王秦秦, 马丽菊, 李海红, 李继梅[1]2004年在《肺癌相关性抗原基因的克隆与鉴定》文中指出目的:外源基因导入表达载体后可在原核或真核系统表达出目的蛋白,应用针对该蛋白的特异抗体可从数目庞大的c DNA文库中免疫筛选出目的蛋白的编码基因或片段。用抗肿瘤单克隆抗体对肿瘤细胞的cDNA文库中进行免疫筛选,所获得的目的蛋白编码基因或片段,十分有助于在分子水平上揭示肿瘤细胞发生、发展、侵袭、转移等生物学行为的机理和规律,其中与肿瘤细胞无限增殖有关的相关蛋白分子编码基因克隆具有更为积极的
马丽菊[2]2003年在《肺癌相关性抗原基因的克隆与鉴定》文中提出目的：外源基因导入表达载体后可在原核或真核系统表达出目的蛋白，应用针对该蛋白的特异抗体可从数目庞大的cDNA文库中免疫筛选出目的蛋白的编码基因或片段。用抗肿瘤单克隆抗体对肿瘤细胞的cDNA文库进行免疫筛选获得的目的蛋白编码基因或片段，十分有助于在分子水平上揭示肿瘤细胞发生、发展、侵袭、转移等生物学行为的机理和规律；其中与肿瘤细胞无限增殖有关的相关蛋白分子编码基因的克隆具有更为积极的意义，可以为恶性肿瘤的免疫诊断和免疫治疗开拓出广阔的应用前景。抗人肺癌单克隆抗体N-35能特异地识别多种恶性肿瘤细胞不同分子量的蛋白组分，但与正常组织细胞不发生反应，因此采用抗人肺癌单克隆抗体N-35，对其相应的抗原基因进行克隆和鉴定具有重要意义。方法：利用抗肿瘤单克隆抗体N-35对构建于表达载体λgt11中的小细胞肺癌细胞H128cDNA文库进行原核系统表达的免疫学筛选，对获得的阳性克隆进一步亚克隆后行PCR和Western blot鉴定。结果：获得42个能与N-35特异反应的阳性克隆，对其中1个亚克隆后进行PCR，经测序知其cDNA插入片段长1262bp。在GenBank中经序列比较与人蛋白磷酸酶2(原称蛋白磷酸酶2A)的催化亚基，α同功型基因有99％的同源性。Western blot证实该片段的表达产物依然保持同N-35反应的特异性。结论：本实验研究获得了肺癌相关性抗原的cDNA基因片段，该片段与人类蛋白磷酸酶2(原称蛋白磷酸酶2A)的催化亚基、a同功型基因高度同源:该基因的突变及其编码蛋白质的糖基化可能与肿瘤的发生有关。发现了用研陀stem blot鉴定用免疫学方法筛选文库得到的阳性克隆是否真实可靠的方法。
陈立钊[3]2008年在《功能性抗体库技术分离鉴定肺癌功能性基因的研究》文中进行了进一步梳理肺癌是严重威胁人类生命与健康的恶性肿瘤,发病率、死亡率均位居第一位。目前治疗肺癌的叁大手段仍未能显着降低肺癌的死亡率。分子靶向治疗在临床肿瘤治疗中显示出良好的应用前景,也是目前肿瘤研究的热点。实现分子靶向治疗的前提和关键是获得肿瘤特异表达的功能性靶分子、靶基因。为此,本文采用大容量功能性抗体库技术筛选肺癌功能性单抗,再通过功能性抗体分离鉴定肺癌功能性基因。并探讨功能性基因在肺癌发生发展中所起的作用功能及其分子作用机理。从而为肺癌的靶向治疗提供有价值的分子靶标。第一部分功能性单抗库技术筛选分离、鉴定肺癌功能性抗原基因采用新鲜肺癌组织分离的有核细胞免疫BALB/c小鼠,融合制备库容为1440个克隆的肺癌功能性单克隆抗体库。免疫细胞化学筛选获得377株稳定分泌抗人肺癌细胞单抗的杂交瘤,通过肺正常组织的免疫组化实验,排除271株与正常肺组织阳性反应的单克隆抗体,获得106株识别肺癌组织中抗原的表达高于正常肺组织表达水平的功能性单抗。肺癌及其正常肺组织的配对组织芯片检测证实67株单抗与肺癌组织呈强阳性反应,而与正常肺组织不反应或弱反应。这些单抗识别的抗原有表达于细胞膜的,也有表达于胞浆和/或胞核的。MTT法测定106株肺癌单抗对肺癌细胞增殖生长的影响,发现抑制肺癌细胞增殖生长的单抗57株,其中,抑制率大于20%的单抗有24株,抑制率在15-20%的单抗22株。RT-CES~(TM)系统实时观察106株单抗对肺癌细胞生长的影响,结果显示49株单抗能够显着抑制肺癌细胞的生长,其中16株单抗抑制率在20%以上,20株单抗抑制率在15-20%,其余单抗抑制率在10-15%。106株单抗的亚类分析证明既有不同的重链类和亚类(IgM,IgA,IgG1,IgG2a及IgG2b),也有不同的轻链型(κ,λ),表明本研究制备的功能性单抗库有很好的多样性。挑选27株功能单抗进行了裸鼠体内移植瘤抑制实验,结果证实23株单抗在裸鼠体内能显着抑制肺癌的生长和瘤重,其中6株单抗体内抑瘤率在70%以上,8株单抗抑瘤率在50-70%,另外6株单抗抑瘤率在30-50%,其余3株抑瘤率在30%以下,这些结果也提示功能性单抗所识别的抗原基因是功能性基因,具有促进肺癌细胞增殖生长功能。选取其中的5株功能性单抗分离鉴定其功能性抗原蛋白,运用免疫亲和层析和MALDI-TOP-PMF质谱技术鉴定获得了3个肺癌功能基因。单抗1E2识别的抗原基因为氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPS1),5B8抗体识别的抗原基因为理阿诺碱受体1(RyR1),13H3抗体所识别的抗原基因为凝集素半乳糖苷结合可溶3结合蛋白基因(LGALS3BP或者Mac-2BP)。第二部分肺癌抗原Mac-2BP基因功能的研究文献报道Mac-2BP在大部分肿瘤组织高表达,但是关于Mac-2BP在肿瘤发生发展中所起的功能作用却很少有研究报道。因此,以Mac-2BP为研究对象,进行多种功能实验研究,揭示Mac-2BP基因在肺癌发生发展中的功能作用及其在临床疾病研究方面的应用价值。采用基因敲降及免疫共沉淀技术验证质谱鉴定结果,证明肺癌功能单抗13H3识别的抗原基因确实为Mac-2BP。应用细胞免疫荧光和免疫细胞化学实验证实Mac-2BP在多种肺癌细胞有较高水平的表达。免疫组化分析105例肺癌病人癌组织及其配对正常肺组织Mac-2BP基因的表达,发现Mac-2BP在肺癌组织的表达显着高于正常肺组织,同时还发现Mac-2BP的表达水平与肺癌患者的癌组织分化程度具有显着相关性,这些结果提示Mac-2BP可作为一种新的肺癌分子标志物,具有临床诊断及预测病人预后状况价值。应用抗体13H3检测分析Mac-2BP基因体外对肺癌细胞增殖、粘附及侵袭迁移功能的影响,未观察到阳性结果,其原因可能是Mac-2BP在所检肺癌细胞体外培养分泌表达蛋白水平及含量太低所致。应用纯化后抗体再次进行体内抑瘤实验,评估抗体对肺癌生长的影响,13H3单抗能显着抑制肺癌移植瘤生长,且具有剂量依赖关系。结果发现其高、中、低剂量的抑制率分别为60.14%、54.86%和43.84%,进一步证明13H3是功能性肺癌单抗,Mac-2BP基因是肺癌功能性基因,它能促进肺癌的增殖生长。为了从基因水平进一步证明Mac-2BP表达在肺癌细胞生长的促进作用,采用RNAi干扰技术敲降肺癌细胞Mac-2BP基因的表达,检测基因敲降前后肺癌细胞增殖、粘附及迁移侵袭的变化。结果证明Mac-2BP基因敲降后肺癌细胞的增殖能力降低38.5%,肺癌细胞与胞外基质collagenⅠ的粘附降低40%,与matrigel粘附降低50%,与FN粘附水平减少35%以上,肺癌细胞体外迁移和侵袭能力分别下降27%和29%。应用稳转shRNA敲降Mac-2BP基因表达的体外功能实验研究也获得了相似的结果。同时,体内抑瘤实验研究结果也表明Mac-2BP基因敲降后,肺癌细胞在裸鼠体内的增殖生长能力显着降低,其对瘤重的抑制率高达80%。基因敲降的体内外功能实验研究再次证明Mac-2BP是一个具有促进肺癌细胞生长增殖、促进与胞外基质粘附和迁移侵袭功能的功能性基因。为了探讨Mac-2BP促进肺癌生长增殖的作用机制,我们测定了Mac-2BP基因敲降后对肺癌细胞细胞周期变化的影响。研究结果发现该基因敲降后,肺癌细胞发生G1期阻滞,致使增殖减慢,进一步研究发现Mac-2BP基因敲降后,抑癌基因p27诱导上调表达。这表明Mac-2BP基因通过调节P27蛋白水平,影响细胞周期进程,从而促进肺癌细胞在体内外的快速增殖和生长。因此该基因具有作为肺癌靶向治疗的一个新的功能性分子靶标的潜力。
李国惠[4]2005年在《肺癌血清分子标志物的研究及应用》文中研究说明肺癌是严重威胁人类生命和健康的恶性肿瘤，具有发病率高、死亡率高、五年生存率低的特点。降低肺癌“两率”以及提高患者预后的关键问题在于肺癌的早期发现和早期诊断。然而，目前仍然缺乏有效的技术和手段。SEREX技术的建立不仅为肿瘤抗原的筛选提供了一种新途径而且该方法通过对肿瘤抗原的自身抗体进行检测为肿瘤的发现提供了一种新型的血清学标志物。然而，目前对这些肿瘤抗原的自身抗体研究甚少，而且已有的研究均集中在对IgG型抗体的研究上，罕有其它类型抗体研究的报道。为此，本研究采用了改进的SEREX方法对介导IgM体液免疫的肺癌抗原进行了筛选和鉴定，采用自己建立的抗原蛋白芯片技术对多个抗原的自身抗体进行了深入的研究，以期揭示这些肺癌抗原的血清抗体谱与肺癌发生、发展的内在联系，从而为肺癌以及癌前病变的早期诊断、高危人群的筛查提供有用的血清学标志物和有效的检测手段。 第一部分 肺癌相关抗原的筛选、分离及鉴定 采用多种病理类型的早期肺癌组织构建了肺癌的cDNA表达文库，原始文库库容达到4×10~6pfu。使用含有多种肺癌病理类型的自体以及30例异体混合血清对介导IgM体液免疫反应的肺癌抗原进行了筛选。目前，使用异体混合血清筛选文库的报道较少，而筛选介导IgM免疫反应的肿瘤抗原还未见报道。结果共获得了78个阳性抗原克隆，核苷酸序列测定和生物信息学分析表明这78个阳性克隆代表了56个不同的抗原基因。根据其生物学
佚名[5]2004年在《作者索引》文中进行了进一步梳理Vamla B抗BACP1抗体的制备及鉴定(1):30-33 Wernig A人源性成肌细胞和肌管细胞中β-Tubulin Ⅲ的表达(13):1157-1161 A 阿明长春瑞宾+顺铂治疗非小细胞肺癌48例(8):743 结肠镜诊断大肠癌632例(11):1024 沙培林+顺铂治疗恶性胸腔积液43例(12):1133 艾国平植入贫铀片大鼠血液和肝肾功能的变化(2):182-185 吸入贫铀粉尘和/或嵌入贫铀片大鼠体内铀的分布(6):503- 506
阳志军[6]2008年在《卵巢上皮癌相关抗原的筛选、鉴定、血清学检测及抗原基因生物学功能的初步研究》文中研究表明卵巢癌是严重危胁女性生命健康的恶性肿瘤,具有起病隐藏、复发死亡率高的特点。因早期缺乏典型临床症状,75%患者确诊时已是晚期,这些患者的5年生存率也从临床Ⅰ期患者的95%下降到约20～25%,因此早期诊断对于提高生存率、改善患者预后具有重要的意义。然而,目前仍缺乏有效的早期诊断方法,没有能有效用于卵巢癌早期诊断的标志物。SEREX技术的建立不仅为肿瘤抗原的筛选提供了一种新的方法,而且通过对肿瘤抗原自身抗体的检测为肿瘤的诊断提供了新的血清标志物。目前对肿瘤抗原自身抗体的研究主要集中在IgG型抗体,对于IgM型抗体的报导很少。本研究在已有的研究基础上,用SMARTA法对从卵巢浆液性囊腺癌腹水肿瘤cDNA表达文库中筛选出10个抗原克隆进行血清学检测,对其中6个(TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189)在卵巢癌血清中阳性率明显高于正常对照血清的抗原克隆进行测序分析;用RT-PCR法检测它们在卵巢癌组织中的表达情况;构建、表达、纯化了原核重组融合蛋白;建立了间接ELISA法,检测了血清中这些抗原IgG、IgM型自身抗体的相对含量,分析了这些卵巢肿瘤相关抗原自身抗体(谱)在卵巢癌诊断及预后中的作用;并对其中一个相关抗原基因FXR1在卵巢癌细胞中的生物学功能进行了初步研究。第一部分卵巢上皮癌相关抗原异体血清筛选及生物学信息分析目的:检测候选卵巢上皮癌相关抗原克隆与卵巢癌、正常对照血清中相应IgG、IgM型自身抗体反应情况,并对阳性反应率差异显着的抗原克隆进行测序及生物信息学分析。方法:用SMARTA法对10个候选卵巢上皮癌相关抗原克隆与62例卵巢癌、62例正常对照血清中IgG、IgM型自身抗体反应情况进行定性检测,从中选出在癌血清中抗体阳性反应率与正常对照血清相比差异显着的抗原克隆,进行核苷酸测序,在相关网站上进行生物信息学分析。结果:其中6个抗原克隆与卵巢癌血清中自身抗体阳性反应率显着高于正常对照血清,在癌血清中的阳性率为12.9%～27.4%,在正常血清中的阳性率为1.6%～11.3%,其中IgM型自身抗体的阳性率为19.4%～27.4%。对这6个抗原克隆进行核苷酸测序,经比对分析发现这6个抗原克隆其中4个是已知基因(TM4SF1、C1D、TIZ、FXR1),一个是与卵巢癌相关基因高度相似的基因(OV-142),一个是Genbank中无相似序列的新基因(OV-189)。TM4SF1蛋白是一种有四个疏水跨膜区的细胞表面蛋白,该蛋白在对调节细胞生长、活化、迁移的信号转换中起媒介作用,在肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢上皮性癌等上皮细胞恶性肿瘤中高表达,是一种细胞表面抗原,可作为抗体免疫治疗的靶向。C1D基因编码的是一个保守的DNA绑定蛋白,C1D蛋白是一个隐藏的凋亡激活剂,是多发性肌炎硬皮病重迭综合征的自身抗原。FXR1蛋白是一种RNA绑定蛋白,可在在核与胞浆间穿梭,与多聚核糖体有关,具有细胞生长依赖的翻译活性功能,有可能是硬皮病的一种自身抗原,并且在肺鳞状细胞癌中检测到FXR1基因的过表达。TIZ是一个锌指蛋白,通过调节肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的信号活性,在破骨细胞分化过程中起一定作用。尚未见有C1D、TIZ、FXR1与卵巢癌相关的报导。其中OV-142有可能是BARD1基因的剪切变异体,可能有MHC-Ⅰ类抗原表位肽,可能成为卵巢癌免疫治疗的新靶点。初步认为OV-189是LINE中有转录活性的一种—L1家族中的一个新成员,可能有MHC-Ⅰ类抗原表位肽,有可能成为卵巢癌免疫治疗的靶点。结论:我们的研究显示卵巢上皮癌相关抗原不仅能够介导IgG体液免疫反应而且能够诱导机体产生特异性的IgM自身抗体,这些抗原克隆在异体癌血清中较高的抗体阳性反应率,提示这些抗原的自身抗体有可能成为卵巢癌诊断的血清标志物。这些抗原基因有进一步研究的价值。第二部分RT-PCR检测卵巢上皮癌相关抗原基因在卵巢癌组织中的相对表达水平目的:检测卵巢上皮癌相关抗原基因在卵巢癌、良性卵巢肿瘤、正常卵巢组织中的相对表达水平。方法:用RT-PCR方法检测上述6个卵巢上皮癌相关抗原基因在36例卵巢癌、15例良性卵巢肿瘤及13例正常卵巢组织中的相对表达水平。结果:这6个抗原基因在癌、良性肿瘤、正常卵巢组织中几乎都有表达,只是在癌组织中的表达水平明显高于良性肿瘤及正常卵巢组织。显示出叁种表达趋势:一类是癌组织中的表达水平显着高于正常卵巢组织,而良性肿瘤组织中的表达水平高于正常组织,癌组织中的表达水平稍高于良性肿瘤组织(TIZ、C1D、TM4SF1、OV-142);一类是癌组织中的表达水平显着高于良性肿瘤及正常卵巢组织,而良性与正常组织中表达相当(OV-189);一类是癌组织中的表达水平明显高于良性,癌与良性肿瘤组织中的表达水平均显着高于正常组织,且晚期癌组织中表达水平显着高于早期,分化差的组织表达水平显着高于分化好的(FXR1)。结论:我们在mRNA水平证实这6个卵巢上皮癌SEREX抗原基因均与癌组织有很好的相关性。第叁部分卵巢上皮癌相关抗原蛋白的表达、纯化目的:在原核表达系统中构建、表达、纯化这6个抗原蛋白。方法:用RT-PCR克隆这些抗原基因的CDS,在pET-30b(+)系统中构建原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达重组融合蛋白,采用Ni-NTA His-Bind Resins和SDS-PAGE制备胶电洗脱进行纯化,复性、浓缩得到有活性的目的蛋白。结论:成功构建、表达、纯化了这6个抗原蛋白,得到浓度在0.3～0.8mg/ml之间,纯度都在90%以上、有活性的重组融合抗原蛋白。第四部分卵巢癌上皮癌相关抗原自身抗体谱的研究目的:用自己制备的抗原蛋白建立间接ELISA法,检测这些卵巢上皮癌相关抗原在血清中相应自身抗体的相对含量,并分析它们的临床价值。方法:建立间接ELISA法,检测126例治疗前、24例治疗后卵巢癌、42例良性卵巢肿瘤、20例乳腺癌、20例食管癌、20例肺癌癌患者、142例正常女性对照血清中卵巢上皮癌相关抗原IgG、IgM型自身抗体的相对含量。绘制ROC曲线,确定cut off值,单独或用Logistic回归分析法联合分析这些自身抗体/抗体谱的临床价值。同时测量CA125的含量,比较自身抗体谱与CA125在卵巢癌诊断上的效能。结果:分析单个自身抗体时,卵巢癌血清中这些抗原IgG型自身抗体反应的阳性率为34.1%～47.6%,非癌患者的阳性率为13.0%～17.9%;癌血清中IgM型自身抗体反应的阳性率为39.7%～53.2%,非癌患者的阳性率为12.0%～33.2%,分析单个卵巢癌相关抗原自身抗体在卵巢癌诊断时意义均不大,但TIZ、FXR1、OV-189抗原IgM型自身抗体在早期病人中的阳性率均高于晚期病人,两者相比较差异有统计学意义。当联合多个自身抗体(抗体谱):TM4SF1 IgG、C1D IgG、TIZ IgG、TIZ IgM、FXR1 IgG、FXR1 IgM分析时敏感为75.4%,特异性为78.2%,准确性为76.5%,与单独分析CA125相比较敏感性明显提高(61.1%),特异性降低(89.1%),准确性相当(77.7%),但该自身抗体谱在早期(76.6%versus 51.1%)尤其是Ⅰ期(83.3%versus 44.4%)卵巢癌诊断的敏感性显着高于CA125,差异有统计学意义。将多个卵巢癌相关抗原自身抗体(TM4SF1 IgG、TM4SF1 IgM、C1D IgG、TIZ IgM、FXR1 IgG)与CA125联合分析时,诊断卵巢癌的敏感性为86%,特异性为91%,准确率为88.7%,与CA125相比,在敏感性、特异性、准确性均提高,阳性预测值、阳性似然比、阴性预测值明显提高,阴性似然明显降低;并且与CA125联合后在上皮性癌(包括浆液、粘液性癌)的诊断敏感性显着高于CA125,统计学上差异有显着性;同时对于早期、晚期卵巢癌的诊断敏感性亦显着高于CA125,统计学上差异有显着性。比较了配对的24例卵巢癌患者治疗前后卵巢癌自身抗体谱变化情况,结果显示治疗后自身抗体谱的阳性率显着低于治疗前。乳腺癌、食管癌、肺癌血清的检测,结果发现卵巢癌自身抗体谱的阳性率分别为30%、20%、25%。结论:卵巢癌患者血清中存在IgG型、IgM型肿瘤自身抗体,并且可用于卵巢癌早期诊断。联合多个卵巢癌肿瘤自身抗体可达到与CA125相当的诊断效果,且该自身抗体谱在早期特别是Ⅰ期卵巢癌的诊断上优于CA125。将多个自身抗体与CA125联合可显着提高卵巢癌的诊断效能。卵巢上皮癌相关抗原自身抗体谱对疗效也有一定的监测作用。第五部分真核转染上调FXR1基因表达对卵巢癌细胞生物学行为影响的初步研究目的:了解上调FXR1基因表达对卵巢癌细胞系H08910生物学行为的影响。方法:RT-PCR扩增FXR1 CDS,构建FXR1真核表达载体,脂质体介导下转染H08910细胞,经G418筛选获得稳定转染株,检测转染后细胞相应生物学行为。结果:成功构建了FXR1基因的真核表达载体,并稳定转染了H08910细胞。生长曲线显示上调FXR1基因表达可促进细胞的生长;克隆形成实验显示上调FXR1基因表达可促进细胞增殖,基质粘附实验显示上调FXR1基因表达可加强细胞对基质的粘附能力,流式细胞周期检测亦发现与对照(80%)相比,转染FXR1基因后G1期细胞(67.1%)比例明显减少,这说明转染FXR1后细胞的增殖更旺盛。同时发现FXR1对细胞侵袭、迁移的能力无明显影响。凋亡检测虽提示转染FXR1基因后早期凋亡细胞的比例较对照增多,但总的凋亡细胞比例太少仅0.31%,意义可能不大。结论:真核载体稳定转染技术是一种可靠、行之有效的研究基因功能的方法。上调FXR1基因表达可能有促进卵巢癌细胞的生长、增殖、加强细胞对基质粘附能力的作用。第六部分RNA干扰FXR1基因对卵巢癌细胞系生物学行业影响的初步研究目的:了解抑制FXR1基因表达对卵巢癌细胞系A2780生物学行为的影响。方法:设计、合成、筛选有效的FXR1基因siRNA,将有效siRNA商业化构建siRNA表达载体,脂质体介导下转染A2780细胞,经G418筛选获得稳定转染株,检测转染后细胞相应生物学行为。结果:设计并成功筛选出了抑制效率达80%的FXR1基因siRNA,将商业构建的siRNA表达载体成功稳定转染了A2780细胞,抑制效率约60%。细胞生长曲线显示出下调FXR1表达可轻度抑制细胞的生长;克隆形成实验结果显示,下调FXR1基因的表达对A2780细胞的增殖能力有的抑制作用;流式细胞周期分析发现下调FXR1基因的表达G1期细胞比例为49.2%多于转染阴性对照组(40%),S期与G2期比对照比例稍少,提示抑制FXR1基因的表达可延缓细胞增殖;同时发现下调FXR1基因的表达对A2780细胞体外侵袭、迁移能力、基质粘附能力及凋亡无明显影响。结论:RNAi技术是一种强有力的研究基因功能的方法。抑制FXR1基因的表达可轻度抑制A2780细胞的生长、明显抑制细胞增殖。
蒋燕明[7]2005年在《卵巢癌相关抗原的筛选及鉴定》文中研究指明肿瘤抗原的寻找一直是肿瘤免疫学研究中面临的重要课题。Sahin 报告的SEREX(Serological analysis of recombinant eDNA expression libraries)方法是从体液免疫的角度寻找肿瘤抗原,为寻找肿瘤抗原提供了一种全新的途径。以应用于许多类型的肿瘤抗原的筛选,发现了一些新的肿瘤排斥抗原,显示出该方法具有良好的应用前景。卵巢癌在女性恶性肿瘤中死亡率居于第一位,其中最常见的晚期上皮性卵巢癌5 年生存率长期停留在20～30%左右,其主要原因是卵巢癌发病部位隐蔽,难以早发现,早治疗,预后差。目前的诊断方法有限,寻找新的更具优势的肿瘤抗原用于诊断是急需研究的课题。用SEREX 方法筛选卵巢癌肿瘤抗原的研究在国内外较少。本研究所用卵巢癌eDNA 表达文库由本课题组构建,该文库已应用SEREX 和SSH 相结合的筛选肿瘤抗原基因的技术策略,并获得了180 个卵巢癌肿瘤抗原基因克隆。本文对其中45 个卵巢癌候选抗原基因在34 例卵巢癌患者和34 例正常人血清中相应IgG,IgM 抗体的检测、分析发现,其中6 个抗原克隆的IgG 血清抗体的阳性率均明显的高于相应正常人血清中的阳性率,4 个抗原克隆的IgM 血清抗体的阳性率均明显的高于相应正常人血清中的阳性率。分析筛选的阳性卵巢癌抗原与卵巢癌患者的临床病理关糸发现,lO 个卵巢癌抗原在卵巢癌血清中的自身抗体与其病理学类型及组织学分级无相关性。分析这些抗原的自身IgG抗体与卵巢癌临床分期的关系发现,不同抗原的抗体在卵巢癌的不同期别可发生明显的升高。这些结果说明卵巢癌的发生是一个多阶段、多步骤、多基因参与的过程。我们的研究发现数个卵巢癌抗原的血清IgM 抗体在卵巢癌早期阶段就发生了明显的升高,提示这些肿瘤抗原的自身抗体可能成为卵巢癌早期诊断的血清学标志物。本研究把10 个抗原克隆联合起来分析发现,分别用IgG 抗体和IgM 抗体检测都能提高卵巢癌诊断的敏感性和特异性:而同时用IgG 抗体和IgM 抗体检测,则能够在保证特异性不变的前提下,明显提高了诊断的敏感性和准确性。这个发现为将来研究卵巢癌肿瘤标志物,用以诊断卵巢癌提供了一个新的方向。得到的其中7 个阳性克隆的序列进行生物信息学分析,经与GeneBank 和SEREX 数据库比较、分析发现这7 个卵巢癌候选肿瘤抗原基因可以分为4 类:①1 个与已知卵巢癌相关基因同源的基因,可能是乳腺癌或卵巢癌癌性突变的靶位;②3 个与一些具特殊功能蛋白的基因同源的基因:③2 个可能与细胞生长、分化功能有关的基因;④1 个在GeneBank 中无同源序列的新基因。初步分析这些基因均是具有不同功能的功能性基因。
彭良平[8]2001年在《食管癌特异及相关肿瘤抗原的研究》文中研究说明食管癌发病率占我国恶性肿瘤的第四位，死亡率占我国恶性肿瘤的第二位，降低食管癌发病率的关键问题是食管癌的早期发现和早期诊断，降低食管癌死亡率的关键问题是防治食管癌的复发和转移，为了进行食管癌的早期发现和早期诊断工作，我国目前采用的手段主要是食管内窥镜和食管拉网诊断法对食管癌高危险人群进行大规模的普查，但这些方法操作复杂、工作量大、病人对这些诊断方法的接受率低，因此，很有必要寻找简单、方便的血清标志物来辅助食管癌的高危险人群的普查工作，目前，还没有能用于食管癌诊断的血清标志物。然而，对于食管鳞状上皮重度不典型增生和中度不典型增生，已近临界区，任何阻断策略均难以控制其癌变趋向，必须采取治疗性预防措施，但目前治疗食管癌除了传统的手术治疗、化、放疗外，尚无新的治疗措施，因此，探索新的治疗方法十分重要。 肿瘤特异性抗原在食管癌中的表达研究 MAGE-1、MAGE-3、NY-ESO-1抗原是公认的肿瘤特异性抗原，表达于多种肿瘤组织中。但关于它们在食管癌中的表达的报道很少，因此，我们对30例食管癌组织进行了RT-PCR检测，结果发现，食管癌组织高频率表达MAGE-1、MAGE-3、NY-ESO-1抗原基因，其阳性率分别为43.3％、50％、50％，而在癌旁正常组织均无表达。我们从RT-PCR扩增产物中克隆了MAGE-1、MAGE-3、NY-ESO-1基因，并进行了序列分析，证实了PCR结
李江伟[9]2005年在《食管癌癌前血清分子标志物的研究及应用》文中指出食管癌在我国居恶性肿瘤发病率和死因的第四位，其五年生存率仅为10％左右。食管癌在我国呈现地域性高发的分布特点，筛查和发现癌前病变病例对于降低食管癌发病率和死亡率具有重要意义。为了筛选分离能用于食管癌癌前病例大规模高危人群筛查血清分子标志物，我们采用改进的SEREX技术，筛选、分离和鉴定了食管癌癌前的相关抗原，并应用蛋白质芯片技术及这些抗原建立了能用于食管癌癌前病变大规模高危人群筛查的血清检测方法。 第一部分 食管癌癌前病变相关抗原的筛选、分离及鉴定 采用食管癌癌前组织构建混合组织cDNA表达文库，原始文库库容达到1×10~6 pfu。使用多例癌前病变异体及食管癌异体混合血清筛选诱导IgM及IgG型自身抗体的食管癌癌前病变相关抗原，结果共获得了75个阳性抗原克隆，代表了30个不同的抗原基因，其中包括26个已知基因和4个功能未知基因。根据其生物学功能可以分为以下5类：1．细胞信号转导分子，2．转录及翻译调节相关基因，3．细胞增殖相关基因，4．蛋白质翻译加工和转运相关基因，5．功能未知的基因。采用SADA法对这30个抗原在食管癌前病变、食管癌及正常人血清中的自身抗体进行检测发现，共有29个抗原在异体食管癌和癌前病变血清中诱导产生了相应的IgM或IgG自身抗体，其中有25个抗原在癌前病变血清中检测到了相应的IgM型自身抗体，阳性率在3％-97％之
姚毅冰[10]2012年在《肺癌早诊蛋白质谱的筛查鉴定及SWI/SNF染色质重组复合物失调研究》文中研究说明目的:鉴定出一组可能会作为非小细胞肺癌(NSCLC)早期诊断生物标志物的肿瘤相关自身抗体。背景:肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)的和非小细胞肺癌,后者约占所有肺癌类型的80%。肺癌是全球癌症相关死亡的首要病因,因为大多数肺癌在诊断时已经出现晚期转移。最近的研究表明,肺癌患者的外周血中存在肿瘤相关的特异性抗原的自身抗体,可用来作为一种肺癌早期检测的生物标志物。材料与方法:我们用20例非小细胞肺癌组织标本(Ⅰ至IV期)构建了一个噬菌体展示文库。然后用肺癌患者和正常健康对照血清对这个文库进行生物淘洗富集和血清免疫学分析。噬菌体表达肿瘤相关蛋白的初步挑选是建立在患者与正常健康对照组患者的血清抗体的亲和力差别的基础上。噬菌体表达蛋白的基因序列确认后,从非小细胞肺癌细胞株和组织标本的基因芯片中可以查找那些读码框内表达蛋白对应的基因表达水平。表达上调的基因编码的噬菌体表达蛋白被选定用于酶联免疫吸附测定(ELISA)。我们进一步用40例非小细胞肺癌患者和36例健康对照组血清来检测这些肿瘤相关自身抗体的有效性。逻辑回归模型(Logistic regression models)和弃一交叉验证法(Leave-one-out cross validation)被用来评估单一和联合标志物预测肺癌能力,而后一种统计方法也用于分析这些标志物与疾病分期的关系。结果:1、初步挑选了 148个肿瘤相关的噬菌体表达克隆,其中35个是单一的读码框内表达的噬菌体蛋白。2、经过基因芯片分析后,有4个蛋白质被选定用于进一步研究。3、Affymetrix基因芯片数据库表明,这4个噬菌体表达蛋白在非小细胞肺癌细胞株中的mRNA转录水平均高于正常的人支气管上皮细胞株(HBECs)(P<0.05)。4、Illumina基因芯片数据库显示,编号96-12和BT9-3的蛋白在非小细胞肺癌细胞株和83例非小细胞肺癌组织样本中的基因表达水平均显着高于正常的人支气管上皮细胞株/小支气管上皮细胞株(HSAECs)和83例配对良性肺组织(P<0.05)。5、逻辑回归分析这4个标志物联合预测非小细胞肺癌的灵敏性达47.5%,特异性达97.3%,而弃一交叉验证法检验得到66.7%的敏感性和60.0%特异性。6、受试者工作特征曲线分析和弃一交叉验证法均表明,4种抗体联合检测比任何单一抗体标志物能产生更好的预测准确度。弃一交叉验证还表明,4个联合标志物对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期非小细胞肺癌诊断的准确性分别达到63.6%,62.5%,82.4%和 50%。结论:(1)本研究证明了肺癌患者血清中自身抗体的存在;(2)成功筛选鉴定出4个可能与早期肿瘤产生的特异性自身抗体有关的肺癌相关蛋白,并且这组肿瘤相关的自身抗体可能会作为非小细胞肺癌(NSCLC)早期诊断的生物标志物。目的:研究肺癌中SWI/SNF染色质重组复合物异常调节的现象和机制,两个ATP酶催化蛋白BRG1(SMARCA4)和BRM(SMARCA2),以及辅助蛋白BAF250a(ARID1A)是此项研究的重点。背景:每个哺乳动物细胞中的DNA被压缩成染色质时,体积缩小约5000倍,而在压缩状态的DNA是无法进行转录的。调控DNA压缩的叁个机制中包括ATP依赖的染色质重组复合物SWI/SNF,它是由20个基因组编码的约12个蛋白质亚基组成,其中有些蛋白亚基可以互相替代。有超过280种可能的亚基排列影响转录,染色质的结合和重组,组织和基因特异性。有些亚基基因具有抑癌基因的功能,包括ATP酶催化蛋白BRG1(SMARCA4)和BRM(SMARCA2),以及辅助蛋白BAF250a(ARID1A)。已有研究发现在包括肺癌的多种癌症中发现ATP酶催化蛋白失活,在卵巢癌中也发现BAF250a(ARID1A)频繁突变和蛋白缺失。材料与方法:(1)来自吸烟者与非吸烟者的101例肺癌细胞株和83例非小细胞肺癌及配对良性肺组织样本用于此项研究。(2)应用NextGen测序和Sanger测序技术用于对肺癌细胞株DNA的SWI/SNF染色质重组复合物基因进行测序。(3)应用Western Blot技术检测肺癌细胞株核蛋白提取物中部分SWI/SNF染色质重组复合物的蛋白表达水平。(4)应用化学诱导甲基化用于检测BRM蛋白缺失的细胞株。(5)应用基因芯片用于检测肺癌细胞株和组织样本中全基因组基因的表达水平。(6)应用单核苷酸多态性芯片分析用于检测肺癌细胞株和组织样本中全基因组基因的拷贝数变化。(7)应用免疫组化芯片染色用于对肺癌组织中BRG1和BAF250a的表达进行分析。结果:1、NextGen测序和Sanger测序证实SMARCA4和SMARCA2的突变率分别为28%(主要是纯合子缺失突变)和0%,ARID1A的突变率为11%(主要是杂合子点突变)。2、Western Blot检测证实BRG1和BRM蛋白表达缺失率分别为32.5%和25%,BAF250a的蛋白表达缺失率为23%,且这3个蛋白中至少有1个在41%的肺癌细胞株缺失,两个或两个以上蛋白缺失的细胞株比例为16%。3、基因芯片和免疫组化芯片的综合分析表明这3个基因在肺癌细胞株和组织中的表达水平普遍降低。4、单核苷酸多态性芯片分析DNA的拷贝数,表明组成SWI/SNF染色质重组复合物的多个基因有等位基因缺失。5、甲基化研究证实有些SWI/SNF染色质重组复合物异常调节与表观遗传有关。结论:(1)肺癌中存在SWI/SNF染色质重组复合物异常调节的现象,而且这种现象与多种机制有关,包括缺失,突变,表观遗传,转录和翻译控制等。(2)SWI/SNF染色质重组复合物异常调节可能为肺癌治疗提供新的靶点。
参考文献：
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[8]. 食管癌特异及相关肿瘤抗原的研究[D]. 彭良平. 中国协和医科大学. 2001
[9]. 食管癌癌前血清分子标志物的研究及应用[D]. 李江伟. 中国协和医科大学. 2005
[10]. 肺癌早诊蛋白质谱的筛查鉴定及SWI/SNF染色质重组复合物失调研究[D]. 姚毅冰. 天津医科大学. 2012
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