（1.大连市第六人民医院 辽宁大连 116031；2.遵义医学院 贵州遵义 534100；3.大连大学 辽宁大连 1160012）
摘要：目的 探讨肝硬化腹水并发自发性腹膜炎与单核细胞趋化蛋白-1基因启动子（A-2518G）基因多态性的相关关系。方法 收集2014年3月至2018年6月于大连市第六人民医院住院的肝硬化腹水患者共100例，其中肝硬化腹水并发自发性腹膜炎组50例，肝硬化腹水无自发性腹膜炎50例，同期选择就诊于该院30例门诊健康体检者作为健康对照组。收集所有临床资料，检测MCP-1启动子（A-2518G）基因多态性及外周血血清和腹水中单核细胞趋化蛋白-1的水平。结果 肝硬化腹水并发SBP组血清MCP-1、腹水MCP-1高于肝硬化腹水无SBP组，肝硬化腹水并发SBP组AG基因型频率显著高于肝硬化腹水无SBP组、健康对照组（P<0.05），肝硬化腹水无SBP组GG基因型频率显著高于肝硬化腹水并发SBP组、健康对照组（P<0.05），肝硬化腹水并发SBP组、肝硬化腹水无SBP组G等位基因频率显著高于健康对照组（P<0.05）；同时肝硬化无SBP组G等位基因频率高于肝硬化腹水SBP组（P<0.05），肝硬化腹水并发SBP组A等位基因频率高于肝硬化腹水无SBP组（P<0.05）。通过ROC曲线进行分析，血清MCP-1水平、腹水MCP-1ROC曲线下面积分别为0..923（95%CI0.864-0.981）、.931（95%CI0.930-0.999），对诊断肝硬化腹水并发SBP有较高的准确性。结论 MCP-1启动子（A-2518G）基因多态性可能通过影响MCP-1的表达参与肝硬化腹水并发SBP的发生发展。MCP-1基因SNP有望成为判断肝硬化腹水是否并发SBP的前瞻指标，.血清、腹水MCP-1浓度与肝硬化SBP相关，可以作为诊断肝硬化SBP的辅助指标。
关键词：肝硬化；自发性腹膜炎；单核细胞趋化蛋白-1；基因多态性
本课题通过对我国汉族人群肝硬化SBP患者与MCP-1启动子（A-2518G）位点的基因多态性的研究，为肝硬化腹水患者SBP的发病机制提供了更有力的理论依据，现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1一般资料：收集2014年3月至2018年6月于大连市第六人民医院住院的肝硬化腹水患者共100例，其中肝硬化腹水并发自发性腹膜炎组50例（SBP组，男性37例，女性13例）；平均年龄55.07±9.45岁，肝硬化腹水无自发性腹膜炎50例肝硬化腹水无SBP组（non-SBP组，500例（男性35例，女性15例），平均年龄56.13±6.86岁。纳入标准：①肝硬化：有肝功能减退和门静脉高压的临床表现；肝功能实验有Alb下降、胆红素升高及PT延长等指标提示肝功能失代偿；影像学检查提示肝硬化以及内镜发现食管胃底静脉曲张。②腹水：影像学检查提示腹水。3.SBP：临床有发热、腹痛、腹部压痛及反跳痛等腹膜剌激症状；腹水细菌培养阳性，腹水PMN计数>250×106/L；当腹水细菌培养阴性，腹水细胞计数>500×106/L，且以中性粒细胞为主。选择就诊于该院30例门诊健康体检者作为健康对照组（其中男性15例，女性15例），平均年龄36.18±5.78岁。
1.2材料与方法 所有纳入患者及健康体检者均空腹12h抽取外周静脉血，其中15ml静脉血经离心后取上层血清于EP试管中，加盖塞紧，保存在-70℃冰箱中，避免反复冻融用于基因DNA提取及MCP-1检测，其余按相应要求送检血常规、血生化、血凝、电解质、PCT等项目并记录。同时采集患者治疗前腹水，所有患者均进行腹水穿刺检查腹水常规、一般菌及厌氧菌培养。采用双抗体夹心ELISA法检测血清及腹水中MCP-1滴度，MCP-1酶联免疫吸附试验试剂盒购于美国BIM公司，先将所需冻存血样、腹水解冻，严格按ELISA试剂盒所附说明书操作。MCP-1基因多态性的检测：①参照操作说明书提取基因组DNA，提取得到的全血基因组DNA通过测定吸光度定量。②引物合成 引物自行设计由大连宝生物工程有限公司合成。引物自行设计由大连宝生物工程有限公司合成。MCP-1上游引物：5′-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3′；
MCP-1下游引物：5′-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3′。③PCR扩增反应。限制性内切酶酶切PCR产物 应用限制性内切酶PvuⅡ对PCR产物进行酶切，酶切产物电泳获得3种基因型：AA基因型，仅见930bp片段；GG基因型，可见708bp、222bp两个片段；AG基因型，可见930bp、708bp、222bp3个片段。同时收集临床指标：年龄、性别、血清白蛋白（ALB）、ALT、AST、血清总胆红素（TB）、凝血酶原时间（PT）、肝功能Child-Pugh分级、降钙素原（PCT）、血清钠水平。
2 统计学处理
用哈迪温伯格平衡定律（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验确认研究样本的群体代表性。基因型和等位基因频率采用直接计数法计算，两组间基因型和等位基因的不同分布、年龄、肝功能Child-Pugh分级采用χ2检验分析。计量数据用均数±标准差（）表示t检验。评价血清、腹水MCP-1水平诊断价值采用ROC曲线，通过分析其AUC来判定相应的诊断价值，采用SPSS22.0统计学软件进行统计分析，P＜0.05差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 SBP组与无SBP组一般临床资料的比较：两组患者资料显示，两组间年龄、性别、ALT、AST、PT、Alb）、血钠差异无统计学意义（P>0.05）；肝硬化腹水并发SBP组白蛋白（Albumin，低于肝硬化腹水无SBP组（P<0.05）；肝硬化腹水并发SBP组WBC、血常规中性粒细胞比例、PCT、血清MCP-1、腹水PMN、腹水MCP-1高于肝硬化腹水无SBP组差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
3.2 MCP-1 A-2518G 基因PCR扩增产物电泳结果观察：PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳，以1000bp Marker为对照标记，目标PCR扩增片段为930bp，PCR产物量及纯度较高。
3.3限制性内切酶（PvuⅡ）酶切MCP-1启动子（A-2518G）基因PCR产物电泳结果
对三组基因型分布进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，P值均大于0.05，符合遗传平衡定律，具有群体代表性。三组的基因型分布结果如表2所示，肝硬化SBP组与健康对照组进行比较，肝硬化SBP组的AG基因型频数要比健康对照组明显升高，即健康对照组12例（40%）与肝硬化SBP组30例（75%），P<0.05。将健康对照组与肝硬化无SBP组进行比较，发现在肝硬化无SBP组的GG基因型的频数要比健康对照组明显升高，即健康对照组3例（10%）与肝硬化无SBP组26例（65%）；P<0.05。当我们对肝硬化SBP组与肝硬化无SBP组进行比较，发现肝硬化SBP组的AG基因型频数要比肝硬化无SBP组明显升高，即肝硬化SBP组30例（75%）与肝硬化无SBP组8例（20%），P<0.05；还发现肝硬化无SBP组的GG基因型频数要比肝硬化SBP组明显升高，即肝硬化SBP组6例（15%）与肝硬化无SBP组26例（65%），P<0.05。随后，我们又对肝硬化SBP组、肝硬化无SBP组的等位基因分布分别与健康对照组进行比较，发现肝硬化SBP组、肝硬化无SBP组的G等位基因频数要比健康对照组显著升高，即肝硬化SBP组42个（52.5%）与健康对照组18个（30%），P<0.05、肝硬化无SBP组58个（72.5%）与健康对照组18个（30%），P<0.05，将肝硬化SBP组比肝硬化无SBP组进行等位基因分布比较发现，肝硬化SBP组的A等位基因的频率要比肝硬化无SBP组的A等位基因的频率要高，即肝硬化SBP组的A等位基因38个（47.5%）与肝硬化无SBP组的A等位基因22个（27.5%）P<0.05，同时肝硬化无SBP组的G等位基因的频率要比肝硬化SBP组要高，即肝硬化无SBP组的G等位基因58个（72.5%）与肝硬化SBP组的G等位基因42个（52.5%），P<0.05，这些数据均具有统计学意义。在三组中的基因型与等位基因频数分布图如图1、表1所示。
图1 限制性内切酶PvuⅡ酶切PCR产物电泳
注：M：DNA分子Marker，1、5是AA基因型，2、4、7是GG基因型，3、6是AG基因型。
表2 三组MCP-1启动子（A-2518G）位点基因基因多态性分布
注：与健康对照组比较*P＜0.01；肝硬化腹水并发SBP组与肝硬化腹水无SBP组比较，?P＜0.01
3.4肝硬化SBP与血清及腹水MCP-1水平的关系：
通过受试者工作特征曲线进行分析，血清MCP-1水平、腹水MCP-1ROC曲线下面积分别为0.923（95%CI为0.864-0.981）、0.964（95%CI为0.930-0.999），对诊断肝硬化腹水SBP有较高的准确性。通过约-登指数分析，用于判断肝硬化腹水并发SBP的血清MCP-1浓度最佳值是272.34pg/ml，敏感度和特异度分别为90%、85%；腹水MCP-1浓度最佳值为121.18ng/ml，敏感度和特异度分别为90％、92.5％。血清、腹水MCP-1对诊断SBP具有较高的诊断价值，两者敏感度相同，腹水MCP-1水平对于早期诊断SBP的特异性较血清高。ROC曲线见图3，诊断各参数见表3：
4讨论
SBP易感因素中固有免疫功能紊乱有重要意义，其中MCP-1在固有免疫的炎症细胞活化、趋化、病原菌的清除方面有重要的功能。MCP-1/CCL2是可以促进单核细胞、巨噬细胞浸润和移位关键的一员。研究表明在MCP-1的SNP基因调控区（A-2518G）发现此基因型与一些疾病的易感性相关[1]。一项研究证实MCP-1的SNP（A-2518G）基因型显著增加了冠状动脉疾病患病率[2]。MCP-1是单核细胞和巨噬细胞的趋化因子同时也可以刺激单核细胞和巨噬细胞的活化及增殖，通过体外实验研究证实携带MCP-1的SNP（A-2518G）A等位基因个体比携带G等位基因的机体分泌更少MCP-1，因此携带A等位基因个体的单核细胞和巨噬细胞的趋化及单核细胞和巨噬细胞的活化及增殖功能相对减低[8]。推测携带A等位基因的肝硬化腹水患者在感染病原菌后，单核细胞和巨噬细胞的活化及增殖功能相对减低同时趋化迁移到腹腔腹水减弱，因此是影响乙肝肝硬化腹水发生SBP的机制之一。在本课题中，通过对病例组、对照组宿主MCP-1目的基因片段PCR扩增、限制性内切酶酶切电泳形式探究基因型与肝硬化腹水SBP易感性的关系。MCP-1（A2518G）基因型的研究中，发现SBP组基因型AG显著高于正常对照组，肝硬化并SBP组与非SBP组相比较，AG基因型及A等位基因SBP组明显高于非SBP组，这说明AG基因型及A等位基因可能是乙肝肝硬化腹水患者发生SBP的危险因素。Flores-Villanueva等学者研究MCP-1的SNP与肺的结核病之间的关系，发现AG和GG基因携带者结核病的发生率要比纯合子AA的发生率高2.3-5.4倍，提示MCP-1（A2518G）与细菌易感间的关系[3，4]。国外学者证实携带MCP-1的SNP（A-2518G）A等位基因个体比携带G等位基因的机体分泌更少MCP-1，分析本实验携带AG基因型及A等位基因的肝硬化腹水患者在感染病原菌后，机体单核细胞和巨噬细胞的活化及增殖功能相对减低同时趋化迁移到腹腔减弱，因此是影响乙肝肝硬化腹水发生SBP的机制之一，国外学者报道MCP-1（A-2518G）SNP的AA基因型及A等位基因是酒精性及丙肝肝硬化腹水并发SBP的高危因素的结论与本研究结果契合。本研究同时发现等位基因G在非SBP组明显高于SBP组。Abraham S等学者研究发现成人中MCP-1（A2518G）纯合子G等位基因获得HIV的风险降低50%[5，6]。这也支持携带G等位基因的机体分泌更多的MCP-1，因此携带G等位基因个体的单核细胞和巨噬细胞的趋化及单核细胞和巨噬细胞的活化及增殖功能相对较强，对病原体有更强的阻碍入侵、病原体的识别和清除功能。Cekin等人报道血清PCT水平可作为肝硬化患者SBP的辅助诊断指标，失代偿期肝硬化并发SBP时PCT水平明显高于中性粒细胞腹水培养阴性的患者，表明它可作为区分是否并发SBP的诊断标志物[7]。PCT可能是指导经验性抗感染治疗的临床辅助指标，对降低乙肝肝硬化腹水并发SBP的死亡率有一定价值，因此临床及时检测肝硬化腹水患者PCT水平对SBP诊断及早期临床干预有重要意义。陈媛飞等学者研究称PCT不仅可以作为诊断SBP的指标，也可以判断预后[8，9]。
综上所述，通过对汉族人群100例肝硬化腹水并发/不并发SBP及健康人群MCP-1基因SNP研究发现携带A等位基因、AG基因型个体患肝硬化腹水并发SBP的风险显著增加，MCP-1启动子（A2518-G）基因多态性可能引起MCP-1的表达的变化，在肝硬化腹水并发SBP发生中发挥重要作用对肝硬化腹水患者易感SBP判明预后与早期临床干预治疗都能提供较好的精准医学证据，同时病例组血清、腹水MCP-1PCT水平可以作为肝硬化腹水SBP发生发展的危险因素，可以作为预防肝硬化腹水SBP的临床评估指标，综合应用于临床将对减低患者肝硬化腹水SBP病死率以及改善预后有重要的意义。
参考文献
[1]Fenoglio C，Galimberti D，Lovati C，MCP-1 in Alzheimer's disease patients：A-2518G polymorphism and serum levels[J].Neurobiol Aging，2004，25（9）：1169-73.
[2]Rovin BH，Lu L，Saxena R.A novel polymorphism in the MCP-1 gene regulatory region that influences MCP-1 expression[J].Biochem Biophys Res Commun，1999，259：344-348.
[3]Sugimura K，Taylor KD，Lin YC，et al.A novel NOD2/CARD15 haplotype conferring risk for Crohn disease in Ashkenazi Jews[J].Am J Hum Genet，2003，72（3）：509-18.
[4]Feng WX，Flores-Villanueva PO，Mokrousov I，CCL2?2518（A/G）polymorphisms and tuberculosis susceptibility：a meta-analysis[J].Int J Tuberc Lung Dis，2012，16（2）：150-6.
[5]Abraham S，Sawaya BE，Safak M et al.Regulation of MCP-1 gene transcription by Smads and HIV-1 Tat in human glial cells[J].Virology，2003，309（2）：196-202.
[6]李强，刘跃进，李雯雯.乙型肝炎肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎的相关因素[J].山东大学学报，2008，46（10）：35-39.
[7]曾静.肝硬化自发性细菌性腹膜炎易患因素分析[D].北京：中国医学工程，2015：2-7.
[8]王黎黎，杨淑君，赵瑞红.影响乙型肝炎肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎患者预后的危险因素分析[J].中西医结合肝病杂志，2016（03）：15-19.
[9]陈媛飞，何浩然.降钙素原在肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎中的检测意义[J].当代医学，2012，18（17）.
项目基金：大连市卫计委资助项目，编号1611049
通信作者：王拱辰（1968.09-），男，主任医师，硕士生导师，医学博士
论文作者:王拱辰1＊,王贵云2,焦正红2,刘英娇2,刘威1,
论文发表刊物:《航空军医》2019年10期
论文发表时间:2019/10/25
标签：肝硬化论文; 腹水论文; 血清论文; 等位基因论文; 基因型论文; 基因论文; 对照组论文; 《航空军医》2019年10期论文;