杜涛[1]2001年在《转抗菌肽基因泡桐抗丛枝病的研究》文中认为泡桐丛枝病是素有泡桐癌症之称，制约着我国泡桐产业的发展，目前生产上尚无有效的防治措施。该病病原物为植原体，无细胞壁，仅具3层单位膜，针对此特点，武汉病毒所植病组将广谱抗菌的抗菌肽shiva—1基因转入泡桐，并进行了分子鉴定，确证抗菌肽基因整合到泡桐基因组上。在此基础上，本研究对转基因泡桐进行了以下工作。对转基因病泡桐组培苗进行了外源基因检测，Southern杂交结果表明外源基因已经插入泡桐基因组内，经PCR，扩增出一条250bp左右的带，与抗菌肽基因大小一致；点杂交结果表明以含有植原体的病泡桐为出发材料的转基因泡桐在组培传代过程中，体内仍然含有植原体。筛选出了转基因泡桐的生根培养基：1／2MS+0.5mg／1IBA+6g/l活性炭。该生根培养基生根率可达98％。对转基因泡桐的移栽方法进行了一些改进，移栽成活率可达80％，光照和湿度是影响移栽成活的两个重要因素。选择转基因泡桐3号、6号无性系病苗为材料，在温室内进行抗性鉴定，两个无性系在鉴定期内表现了良好的抗性，在鉴定末期，转抗菌肽基因泡桐的平均病级与对照相比低3级；鉴定后期与鉴定前期相比，转抗菌肽基因泡桐平均病级下降1.5级。其中3号无性系后期无外观症状，6号无性系中6-1仍有外观症状，但症状与前期相比减轻。点杂交结果也证明转抗菌肽基因泡桐体内的植原体含量下降，对照植原体含量高。转基因泡桐的丛枝症状是逐步消失，但在条件适宜的情况下，外观症状可以加重。以人工合成的抗菌肽为抗原，免疫BALB／C小鼠获得了间接ELISA效价为10~4的抗血清。利用改进的间接ELISA对转基因泡桐进行了抗菌肽基因的表达检测，部分无性系的抗菌肽表达量较高，部分无性系表达量低或者没有表达，检测不出抗菌肽的表达。转基因泡桐的抗丛枝病的能力与抗菌肽的表达相关。在温室内，部分转基因泡桐在2000年10月份有花蕾出现，经套袋自交，现已正常结实，而对照未出现此现象；转基因泡桐的株高与对照无显着差别；尚未观察到转基因泡桐有其他的变异生物学性状。以上结果表明抗菌肽基因已经稳定的整合到泡桐基因组内，部分获得表达能够增强泡桐对丛枝病的抗性。这是利用基因工程手段防治植原体的首例，为防治泡桐丛枝病提供了一个新手段，也为其他难培养菌开辟了一条新途径。
林木兰, 杜涛, 王瑶, 胡勤学, 陈捷[2]2005年在《转抗菌肽基因泡桐的获得及遗传分析》文中研究表明泡桐丛枝病是泡桐的主要病害,素有泡桐癌症之称。长期以来人们采用农业、化学等手段防治该病,收效甚微;采用抗病品种是最为经济有效的防治手段,但由于缺乏高效稳定的抗性材料,常规抗病育种进展缓慢,从而将转基因抗丛枝病的任务提上日程。在本研究中我们将抗菌肽shiva-1基因导入泡桐来获得对丛枝病抗性提高的泡桐新种质,并且连续叁年对其遗传表达情况进行观察分析。
黄小毛[3]2004年在《转抗菌肽基因泡桐微生态安全研究》文中研究指明抗菌肽(Ceoropins)是昆虫分泌的一类广谱抗细菌多肽，由于抗菌肽的优越抗菌活性，同时也引起了植物基因工程研究者的广泛关注。目前抗菌肽基因已经被导入多种植物，并且大部分转抗菌肽基因植物都不同程度地提高了对相应病害的抗性。中国科学院武汉病毒研究所，利用基因工程技术将Shiv-1基因导入泡桐，获得了抗丛枝病的转基因泡桐植株。本论文主要进行了转基因泡桐的微生态安全研究，为转基因泡桐的田间释放提供实验依据，主要由方法的建立和应用方法进行系统研究两部分组成。 在方法学上的研究主要获得以下结果：首先建立了一种高效直接提取土壤DNA进行PCR方法。设计、比较了5种直接从土壤中提取DNA的方法，实验结果表明这5种方法都可以从土壤中提取到长度大于15Kb的DNA片段，但在不同方法间DNA的产量存在很大差异；粗提的土壤DNA经进一步提纯后均可用于PCR反应，利用细菌16S rRNA基因和抗菌肽Shiva-1基因的引物都得到了相应的目的产物。其中方法5提取DNA产量最高，无明显降解，且重复性好，是一种从小量土壤样品中直接提取DNA的理想方法。其次应用PCR-DGGE分析细菌间亲缘关系，以8个菌株为研究对象，通过分析细菌16S rRNA基因片段和rpoB基因片段的电泳图谱可以确定细菌间的亲缘关系，其结果与通过序列分析的相一致；这表明PCR-DGGE是一种非常有效而且简单的细菌间亲缘关系鉴定方法。 转抗菌肽基因泡桐的微生态安全研究主要从转抗菌肽基因泡桐对土壤中可培养细菌种群影响及转基因泡桐对根际细菌总种群影响等方面进行了研究。分离到转基因泡桐及对照泡桐根际及根围土壤中优势细菌种群，并对分离的细菌进行了鉴定；结果表明两者在细菌组成上都是以芽孢杆菌和假单胞杆菌为主，其中芽孢杆菌又以巨大芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌为主，从细菌种群组成上没有发现差异。另外，在一年的周期内对转基因泡桐与对照泡桐根际和根围土壤中可培养细菌的数量进行了比较，结果没有发现两者间存在显着差异。此外进行了转基因泡桐对苏云金芽孢杆菌Bacillus thringiensis和苜蓿中华根瘤菌Sinohizobium melilot影响的研究，结果表明：半年后，两种供试菌在在半年后两种泡桐植株的根际土壤中的数量均有大幅的减少，但是转基因植株和对照植株在减少的量上没有显着差异。以此同时，在一个周期内华中农业大学2004届硕士学位论文转抗菌肤基因泡桐的微生态安全研究分别提取武昌苗圃和许昌苗圃转基因泡桐与对照泡桐根际土壤中的细菌总DNA，分别PCR扩增165 rRNA基因与甲oB基因片段，然后进行DGGE;通过比较在不同时期内转基因泡桐与对照泡桐的电泳图中条带差异寻找转基因泡桐可能对细菌种群产生的影响。研究结果表明:无论是以165 rRNA基因还是rpoB基因为研究对象，转基因泡桐与对照泡桐的电泳图谱基本相同，说明转基因泡桐对根际细菌总种群没有影响。
参考文献：
[1]. 转抗菌肽基因泡桐抗丛枝病的研究[D]. 杜涛. 华中农业大学. 2001
[2]. 转抗菌肽基因泡桐的获得及遗传分析[C]. 林木兰, 杜涛, 王瑶, 胡勤学, 陈捷. 中国生物工程学会第四次会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集. 2005
[3]. 转抗菌肽基因泡桐微生态安全研究[D]. 黄小毛. 华中农业大学. 2004
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