郭长存[1]2001年在《利用减毒鼠伤寒沙门氏菌研制胃癌MG7-Ag模拟表位口服DNA疫苗》文中研究说明背景 我国胃癌死亡率居各类癌症之首，是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤。目前，胃癌常规疗法效果不佳，而且由于缺乏胃癌特异性抗原，尚未研制出一种有效的疫苗用于胃癌免疫治疗。胃癌MG_7-Ag是我所发现的较好的胃癌标志物，其抗原决定簇位于糖链上，属于碳水化合物抗原。我们应用噬菌体文库显示技术筛选得到了胃癌MG_7-Ag的模拟表位多肽，抗体竞争结合试验证实该多肽具有良好的模拟原始抗原的能力。模拟表位多肽的确定为研制胃癌特异性疫苗奠定了基础。DNA疫苗被称作第叁代疫苗，它可以诱导特异、高效、持久的免疫反应，而且制备简便。目前已有骨髓瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌等肿瘤DNA疫苗进入临床试验，结果表明可以诱导机体产生特异的抗肿瘤免疫反应，而且安全可靠。DNA疫苗的免疫途径有肌肉注射、皮内注射、皮下注射和基因枪皮肤轰击等。减毒鼠伤寒沙门氏菌是良好的口服疫苗载体，可以诱导体液和细胞免疫反应。最近的研究发现，携带外源基因真核质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服后可以将真核质粒特异地转入脾脏树突状细胞（DC）并被表达。由于DC细胞是职业抗原提呈细胞（APC），以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体构建口服DNA疫苗更有利于诱导机体产生免疫反应。动物试验证实以沙门氏菌为载体的口服DNA疫苗具有良好的抗菌、抗肿瘤保护能力。 为增强DNA疫苗的免疫效能，常用的策略有以下几种：①应用原形或质粒DNA形式的细胞因子佐剂（包括IL-1、IL-12、GM-CSF和IFN-γ等。②将抗原基因与载体蛋白基因融合（如KLH和HBcAg）。③研制 第四军医大学硕土学位论文多表位疫苗（即包含多个抗原表位基因的 DNA疫i）＠利用质粒的兔疫刺激序列如：CpG等。在兔疫应答中，CD4＋辅助性T细胞叮H）有重要作用，有效的激活 CD4＋TH细胞可以增强疫茵诱导的免疫反应。研究表明包括细胞毒性T细胞（CTL）和／或B细胞表位的DNA疫苗中加入TH表位可以增强疫苗的兔疫效能。这是由于：CTL和 TH细胞表位同时提呈至抗原提呈细胞表面可以使TH细胞在CTL细胞邻近发挥辅助作用，从而有效地激活 CTL细胞；TH细胞分泌细胞因子活化 CTL细胞和 B细胞；TH细胞上调APC细胞表面共刺激分子表达，提高APC提呈抗原和激活CTL的能力。现己证实同时包含肿瘤特异性的 CD4＋T细胞表位和 CTL表位（或B细胞表位）的DNA疫苗可以更有效的诱导机体的抗肿瘤免疫反应。1994年，lexander等在多聚丙氨酸骨架中导入 MHC 11分子结合锚定氨基酸，发明了一种通用性 TH表位，称为 PADRE爬an－DR bindingepitope卜PADRE可以与人类多数HLA－DR分子及部分小鼠＊类基因分子结合，在诱导 Th细胞反应的效能方面，PADRE比自然源性 Th表位高 1000倍，且可以诱导 Th和 ThZ型反应。将 PADRE与 CTL表位或 B细胞表位串联构建的多肽疫苗或小基因疫苗可以诱导高效的细胞或体液免疫，而且临床试验证实PADRE对人体安全、无毒、无副作用。由于目前胃癌特异性TH表位尚未确定，PADRE可以作为其替代物研制胃癌特异性DNA疫苗。 目的 以减毒鼠伤寒沙门氏菌为疫苗载体，构建重组胃癌MG7－Ag模拟表位的口服DNA疫苗，观察C57BL／6）小鼠口服免疫后诱导的体液和细胞免疫反应。 方法 将 Hind Ill酶切位点、MG，叭g模拟表位和 MRE编码序列的反向互补序列顺次设计于下游引物中，通过2次聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction PCR），将二种表位连接于一段无关的载体基因，Hind Ill酶切位点位于载体片段与表位基因之间。将目的基因插入 3 第四军医大学硕土学位论文pUCm1载体，酶切鉴定和序列测定证实后，利用pUCm1载体和pcDNA3二l什）载体共有的 Kpn和 ha酶切位点，将目的基因亚克隆入真核表达载体 pcDNA3二什）载体。利用目的基因和 pCDNA3．l什）载体上的Hind Ill酶切点，Hind Ill酶切除载体基因片段，得到胃癌MG卜Ag模拟表位和 PADRE融合基因的真核表达载体。携带绿色荧光蛋白真核质粒pcDNA3．l什）IGFP的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261体外感染小鼠腹腔灌洗巨噬细胞，流式细胞仪检测，验证菌株作为DNA疫苗载体将真核质粒转入 APC细胞的能力＊重组质粒 pCDNA3．1什卜MG7－Ag／PADRE转入减毒鼠伤寒沙门氏菌，构建口服DNA疫苗。用构建的DNA疫苗口服兔疫C57BL历J小鼠，每隔2周加强兔疫一次。以PBS和携带pcDNA3二什）空载体的减毒鼠伤寒沙门氏菌代替口服疫苗接种小鼠作为对照。观察小鼠对疫苗的耐受情况。口服接种6周后应用ELISA ＄检测小鼠血清中抗MG7－Ag抗体的滴度。第8周时取兔疫鼠的脾细胞，加入人工合成的to－xg模拟表位多肽，us－ma掺入检测小鼠脾淋巴细胞对抗原肽刺激的增殖反应，间接反映细胞免疫反应情况。初次免疫8 周后，用表达MG卜Ag的小鼠艾氏腹水瘤细胞进行肿瘤攻击实验，观察疫苗对小鼠的保护作用。 结果 经过2?
孟繁平[2]2002年在《利用减毒鼠伤寒沙门氏菌研制胃癌MG7-Ag模拟表位口服活菌疫苗》文中认为背景 我国胃癌死亡率居各类癌症之首，是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤。目前，胃癌常规疗法效果不佳，由于缺乏胃癌特异性抗原，尚未研制出一种有效的疫苗用于胃癌免疫治疗。胃癌MG7-Ag是我实验室发现的较好的胃癌标志物，其抗原决定簇位于糖链上，属于碳水化合物抗原。我们应用噬菌体文库显示技术筛选得到了胃癌MG7-Ag的模拟表位多肽，抗体竞争结合试验证实该多肽具有良好的模拟原始抗原的能力。模拟表位多肽的确定为研制胃癌特异性疫苗奠定了基础。减毒沙门氏菌口服免疫后，可形成自限性感染，获得相应粘膜的局部免疫、体液免疫和细胞免疫。此外，该类疫苗具有安全、高效、简便和经济等优点。将MG7-Ag基因与HBcAg基因重组后转化S.typhimurium，通过口服免疫诱导特异性的粘膜、体液免疫和细胞免疫，有可能成为胃癌免疫治疗的一种有效途径。本实验采用作为口服疫苗载体的具有致死性平衡系统的减毒鼠伤寒杆菌，建立了能表达异源MG7-Ag基因的转化菌株，可引起抗胃癌的免疫反应。 目的 以减毒鼠伤寒沙门氏菌为疫苗载体，构建基于胃癌MG7-Ag模拟表位的口服活菌疫苗，观察其口服免疫Balb／c小鼠后诱导的体液和细胞免疫反应。 方法将Nco Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点、MG7-Ag模拟表位和HBcAg编 第四军医大学硕士学位论文 码序列的反向互补序列顺次设计于上游引物中，通过聚合酶链式反应将2 种表位相连接。将目的基因插入pUCm1载体，酶切鉴定和序列测定证实 后，利用pUCm＊载体和pYA3341载体共有的Nco和Hind Ill酶切位点， 经酶切鉴定和序列测定证实后，亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌X4550互补o 的质粒pYA3341中，以此重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌X4550，构建日服 鼠伤寒杆菌疫苗。用构建的口服鼠伤寒杆菌疫苗口服免疫Balb／c ，J’鼠，每 隔Z周加强免疫一次。以P＊S和携带pYA3341空载体的减毒鼠伤寒沙门 氏菌代替日服疫苗接种小鼠作为对照。观察小鼠对疫苗的耐受情况。初次 口服接种5石周后应用ELISA法检测小鼠血清中抗MG7叭g抗体的滴度。 初次免疫后8周时，取免疫鼠的脾细胞，以’℃r释放法检测小鼠脾淋巴细 胞对靶细胞的杀伤效果，反映细胞免疫反应情况。初次免疫8周后，用表 达MG7－Ag的小鼠艾氏腹水瘤细胞进行肿瘤攻击实验，观察疫苗对小鼠的 保护作用。 结果 经过PCR扩增出约600hp大小的片段，与目的基因大小相符， 测序结果表明：PCR产物为载体片段、Nco和Hnd Ill酶切位点、MG7－Ag 模拟表位及HBCAg的融合片段c将目的基因亚克隆入pYA3341，基因后测 序证实得到胃癌MG7叭g模拟表位与HBCAg的融合基因片段。最终得到 含有目的基因片段的重组表达载体pYA3341。重组质粒在X4550中的表 达产物，经 Western blot表明，在相对分子质量（Mr哟在22 000处有 1条 可与抗MG7hab特异性结合的多肽表位。口服疫茵免疫小鼠后疫苗免疫t 组小鼠血清抗MG7－Ag抗体较PBS和空载体对照组显着增高。各组小鼠 脾淋巴细胞体外杀伤实验未见显着差异。小鼠艾氏腹水瘤的攻击实验显 示：疫苗免疫组中5只小鼠有1只未见肿瘤形成，而对照组小鼠则全部成 瘤。 结论 成功研制可表达胃癌MG7人g模拟表位减毒鼠伤寒杆菌疫苗， －5－ 第四军医大学硕士学位论文 为进一步研究其在胃癌免疫治疗中的作用奠定了基础。以胃癌MG7Ag 模拟表位为基础的曰服减毒鼠伤寒沙l”刁氏菌疫苗具有免疫原性，可以诱导 个鼠产生显着的体液免疫反应，虽然MG7叭g模拟表位多肽刺激小鼠脾细 胞的增殖实验各组未见差异，但肿瘤攻击实验表明胃癌MG7叭g模拟表位｝曰服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗可以保护部分小鼠免受肿瘤攻击，提示可能 存在细胞免疫反应。实验表明：利用模拟表位构建减毒鼠伤寒沙门氏菌疫 苗是可行的；减毒鼠伤寒沙门氏菌是一种良好的疫苗载体；以胃癌 uo人叭g模拟表位为基础构建的口服鼠伤寒杆菌疫苗可以诱导抗肿瘤免 疫反亡，并可能具有部分保护作用。
徐引弟[3]2006年在《猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用》文中研究表明猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一，现在在我国特别是农村散养户普遍存在，造成一定经济损失。动物生前感染沙门氏菌或其产品受到污染，可使人发生食物中毒，因此该病原在公共卫生上也具有重要意义。疫苗接种是控制猪霍乱的最适宜手段。猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株，虽具有较好的免疫原性，但具有一定的残余毒力，遗传背景不清，且存在毒力返强的风险。 粘膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的主要方向。沙门氏菌作为疫苗载体已受到医学与兽医学的广泛重视，其主要优点包括沙门氏菌可以经粘膜途径免疫(口服或鼻内)，操作方便，对接种对象刺激小。此外，沙门氏菌为胞内侵袭细菌，能有效呈递抗原，激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应，并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。但目前所构建的沙门氏菌载体多为鼠伤寒沙门氏菌。以猪霍乱沙门氏菌为载体的报道很少。而猪水肿病(Edema disease of swine，ED)是由某些血清型的E．coli引起的，主要发生在断乳后1—2周的仔猪，是危害断奶仔猪较严重的疾病之一。SLT—Ⅱv毒素是致水肿病的主要致病因子，由1个A亚基和5个B亚基共同组成的聚合体。A亚基为毒素的毒力部分，B亚单位决定毒素的特异性，也是毒素的主要免疫原性部分。 基于以上考虑，本研究旨在研制更加安全的猪霍乱沙门氏菌弱毒株，并将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体。以C500为亲本菌，在基因组上缺失编码cAMP受体蛋白的crp(cAMP receptor protein)基因，以降低C500毒力，消除毒力返强的风险。进一步缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶的asd(aspartate beta-semialdehyde)基因，构建asd平衡致死系统，用于高效表达外源基因，初步应用该载体表达了绿荧光蛋白基因(Green fluorescence protein，gfp)和致水肿大肠杆菌水肿毒素B亚基(Shiga-like toxin type Ⅱ variant B，SLT-ⅡvB)，并进行了小鼠免疫试验，为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗奠定基础。主要研究内容包括： 1．crp、asd基因的克隆与重组自杀性质粒的构建 参照GenBank中鼠伤寒沙门氏菌LT2株crp及asd序列，以C500基因组为模板扩增并克隆crp与asd基因。测序及序列比对分析证实，两基因与已发表的其它3株沙门氏菌crp、asd基因全序列高度同源。从C500基因组中扩增crp及asd上下游片断，连接到自杀性质粒pRE112上，分别构建了缺失320bp的crp基因缺失320bp，插入gfp的crp缺失，以及缺失1408bp的asd基因缺失1408bp，并携带蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp和pREasd。 2．接合转移与C500crp~-、C500crp~-／gfp~+、C500crp~-／asd~-、C500crp~-／gfp~+／asd~-、C500asd~-缺失株的筛选鉴定
赵红妮[4]2011年在《表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建及动物免疫试验》文中指出本研究目的旨在构建一种表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗,通过动物免疫试验对构建的疫苗进行评价。Cap蛋白是PCV2 ORF2基因编码的主要结构蛋白和免疫保护性蛋白,本研究选择截去N端41个氨基酸的核定位区的ORF2编码基因作为目的基因,利用减毒鼠伤寒沙门氏菌的平衡致死系统表达优化的ORF2基因,构建表达Cap蛋白的活载体疫苗,并对重组菌苗的生物学特性和免疫学特性进行评价。研究取得如下结果:1表达猪圆环病毒Cap蛋白的鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建合成特异性引物P1、P2,PCR扩增得到ORF2基因,将其插入经BamH I和Pst I双酶切的Asd+的组成型表达载体pYA3341中,构建重组表达载体pYA3341-ORF2;重组载体电转化入缺失天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(Δasd)、腺苷酸环化酶(Δcya)以及环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp)的减毒鼠伤寒沙门氏菌中间宿主菌X3730及终末宿主菌X4550中,获得重组活载体疫苗菌X4550(pYA3341-ORF2)。2重组活载体疫苗菌的生物学特性检测研究重组活载体疫菌苗X4550(pYA3341-ORF2)体外稳定特性、生长特性、口服安全性及在小鼠体内的定值分布情况。结果显示,Cap蛋白能在X4550中有高水平的表达,且重组菌能在体外稳定遗传、生长状态良好、口服安全无毒性及在机体中具有良好的定值分布特性。3重组活载体疫苗菌的免疫原性研究将重组活载体疫苗菌X4550(pYA3341-ORF2)口服免疫Balb/C小鼠作为免疫组,以口服重组菌X4550(pYA3341)的小鼠作为阴性对照组,以口服PBS的小鼠作为空白对照组。ELISA方法检测疫苗免疫组小鼠血清抗体效价达到1:1920;间接免疫荧光法检测疫苗免疫组小鼠血清中和抗体效价可达到1:19.2;MTT法检测免疫组小鼠淋巴细胞分裂指数可达到4.26;流式细胞术检测疫苗免疫组小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞数目分别约为29.9、7.52,CD4+/CD8+T细胞比值约为3.99。将重组活载体疫苗菌X4550(pYA3341-ORF2)免疫猪,ELISA法检测疫苗免疫猪血清抗体效价1:57.6;疫苗免疫组猪血清的中和抗体效价可达到1:11.2;疫苗免疫组淋巴细胞分裂指数可达到3.82。重组菌苗X4550(pYA3341-ORF2)能够稳定表达Cap蛋白,具有良好免疫原性,为该疫苗的进一步研制与临床应用提供参考依据。
参考文献：
[1]. 利用减毒鼠伤寒沙门氏菌研制胃癌MG7-Ag模拟表位口服DNA疫苗[D]. 郭长存. 第四军医大学. 2001
[2]. 利用减毒鼠伤寒沙门氏菌研制胃癌MG7-Ag模拟表位口服活菌疫苗[D]. 孟繁平. 第四军医大学. 2002
[3]. 猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用[D]. 徐引弟. 华中农业大学. 2006
[4]. 表达PCV2 Cap蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗的构建及动物免疫试验[D]. 赵红妮. 西北农林科技大学. 2011
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