龄老人的饮食需求。基于16S rDNA的Illumina MiSeq高通量测序技术结合多元统计分析识别老年人肠道菌群与其饮食结构、食物摄入量及营养素摄入量之间的相关关系。结果表明,对比80-99岁老年人,巴马百岁老人肠道菌群多样性增加(p<0.05)。基于肠道菌群α和β多样性分析结果证实了三组老年人肠道菌群构成差异明显,其中在肠道菌群属水平中罗氏菌属(Roseburia)和埃希氏菌属(Escherichia)的相对丰度在百岁老人粪便中显著偏高(p<0.05),而乳酸菌属(Lactobacillus)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、丁酸弧菌属(Butyricimonas)、粪球菌属(Coprococcus)、巨单胞菌属(Megamonas)、光冈菌属(Mitsuokella)、萨顿氏菌属(Sutterella)和Akkermansia的相对丰度显著偏低(p<0.05)。通过与饮食结构、食物摄入量、营养素摄入量相关性分析发现,瘤胃菌科(Ruminococcaceae)与膳食纤维多糖饮食、罗氏菌属(Roseburia)与粗杂粮摄入量和膳食纤维多糖营养素摄入量呈现正相关关系。基于巢式PCR-DGGE.属特异性克隆文库和种特异性荧光定量PCR技术结合多元统计分析识别老年人肠道双歧杆菌群落结构与其饮食结构中的食物摄入量及营养素摄入量之间的相关性。结果表明,百岁老人粪便双歧杆菌群落结构多样性增加。除最小双歧杆菌(Bifidobacterium minimum)、鸡双歧杆菌(B. saecularmay/B. pullorum/B. gallinarum)和摩恩格里艾恩斯双歧杆菌(B. mongoliense)是百岁老年组独有菌种外,齿双歧杆菌(B. dentium)、长双歧杆菌(B. longum)、嗜热双歧杆菌(B. thermophilum)、假链状双歧杆菌／链状双歧杆菌(B. pseudocatenulatum/B. catenulatum)和青春双歧杆菌(B. adolescentis)是三组老年人共有的肠道双歧杆菌。它们的差异性主要表现为：对比巴马80-99岁组,巴马百岁组中长双歧杆菌(B. longum)和齿双歧杆菌(B. dentium)的数量显著增加(p<0.05)；对比南宁80-99岁,百岁组中青春双歧杆菌(B. adolescentis)的检出率显著降低(p<0.05)。与饮食关联性研究发现,长双歧杆菌(B. longum)的含量与家畜肉类摄入量呈显著负相关(p<0.05),青春双歧杆菌(B. adolescentis)的含量与河鲜类摄入量呈显著正相关(p<0.05),嗜热双歧杆菌(B. thermophilum)的含量与碳水化合物摄入量呈显著正相关(p<0.05)。基于巢式PCR-DGGE、属特异性克隆文库和种特异性荧光定量PCR技术结合多元统计分析手段识别老年人肠道乳酸菌群落结构与其饮食结构中的食物摄入量及营养素摄入量之间的相关关系。结果表明,百岁组粪便乳酸菌群落结构多样性增加,同型发酵乳酸菌数量和检出率增加,而异型发酵乳酸菌群落结构发生重排。它们之间主要的差异表现为：百岁组中嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)、发酵乳杆菌(L. fermentum)、融合魏斯氏菌(W. confusa)和乳明串珠菌(L. lactis)的数量显著提高(p<0.05),且对比80-99岁组,发酵乳杆菌(L. fermentum)和融合魏斯氏菌(W. confusa)的检测率也显著增强(p<0.05)。造成该差异的主要菌种为：融合魏斯氏菌(W. confusa)、嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)和罗伊氏乳杆菌(L. reuteri),其中融合魏斯氏菌(W. confusa)与罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)存在显著负相关关系。与饮食的关联性研究发现,融合魏斯氏菌(W. confusa)与粥类、粗杂粮及家畜肉类的食物摄入量具有显著正相关关系(p<0.05),而罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)与膳食纤维摄入量具有显著负相关关系(p<0.05)。综上所述,在百岁老人饮食结构中粗杂粮所占的比例高,而他们的肠道菌群中有益菌的数量也高,如罗氏菌属(Roseburia),且益生菌——双歧杆菌和乳酸菌群落多样性都更加丰富。上述的研究结果为健康长寿老人肠道菌群与其膳食纤维多糖饮食关联性学说提供了新的理论依据。
参考文献：
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[8]. 柑橘全基因组DNA甲基化分析及调控作用研究[D]. 徐记迪. 华中农业大学. 2015
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[10]. 广西巴马长寿老人肠道菌群及其与膳食纤维多糖饮食关联性研究[D]. 王芳. 广西大学. 2015