王见杨[1]2000年在《家蚕病原性微孢子虫的核糖体RNA编码基因的研究及其二级结构的构建》文中进行了进一步梳理本文对本室收集保存的九种微孢子虫（MCs、MD、ME、MG、MHa、ML、N.b、MPa、MPr）的核糖体RNA的编码基因进行了研究，试图从基因水平上、分子水平上对它们的亲缘关系进行探讨。并首次对微孢子虫RNA的抽提进行了探讨，为进一步研究微孢子虫基因的差异表达等奠定了基础。 一、九种微孢子虫的核糖体小亚单位RNA（SSUrRNA）编码基因的研究 用碱发芽法、DNA-zol法、CTAB法共三种方法抽提了微孢子虫的基因组DNA。三种方法均可用来大量抽提微孢子虫基因组DNA。抽提基因组DNA的质量及数量与孢子新鲜度、孢子发芽率、破壁率、孢子浓度等有密切关系。 用PCR方法扩增、克隆、测序了九种微孢子虫核糖体小亚单位RNA（SSUrRNA）基因的95％以上的序列。并用生物分析软件DNA-STAR、Clustalx对它们的序列同源性进行了分析，构建了系统进化发育树。为这九种微孢子虫的亲缘关系的确定提供了基因水平上的证据。 用生物软件构建了所测得的九种微孢子虫SSUrRNA基因序列的二级结构。通过比较它们二级结构上茎的异同进一步为它们亲缘关系的确定提供了分子水平上的证据。 九种微孢子虫SSUrRNA基因的序列同源性、系统进化发育树及二级结构均表明它们同属于微孢子虫属（Nosema），是同属不同种。 二、家蚕微孢子虫核糖体小亚单位RNA（SSUrRNA）全基因的研究 用SSP-PCR的方法扩增、克隆、测序了九种微孢子虫核糖体小亚单位RNA（SSUrRNA）基因3’-端的序列。经软件分析发现，其3’-端与蜜蜂微孢子虫（Nosema.apis）SSUrRNA基因具高度同源性，两者有近140bp长的序列完全相同。证明所扩增的序列是该基因的3’-端。测得家蚕微孢子虫SSUrRNA全基因为1233bp，与文献报道相符。 三、菜粉蝶微孢子虫核糖体RNA基因的研究 用PCR方法扩增、克隆、测序了菜粉蝶微孢子虫SSUrRNA基因的3’-端，rRNA基因内间隔区及LSUrRNA基因的580R区。与Genbank中对应序列比较后，鉴 中文摘要 定出SSUrRNA基因的3’－端，其全基因长为1244hp。基因内间隔区为41 hp，AT 含量相对较高。LSU洲A基因580R区为470hp，经软件分析发现，该序列与。． NO SemQ·。lge。e具高度同源性。 四、微抱子虫SSUrRNA基因拷贝数的研究 以己克隆的家蚕微抱子虫（镇江株）的SSUrRNA基因为模板，用随机引物合 成法标记的探针在与九种微抱子虫及家蚕基因组DNA的六种酶切图谱的Southern 杂交的图谱上，显示了微抱子虫的 SSUrRNA基因拷贝数至少在 15个以上。t h、微抱子虫RNA的抽提 本文首次报道了抽提微抱子虫RNA的详细方法。经比较发现，用异硫氰酸肌 法所抽提的NA的质量和数量均较好。抽提的RNA的质量及数量与抱子的新 鲜度、泡子发芽率、抱于浓度等同样有密切关系。
刘含登[2]2011年在《家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）基因组学研究》文中研究说明微孢子虫(Microsporidia)是一类具有70S型核糖体的、专性细胞内寄生的单细胞真核生物,广泛寄生于昆虫、鱼、兔、产毛动物、啮齿类及灵长类。第一个被人类认识微孢子虫种是家蚕微孢子虫,它由Nageli在1857年于家蚕中发现并命名,此后陆续有很多新的种类被分离鉴定,迄今已有超过160个属1300多种。1959年在免疫缺陷型病人体内发现了微孢子虫,后来发现有8属14个种可以感染人类,特别是免疫缺陷型病人。自从发现微孢子虫可以感染人类后,科学界开始对微孢子虫高度关注。过去微孢子虫曾被认为是没有线粒体的原始的真核生物,但近年来的研究推翻了这种观点,NCBI中将微孢子虫归属于真菌类,其呈现出较为原始特征的原因被认为是经历了简化进化的过程；同时,有学者通过实验证明微孢子虫具有简化的线粒体细胞器——“线体”。家蚕微孢子虫是微孢子虫属的典型种,由它引发的家蚕微粒子病是蚕业生产上的毁灭性病害,而对微粒子病的防控目前还没有有效的方法,这也是蚕学界当前研究的重点和难点。1968年,Ishihara和Hayashi通过蔗糖密度梯度超速离心发现微孢子虫核糖体具有原核特征,其具有原核生物特有的70S核糖体由50S和30S两个亚基组成。微孢子虫作为一种真核生物,却具有原核型特征的核糖体,这一现象产生的原因还不清楚。1994年,日本学者认为家蚕微孢子虫只有一个rDNA拷贝,这与其它微孢子虫有很大差异。近年来,我们通过全基因组霰弹法对家蚕微孢子虫CQl株进行全基因组测序,有机会对其核糖体蛋白及rDNA进行全景式的分析,以期回答微孢子虫核糖体的相关问题。本研究主要通过核糖体蛋白基因与rDNA序列两方面进行家蚕微孢子虫核糖体的全面分析,首先对基因组中的核糖体蛋白基因进行鉴定及其在基因组中的分布情况和不同微孢子虫间的基因组排布进行分析；对rDNA的研究主要集中在rDNA在基因组中的分布情况和rDNA在染色体上的定位分析,不同地区来源的家蚕微孢子虫的rDNA序列的多态性,以及家蚕微孢子虫被MITEs元件插入后其活性的研究等方面进行开展；最后,利用同多个物种间序列与结构分析的结果进行了家蚕微孢子虫70S核糖体成因的初步探讨。1.家蚕微孢子虫核糖体蛋白基因的鉴定与分析通过全基因组扫描与同源序列比对,我们在家蚕微孢子虫基因组中共鉴定出130条核糖体蛋白序列,它们对应于73个核糖体蛋白基因,其中大亚基蛋白43个,小亚基蛋白30个；其中有三个核糖体蛋白基因含有较短的内含子,通过其对应的EST序列得到了证明,并且这些内含子的结构同其它微孢子虫中核糖体蛋白内含子的结构一致。对核糖体蛋白上游500bp的序列进行了启动子和调控元件预测,发现在这些序列中存在保守的"AAATTT-like signal-CCC-like (or GGG-like) motif-transcription start site"的典型排布;SP1、GATA-1等调控基序在核糖体蛋白基因上游是广泛存在的。在所有的家蚕微孢子虫核糖体蛋白中,有56种(约占76.7%)存在于多种微孢子虫序列的共线性区段内,表明这些基因的排布在微孢子虫内是比较保守的。通过核糖体蛋白基因系统进化树的分析,我们发现结果同用rDNA序列构建的进化树一样——微孢子虫仍是位于真核生物的基部。2.家蚕微孢子虫核糖体DNA的序列多态性及rDNA在染色体上的定位利用家蚕微孢子虫基因组数据,通过生物信息学分析软件RepeatMasker软件对全基因组进行扫描,在家蚕微孢子虫基因组中共检测到42个LSU rDNA、40个SSU rDNA和37个5S rDNA单元。利用Southern杂交技术,分别以rDNA片段的三个不同部分制备探针进行了杂交,获得了较为一致的结果：三个片段均定位于家蚕微孢子虫的所有染色体上,因此我们得出家蚕微孢子虫的rDNA序列在家蚕微孢子虫的所有染色体上均存在。同时,我们对从不同地方收集到的家蚕微孢子虫株系,对rDNA区的序列多态性进行研究。结果表明,广东、广西、重庆与云南等地区家蚕微孢子虫种内存在较为明显的遗传分化,产生这一结果的原因可能与传代过程中的遗传变异有关,也可能与家蚕微孢子虫寄生宿主的组织特异性有关。同时,四川地区家蚕微孢子虫单独聚为一枝,说明家蚕微孢子虫也存在一定程度的地理种群差异；而重庆、广东、广西与云南等地区家蚕微孢子虫的遗传混杂可能是不同地区微孢子虫相互交叉传播引起的。家蚕微孢子虫种内rDNA序列多态性表明家蚕微孢子虫具有多样的和复杂的遗传背景,这可能是其在进化过程中形成的一种适应性,以抵御不良的环境因素,同时对维持家蚕微孢子虫种群的生存和繁殖具有重要的生物学意义。曾有报道说明微孢子虫的基因序列比真菌基因序列变异速率快,因此家蚕微孢子虫ITS和IGS区序列差异较大,是容易理解的。本研究的结果表明家蚕微孢子虫rDNA区在种内存在着遗传多样性,并且具有一定的地域性差异,这种遗传多样性可能源于三种因素：微孢子虫传代过程中的遗传变异、微孢子虫寄生的宿主组织特异性、以及对不同地理环境的适应性。3.家蚕微孢子虫中含MITEs插入的rDNA序列的活性研究我们鉴定了家蚕微孢子虫的四个插入rDNA序列中的MITEs家族,通过分析发现这些插入元件具有典型的MITEs元件的共有特征：高AT含量和末端序列重复(TSD),但这些MITEs插入序列的来源尚不清楚。根据家蚕微孢子虫核糖体RNA中核苷酸的排序和含有MITEs插入的核糖体RNA的二级结构分析,我们发现SSUME1位于变异区V2, SSUME2位于变异区V4,LSUMEl位于序列扩增区D9区。在本研究中,我们对rDNA中的四种MITEs插入(LSUME1, ITSME1, SSUME1与SSUME2)均进行了相关研究,利用Northern杂交技术对转录后的RNA进行了检测,结果发现只有三种插入存在杂交信号,而ITSME1没有检测到杂交信号。这可能是ITS rRNA在转录后很快就被剪切和降解掉了。非常有趣的是,利用点杂交的结果进一步表明这些含有MITEs插入序列的rDNA能够转录,并且能够组装到核糖体内部。在家蚕微孢子虫rDNA序列中鉴定的MITEs插入情况中,核糖体RNA的核苷酸排列顺序与二级结构分析表明这些插入位于高变异区,这些位置可能对核糖体的功能不会产生重要的影响,这可能也是这种MITEs插入存在并能转录和组装的重要原因。4.家蚕微孢子虫70S核糖体形成机制初探从家蚕微孢子虫核糖体RNA与核糖体蛋白两个方面进行分析,通过rDNA序列长度在不同物种间的比较发现微孢子虫rDNA序列长度是最短的,进一步的二级结构比较发现家蚕微孢子虫的rRNA在茎环结构上也存在一定程度的减少。通过对核糖体蛋白不同物种间的同源序列比较分析发现：家蚕微孢子虫核糖体蛋白序列长度大多介于原核生物与真核生物之间；通过核糖体蛋白二级结构的比较分析,我们发现家蚕微孢子虫核糖体蛋白中α螺旋和β-折叠的数目较对应的典型的真核生物的略少。根据对核糖体相关基因的序列与结构分析,可以得出家蚕微孢子虫核糖体在其序列和结构上都存在不同程度的减缩,而这种减缩则形成了这种真核生物中存在70S核糖体的特殊情况。
马露芸[3]2008年在《裳卷蛾变形孢虫（Vairimorpha ceraces sp.nov.）SSUrRNA核心序列的克隆与分析》文中研究说明微孢子虫是一类广泛分布的、专营细胞内寄生生活的、无线粒体的单细胞真核生物,能寄生无脊椎动物和脊椎动物,是经济昆虫、鱼类、兔类、皮毛动物、啮齿类及灵长类动物的致命病原。微孢子虫种类繁多,已发现的微孢子虫种类超过1300种,分别划入150多个属。微孢子虫一般被认为是与生物进化有关的最原始的单细胞真核生物,其SSUrRNA的一级结构的保守性表现在所有种系中,比编码蛋白质的基因保守100倍以上,且碱基长度适中,碱基变化的积累以一种类似计时器的方式进行,因此,SSUrRNA在生物进化和系统演化研究中是一个良好的分子指标,已被广泛应用于生物的进化分析和分类。将分子生物学等方面的信息与以形态、生活史等为主的微孢子虫生物学分类系统有机地结合,有助于构建更有价值的微孢子虫分类系统。裳卷蛾变形孢虫分离于野外昆虫龙眼裳卷蛾Cerace stipatana Walker,可感染家蚕,最初通过对其形态大小、感染性、超微结构以及血清学反应的初步研究后将其定为Nosema属。后来,研究发现该微孢子虫在孢子生殖的过程中既有二孢子形态又有八孢子形态,而且八孢子形态为数众多,根据Sprague提出的微孢子虫生物学分类系统,将它归于布雷孢虫科(Burenellidae)、变形孢虫属(Vairimorpha)。进一步的研究和查新后,确定该微孢子虫为新种,根据其寄主名称将其命名为裳卷蛾变形孢虫Vairimorpha ceraces sp.nov.。目前对裳卷蛾变形孢虫的形态学、超微结构、病理学、生物学特征进行了研究,本实验通过对其SSUrRNA核心保守序列的克隆和系统进化分析,希望能为它的分类和进化提供分子生物学方面的依据。1裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp.nov.)SSUrRNA核心序列的克隆(1)采用常规碳酸钠法、TEK法和改良CTAB法制备DNA,三种方法的效果都比较理想。但是在实验中通过比较发现,孢子浓度越高、孢子越新鲜,抽提处理过程中时间相对较短,提取的基因组DNA越多,完整性越好。这可能与新鲜孢子致病力强、发芽率高有关。(2)利用微孢子虫SSUrRNA基因共有的保守序列设计了裳卷蛾变形孢虫SSUrRNA核心序列的引物,经过PCR扩增得到一条长度约为1200bp的目的条带。(3)采用T-A克隆法对裳卷蛾变形孢虫SSUrRNA核心序列进行了克隆,对阳性克隆进行了双酶切鉴定和PCR检验。通过测序,去除上下游引物,得到裳卷蛾变形孢虫的SSUrRNA核心序列共1228bp,具有43种常见酶的119个酶切位点。其GC含量为34.69%,ssDNA分子量是37.01KD,裳卷蛾变形孢虫SSUrRNA核心序列在GenBank中的登录号为gi161137618|EU267796。2裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp.nov.)SSUrRNA核心序列的相似性分析通过BLAST比对,与裳卷蛾变形孢虫SSUrRNA核心序列相似的序列基本都来自于Vairimorpha属和Nosema属。它与Vairimorpha属的模式种Vairimorpha necatrix的相似性仅有71%,但与一些分离于鳞翅目昆虫的Vairimorpha属和Nosema属微孢虫具有99%的高相似性。3裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp.nov.)SSUrRNA核心序列的同源性分析利用ClustalX1.83和MEGA3.1软件构建了Vairimorpha属和Nosema属部分SSUrRNA序列的系统发育进化树。在构建的系统发育进化树中,Vairimorpha属和Nosema属不能很清晰地分成两个类群,而是出现交叉聚类的现象。裳卷蛾变形孢虫与分离于鳞翅目昆虫的Vairimorpha属和Nosema属部分序列聚为一类,它们的遗传距离为0.00～0.01。这种现象在用SSUrRNA、SSUrDNA、LSUrRNA进行Vairimorpha属和Nosema属的进化分析时不断出现。这可能与Vairimorpha属和Nosema属之间本来就具有很近的亲缘关系有关,也可能与微孢子虫细胞内寄生生长受到宿主基因组控制产生一些协同进化有关。与裳卷蛾变形孢虫分支最近的还是Vairimorpha sp.Germany,表明它们的同源性仍然是最高的。4裳卷蛾变形孢虫的分类地位更有价值的微孢子分类系统不仅包括其生物学特征,也与现代分子生物学和生物信息学密不可分,两者相辅相成。裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces sp.nov.)在孢子生殖时存在着二孢子形态和八孢子形态,本实验又对其SSUrRNA核心序列进行了克隆和进化分析,根据Sprague的微孢子虫分类系统和Canning et al.的建议,裳卷蛾变形孢虫确是Vairimorpha属的成员,也许归入Nosematidae科更为合适。
陈文锋[4]2010年在《基于SSUrRNA序列的熊蜂病原性微孢子虫分析》文中指出微孢子虫是专性细胞内寄生的病原微生物,寄主范围包括脊椎动物和无脊椎动物。熊蜂是我国主要的设施农业授粉昆虫,但其主要病虫害微孢子虫病原分布和流行情况还未深入研究。关于微孢子虫种的特征和相同种的遗传变异研究的经典方法都是利用核糖体RNA (rRNA)基因序列。已知多个属的微孢子虫感染昆虫寄主,并且不同寄主发现有不同的微孢子虫种。基于这种情况,不同熊蜂种也可能被不同微孢子虫感染,而不只是目前已知的只有熊蜂微孢子虫Nosema bombi。基于SSUrRNA序列的测定、PCR-RFLP分析和二级结构构建,本研究对来自我国不同地区熊蜂的病原性微孢子虫进行分析。结果如下：(1)微孢子虫广泛感染熊蜂。所调查的甘肃、青海、四川、内蒙古四地均发现微孢子虫感染,检测的26种1008只熊蜂,感染微孢子虫的有16种210只,感染率为20.8%。白背熊蜂Bombus festivus和西伯熊蜂Bombus sibiricus的微孢子虫感染率最高,分别为75.0%和68.6%。红束熊蜂Bombus rufofasciatus的感染率最低,为1.9%。内蒙古地区熊蜂微孢子虫的感染率最高,为50.0%；四川次之,为22.9%；甘肃与青海地区的熊蜂的微孢子虫感染率最低,分别为2.1%和7.7%。(2)我国熊蜂受到来自异源寄主的微孢子虫的感染。感染熊蜂的微孢子虫除了熊蜂微孢子虫Nosema bombi外,还有东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae和早期发现于鳞翅目卷叶蛾科寄主上的微孢子虫Nosema thomsoni相似的微孢子虫。(3)基于PCR-RFLP技术可鉴定感染蜜蜂及熊蜂的微孢子虫种类。使用限制性内切酶AfaⅠ对引物SSUrRNA-f1/SSUrRNA-rlb PCR扩增的微孢子虫部分SSUrRNA基因序列进行酶切,产物经过琼脂糖电泳分析确定微孢子虫种类。(4) SSUrRNA序列比对、系统发育树构建、二级结构分析结果显示感染熊蜂的微孢子虫都属于Nosema属,与以家蚕微孢子虫为代表的真微孢子虫‘'ture Nosema"相区分。来自熊蜂寄主的微孢子虫存在多样性。其中,发现于熊蜂的东方蜜蜂微孢子虫N.ceranae与蜜蜂寄主上的相似性大于99%,并且存在相同的1264 bp的SSUrRNA序列第116个碱基后插入GATT序列的现象。N.bombi A和N. thomsoni A分别与已报道的N.bombi (GenBank登录号：AY008373)和N.thomsoni (GenBank登录号：EU219086)有高度相似性,大于99%。另外,Nosema sp.-1与N.bombi A.的相似性约为97.1%,Nosema sp.-2与N. thomsoni A相比存在14个碱基的差异,Nosema sp.-1与Nosema sp.-2分别是N.bombi和N. thomsoni的近缘种。
参考文献：
[1]. 家蚕病原性微孢子虫的核糖体RNA编码基因的研究及其二级结构的构建[D]. 王见杨. 中国农业科学院. 2000
[2]. 家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）基因组学研究[D]. 刘含登. 西南大学. 2011
[3]. 裳卷蛾变形孢虫（Vairimorpha ceraces sp.nov.）SSUrRNA核心序列的克隆与分析[D]. 马露芸. 西南大学. 2008
[4]. 基于SSUrRNA序列的熊蜂病原性微孢子虫分析[D]. 陈文锋. 中国农业科学院. 2010
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