钟世顺[1]2001年在《大肠癌血管生成及p53基因对其调控作用的研究》文中指出大量研究证明，大肠癌（Colorectal cancer，CRC）在生长以及转移过程中，一个关键的因素是必须形成功能性血管系统来供应其生长所需的氧和营养物质。近年来陆续发现了许多血管形成因子与血管形成抑制因子，如血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），也称血管渗透因子（Vascular permeability factor，VPF），是肿瘤血管生成的一个重要调节因子。研究表明，VEGF不仅以旁分泌的形式促进肿瘤血管的生成，也可能通过自分泌形式作用于肿瘤细胞自身的VEGF受体而促进肿瘤细胞生长。血管生长因子的水平如何，最终是通过肿瘤中的微血管生长状态表达出来。众多体外实验表明，抑癌基因p53在调节肿瘤血管形成方面发挥了重要作用。但是，有关大肠癌p53基因与微血管密度（Microvessel density，MVD）和血管内皮生长因子及其受体之间关系的研究仍然较少。本实验探讨了VEGF及其受体在大肠癌组织中的表达及其与临床特征之间的关系，并通过检测大肠癌微血管密度和p53基因的表达，探讨了VEGF、MVD和p53之间的关系，为临床大肠癌抗血管治疗靶点的选择以及复发、转移和预后判断指标的选择提供依据。方法：1.采用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测方祛，对68例大肠癌手术标本的癌组织和癌周组织中VEGF mRNA的表达水平进行了半定量研究。2.应用免疫组织化学SABC法检测68例大肠癌组织和癌旁组织VEGF及KDR蛋白的表达，20例正常组织作对照。3.用免疫组织化学SABC法检测了68例大肠癌组织不同区域VEGF、MVD和p53的表达状态。结果：1.肿瘤组织中VEGF mRNA的表达率为67.6％（46/68），癌周组织表达率为32.4％（22/68）；肿瘤组织中VEGF mRNA表达水平在浆膜浸润组、淋巴结转移组、远处转移组和Dukes D期组分别显着高于未侵及浆膜组、无淋巴结转移组、无远处转移和Dukes A、B、C期组；肿瘤组织中VEGFmRNA表达水平在直径大于5cm的CRC组与直径小于5cm的CRC组以 及不同组织学分级组之间相比差异无显着性。 2 20例正常组织中未发现VEGF及KDR的表达，68例大肠癌组织 中 VEGF表达阳性率为 55．9O（38／68），KDR表达阳性率为 45．6O （31历8），均明显高于癌旁组织（118％，8伍8：88％，6伍8）（P＜001）。 大肠癌组织VEGF及KDR的表达与肿瘤浸润深度、淋巳结转移、远处 转移、血管侵犯、Dukes分期密切相关，而与组织学分型无关。VEGF与 KDR的表达密切相关。 3 大肠癌组织 VEGF和 p53的表达以及 MVD数量明显高于癌旁组织 和正常组织。大肠癌组织VEGF及p53的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结 转移、远处转移、血管侵犯、Dukes分期密切相关，而与组织学分型无 关。p53（＋）或VEGF（＋）组MVD（34．6士12．2；31．2士12．6）均显着 高于…3（－）或VE GF卜）组（15刀士7＊1二7士6．3）（k0＊1）：VE＊F 和 p53均为阳性时，MW值最大（36．5士11．9）（P＜0．of）。MW记数与 VEGF表达明显相关o＜0刀1L p53的表达与 VEGF表达和 MVD记数 均显着相关（P＜001）。 结论： 1．VEGF在大肠癌浸润和转移过程中发挥重要作用，肿瘤血管形成与 大肠癌浸润和转移关系密切。 2．VEGF及其受体KDR与大肠癌血管生成有关，在大肠癌的发生、发 展和转移过程中起重要作用。 3．在大肠癌的血管生成过程中可能存在p53－VEGF调节旁路，p53基因 在调控肿瘤血管形成方面起重要作用。
吴红涛[2]2008年在《△Np73基因对大肠癌侵袭性的影响及其反义基因对大肠癌的治疗作用研究》文中认为研究背景:大肠癌是一种对人类健康和生命威胁很大的恶性肿瘤,其发生与多种因素有关。大量遗传学和分子生物学研究表明,p73基因的异常表达与大肠癌的侵袭、转移和生长都有着密切的关系。ΔNp73基因是p73基因的一个亚型,缺乏NH2末端反式转录激活区域,是“缩短”了的p73基因。近年来的研究表明,ΔNp73基因作为p73基因的异构体,的确参与了肿瘤的发生机制,但ΔNp73基因在大肠癌中与抑癌基因之间的相互作用关系尚未明了,主要是:(1)ΔNp73基因在多种人类肿瘤中均很少有突变发生,但在大肠癌中却发生了突变;(2)ΔNp73基因在大肠癌中与周围正常组织比较表达明显增强;(3)ΔNp73基因敲除鼠并不发生自发性的肿瘤。因此,ΔNp73基因作为抑癌基因p53基因家族成员p73基因的异构体究竟是癌基因还是抑癌基因?至今尚未明了。虽然研究已表明,ΔNp73基因在大肠癌细胞中呈高表达,但ΔNp73基因的表达在大肠癌的发生、发展中的起着什么样的生物学作用机制?迄今有关文献鲜见报道。有鉴于此,这也正是本研究想要进一步阐明的课题。目的:研究ΔNp73基因的生物学特性;进一步阐明ΔNp73在人类大肠癌发生、发展中的作用机制;并探讨反义ΔNp73基因作为临床大肠癌基因治疗的新靶点的潜在价值。方法:将ΔNp73基因构建于真核表达质粒pcDNA3,通过脂质体基因转染的方法将外源性ΔNp73基因转染人类大肠癌细胞株LOVO,用G418筛选稳定表达ΔNp73基因的细胞克隆,RT-PCR和western blot对所筛选的细胞克隆进行鉴定。将筛选得到的稳定表达ΔNp73基因细胞株放大培养,观察ΔNp73基因对LOVO细胞株生长的影响。以转染ΔNp73基因后大肠癌细胞株的生长情况、凋亡率、侵袭性、肿瘤血管生长调节因子的变化作为切入点,利用MTT、流式细胞术、Boyden小室体外侵袭实验、肿瘤MVD测定以及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、western blot等多种实验室技术检测大肠癌细胞生物学指标及侵袭性的变化,并利用反义技术构建反义ΔNp73真核表达载体,探讨反义ΔNp73基因对大肠癌的治疗作用,并反证ΔNp73基因对大肠癌的侵袭性的影响。应用SPSS10.0统计软件进行统计分析。结果:将ΔNp73基因以脂质体法转染LOVO细胞后,经G418成功的筛选出稳定表达ΔNp73基因的细胞株。细胞生长曲线测定发现转染了ΔNp73基因后的LOVO细胞生长速度较未转染ΔNp73的LOVO细胞明显加快(P<0.01);流式细胞术检测结果提示表达ΔNp73的细胞株凋亡率降低,Boyden小室体外侵袭实验显示, LOVO-ΔNp73细胞穿膜数较空白对照组和LOVO-pcDNA3组增多,差异具有显着性(p<0.01)。与空白对照组相比, LOVO-ΔNp73细胞中VEGF表达较未转染ΔNp73基因的细胞明显增高(p<0.01)。RT-PCR半定量法检测LOVO细胞中的VEGFmRNA表达,发现ΔNp73基因显着增加了VEGFmRNA的表达(p<0.01);western blot半定量法检测VEGF蛋白表达,发现ΔNp73基因同样增强了LOVO细胞中VEGF蛋白表达水平(p<0.01)。在体内实验中,ΔNp73基因同样促进了裸鼠种植瘤的生长,并增加了肿瘤的MVD(p<0.05)。利用反义技术构建反义并转染LOVO细胞后,检测以上指标,结果提示肿瘤的生长受到抑制,侵袭性降低,血管生成减少,说明反义ΔNp73基因对大肠癌具有治疗作用,同时也反证了ΔNp73基因在大肠癌发病中所起的作用更类似一个癌基因。结论:ΔNp73基因在大肠癌的发生、发展中扮演了癌基因的角色。其作用机制是通过抑制细胞凋亡、促进大肠癌组织血管增生,从而促进了大肠癌细胞的增殖生长及增强了大肠癌的侵袭性。利用反义技术构建的反义ΔNp73基因,通过封闭ΔNp73基因的表达,可有效抑制大肠癌细胞的生长,促进大肠癌细胞的凋亡,可作为一种具有临床应用前景的大肠癌基因治疗的新靶点。
张学斌[3]2006年在《腺病毒5型E1A基因绿色荧光蛋白真核表达载体的构建及其对大肠癌治疗作用的研究》文中进行了进一步梳理大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,常用的手术、化疗、放疗等传统的治疗方式均未能使其疗效得到明显的提高。自九十年代以来,肿瘤基因治疗已成为最引人瞩目的研究领域,是继手术、放疗、化疗、免疫治疗之后的第5种模式。人类腺病毒5型E1A基因(Ad5.E1A)是近年来新发现的一个抑癌基因。它能双向调控多种基因的表达,通过依赖及非依赖p53的途径诱导细胞程序化死亡,调控细胞周期,使细胞滞留在G1及G2期。ElA蛋白是多功能转录因子,它能从正、负两种途径调控多种基因的转录。目前,E1A基因抗肿瘤作用的研究,对大肠癌作为对象研究的较少。本研究通过构建真核表达质粒pEGFP-E1A,脂质体介导转染大肠癌细胞系LoVo细胞,经G418筛选获得稳定表达ElA基因的转染细胞LoVo-ElA,在体外探讨了ElA基因对大肠癌细胞系LoVo细胞体外生长的抑制作用和化疗增敏作用,对比LoVo-E1A、LoVo-vect、LoVo细胞在生长速度、倍增时间、软琼脂集落形成能力、对化疗药物的敏感性的等方面的变化。建立了大肠癌细胞系LoVo-E1A、LoVo-vect、LoVo细胞的裸鼠人工荷瘤动物模型,在体内探讨了E1A基因在体内对LoVo细胞的作用,通过LoVo-E1A、LoVo-vect以及LoVo细胞在裸鼠体内生物学性状的差别,以及模拟E1A基因治疗裸鼠实验,观察E1A基因及其与博来霉素联合应用在动物体内的疗效。通过对E1A基因与HER-2/neu基因及p185蛋白之间的关系的研究,探讨了E1A基因对大肠癌细胞抑制作用的机理。E1A基因的稳定表达明显抑制大肠癌细胞的恶性表型,降低其对裸鼠的致瘤性,说明E1A基因在大肠癌基因治疗中有重要意义,为其临床应用提供了理论和实验依据。
徐晓红[4]2010年在《抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及其体内外抑瘤作用》文中指出由抗体介导的免疫靶向治疗是肿瘤生物治疗的主要组成部分,但其发展仍面临诸多挑战,如作为靶向工具的抗体分子量比较大、侵透性差、稳定性弱；所应用抗体多为鼠源抗体,免疫原性较高；所应用抑癌分子特异性较低,存在损伤正常细胞的隐患等。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是一种广泛存在于结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞表面的高度糖基化癌胚蛋白。人源化的抗CEA单链抗体(single chain Fv fragment, scFv) T84.66对CEA具有较高特异性,已普遍应用于结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤的诊断和免疫治疗,其疗效已为临床Ⅰ期试验所证实。且scFv T84.66具有结合活性高、侵透性强、免疫原性低和廓清快等优点。scFv T84.66同其它单链抗体一样具有先天缺陷,如较亲本抗体亲合力有所下降；在体温条件下稳定差较差；特定情况下会出现聚集倾向等,这可能与scFv的轻、重链可变区存在非共价键有关,但这种现象会通过引入链间二硫键而有所改观,即将scFv改构为稳定性较高的二硫键稳定型单链抗体(disulfide stabilized single chain Fv fragments, scdsFv)。Apoptin基因来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV),能够特异性地诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无细胞毒作用。另外,肿瘤的放射治疗和多数化学治疗药物通过p53发挥作用,一旦p53突变即会形成耐药,而Apoptin的凋亡诱导作用不依赖p53,也不受凋亡抑制分子bcl-2等因素的影响,bcl-2分子的存在反而能够增强其作用。因此,Apoptin基因已广泛应用于肿瘤基因治疗研究领域。本研究通过生物信息学方法设计scdsFv T84.66,并利用人工合成方法,将Apoptin基因通过柔性肽序列连接至scdsFv T84.66下游,构建并表达了具有特异性识别／结合CEA功能和特异性杀伤肿瘤细胞功能的抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin,并在体内、外对其抑瘤作用进行了分析。
李瑞[5]2007年在《VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸治疗大肠癌的实验研究》文中进行了进一步梳理目的本研究拟运用已构建好的携有血管内皮细胞生长因子启动子(VEGFP)并含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因和Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重组腺病毒(Ad)载体，同时配制脂质体与survivin反义寡核苷酸转染复合物，在体外和体内分别感染大肠癌Lovo细胞，以研究Ad-VEGFP-CDglyTK基因治疗系统及survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤作用和体内抑瘤作用。一方面通过survivin反义寡核苷酸抑制survivin表达，诱导分泌大肠癌细胞凋亡，并消除血管内皮生长因子(VEGF)在血管形成中的细胞保护作用，导致内皮细胞凋亡和毛细血管迅速退化；另一方面通过VEGF启动子介导双自杀基因选择杀伤分泌VEGF的大肠癌细胞，减少VEGF的分泌，通过两者的协同作用抑制肿瘤的生长。方法一、Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究运用脂质体将不同浓度的Survivin ASODN转染Lovo细胞，用MTT法测定细胞存活率，采用RT-PCR方法测定survivin mRNA的表达状况，Western blot方法检测大肠癌Lovo细胞survivin蛋白的表达，并用流式细胞仪检测survivinASODN对大肠癌Lovo细胞周期的影响。二、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究复苏和扩增含有荧光蛋白(GFP)报告基因重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK，再用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒，并进行重组腺病毒的滴度测定，然后感染大肠癌Lovo细胞，给予前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和更昔洛韦(GCV)进行作用一定的时间，测定重组腺病毒对大肠癌Lovo细胞转染效率、细胞存活率及旁观者效应，并进行细胞形态学观察，然后重组腺病毒与survivin ASODN的联合作用观察大肠癌Lovo细胞的增殖及凋亡。叁、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌裸鼠体内抑瘤作用的实验研究将Lovo细胞接种于4周龄BALB／C裸鼠皮下建立裸鼠大肠癌移植瘤动物模型，当肿瘤达0.5cm直径时，将荷瘤裸鼠随机分组，并分别注射相应的survivin反义寡核苷酸及重组腺病毒，再向动物模型腹腔内注射5-FC和GCV，测量实体瘤重量变化、计算抑瘤率，治疗结束后取肿瘤组织进行HE染色观察病理学变化，免疫组化法检测微血管密度。结果一、Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究1．细胞成活率的测定不同浓度的Survivin反义寡核苷酸，Survivin正义寡核苷酸和空白对照转染大肠癌Lovo细胞后得到的细胞成活率，结果经单因素方差分析，Survivin ASODN组与Survivin SODN组、空白对照组比较，差异显着(P＜0.05)，有统计学意义，说明Survivin ASODN与其他两组相比对大肠癌细胞有明显的抑制作用，而另两组间无统计学差异(P＞0.05)。Survivin ASODN在400ng／ml浓度时，对大肠癌细胞的抑制作用最明显。2．RT-PCR检测Survivin ASODN对Lovo细胞mRNA表达的影响RT-PCR产物电泳显示，对照组和处理组均出现特异性的Survivin条带，Survivin ASODN各组Survivin mRNA的表达明显低于空白对照组、脂质体组和Survivin SODN组等叁组，经凝胶图像分析仪分析结果显示：空白对照组、脂质体组和SODN组之间无显着性差异(P＞0.05)，ASODN各组和上述叁组的Survivin／GADPH，差异具有显着性(P＜0.05)，其中以400ng／ml ASODN组及800ng／ml ASODN组与上述叁组差异最为显着。3．Western blot方法检测大肠癌Lovo细胞survivin蛋白的表达western blot检测表明：空白对照组、脂质体组和SODN组之间，Survivin蛋白表达无明显性差异(P＞0.05)，200ng／ml ASODN组转染后Survivin蛋白表达略有降低，400ng／ml ASODN组及800ng／ml ASODN组转染后Survivin蛋白表达较空白对照组、脂质体组和SODN组明显降低，有统计学意义(P＜0.05)，其中400ng／ml ASODN组转染后Survivin蛋白表达为16.33±1.48。4．流式细胞仪检测survivin ASODN对大肠癌Lovo细胞周期的影响流式细胞仪检测发现：实验各组凋亡峰分别为：(0.91±0.29)％、(0.87±0.22)％、(18.56±2.80)％和(30.47±1.73)％，ASODN组与空白对照组、SODN组有显着差异(P＜0.05)，提示survivin ASODN能够大量诱导细胞凋亡。G_1期细胞分别为：(75.22±2.13)％、(72.17±2.63)％、(43.24±2.75)％和(9.37±2.67)％，各转染组G_1期细胞显着减少。各组S期细胞无明显变化，无统计学意义。G_2／M期细胞分别为：(4.46±1.44)％、(5.43±1.43)％、(13.40±2.04)％和(39.85±2.66)％，ASODN组较空白对照组、SODN组G_2／M期细胞显着增加(P＜0.05)，出现G_2／M期阻滞现象，并且survivin ASODN能够以剂量依赖的方式诱导大肠癌Lovo细胞发生G_2／M期阻滞。二、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究1．重组腺病毒体外转染Lovo细胞的转染效率观察发现：Lovo细胞转染重组腺病毒后在荧光显微镜下呈现绿色荧光，未转染的细胞则无着色现象。采用不同MOI的重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK分别转染Lovo，发现重组腺病毒对Lovo细胞的转染效率随腺病毒滴度的增加而递增，当MOI=100时，90％以上的GFP表达，说明本实验室构建的重组腺病毒体外转染效率高，目的基因能有效地得以表达。2．MTT法检测重组腺病毒对大肠癌Lovo细胞存活率MTT法检测细胞成活率结果提示：用不同浓度的5-FC、GCV或者5-FC+GCV治疗后，重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK转染后肿瘤细胞的存活率随药物浓度增加均呈逐渐下降趋势，即对前药的作用呈浓度依赖性。单用浓度1μg／ml的GCV时，细胞存活率为(56.47±2.39)％，单用浓度为40μg／ml的5-FC，细胞存活率为(53.35±2.20)％，二者联合时，细胞存活率分别为(27.23±1.46)％，提示在5-FC和GCV浓度固定的情况下，单一前药和双前药作用下的细胞存活率相比，有显着性差异(P＜0.05)。3．旁观者效应旁观者效应结果如下：重组腺病毒按不同比例转染Lovo细胞，在20％的混合比例，GCV组细胞存活率为(65.25±1.58)％，5-FC组细胞存活率为(63.63±1.71)％，GCV+5-FC组细胞存活率为(45.60±2.07)％，它们均显着低于对照组(P＜0.05)，GCV组与5-FC组无明显差异。我们观察到随着转染病毒Lovo细胞所占比例的增加，细胞存活率逐渐降低，转染病毒组与对照组均有显着差异(P＜0.05)，GCV+5-FC组较GCV组与5-FC组亦有显着差异(P＜0.05)，提示CD与TK自杀基因具有旁观者效应，VEGF启动子驱动的双自杀基因旁观者效应更强，并呈现协同效应。4．药物作用后电镜的观察电镜下观察：可见部分细胞体收缩、染色质边聚，有的胞核形态不规则，核发生碎裂，胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片，有的可见凋亡小体(或整个凋亡细胞)被吞噬和降解的现象，同时见部分细胞呈坏死表现。5．VEGF启动子驱动的双自杀基因与Survivin ASODN联合作用对Lovo细胞增殖的影响各实验组作用24h后，细胞存活率分别为：空白对照组(98.35±1.22)％、Survivin ASODN组(62.49±2.47)％、Ad-VEGFP-CDglyTK组(69.43±1.49)％、ASODN+Ad-VEGFP-CDglyTK组(31.48±2.38)％，空白对照组与其他叁组均有显着性差异(P＜0.05)，基因联合治疗组细胞存活率较Survivin ASODN组及Ad-VEGFP-CDglyTK组亦明显降低，有统计学意义(P＜0.05)，提示Survivin ASODN与VEGF启动子驱动的双自杀基因对于大肠癌Lovo细胞的抑制，具有有协同作用。6．重组腺病毒与survivin ASODN的联合作用对细胞凋亡的影响流式细胞仪检测显示：单独应用Survivin ASODN的Lovo细胞的凋亡率为(19.55±2.38)％，单独应用Ad-VEGFP-CDglyTK的Lovo细胞的凋亡率为(21.83±2.23)％，两者联合应用的Lovo细胞的凋亡率为(38.53±2.30)％，叁者均能促进Lovo细胞的凋亡作用，与空白对照组有显着差异(P＜0.05)。Survivin ASODN及Ad-VEGFP-CDglyTK处理组相比没有明显差异(P＞0.05)。Survivin ASODN与Ad-VEGFP-CDglyTK二者联合应用较Survivin ASODN及Ad-VEGFP-CDglyTK处理组差异显着(P＜0.05)，有统计学意义，提示Survivin ASODN和Ad-VEGFP-CDglyTK两者对于大肠癌Lovo细胞的凋亡具有协同作用。叁、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌裸鼠体内抑瘤作用的实验研究1．荷瘤裸鼠肿瘤生长及基因联合抑瘤作用Lovo细胞接种裸鼠皮下4-5天后，陆续可在皮下摸到粟粒样大小肿瘤结节，至接种后第12天，所有被接种裸小鼠均出现结节，移植成功率为100％。裸鼠成瘤达0.5cm后开始分组治疗，四组初始瘤体体积方差分析无显着差异(P=0.389)。治疗结束时最终瘤重及抑瘤率分别为：空白对照组(516.58±10.58)mg；重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK组(238.74±15.77)mg，(53.78±3.12)％；Survivin ASODN组(225.61±13.47)mg，(56.23±2.60)％；基因联合治疗组(63.70±3.41)mg，(87.66±0.70)％。空白对照组与其他叁组差异显着(P＜0.05)，基因联合治疗组与另外两组比较亦差异显着(P＜0.05)，提示Survivin ASODN及VEGF驱动的双自杀基因均具有抑瘤作用，但二者联合治疗抑瘤作用更为明显，具有协同作用。2．移植瘤瘤体病理变化常规病理下见肿瘤细胞生长受抑制，特别是基因联合治疗组抑瘤作用最明显，肿瘤组织切片中可见片状坏死区，而且这些区域可见大量炎性细胞浸润。3．微血管密度的检测检测肿瘤组织MVD发现：空白对照组MVD为19.25±3.19、重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK组MVD为11.33±2.46、Survivin ASODN组MVD为10.42±2.35、基因联合治疗组MVD为3.33±1.56，空白对照组MVD明显高于其他叁组(P＜0.05)，重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK组及Survivin ASODN组MVD均高于基因联合治疗组，并有显着差异(P＜0.05)。结论1．Survivin ASODN转染大肠癌Lovo细胞，阻碍了survivin mRNA转录及翻译的过程，survivin蛋白表达下降。2．Survivin ASODN可以抑制大肠癌Lovo细胞的增殖，且随浓度增加，其对细胞的抑制作用更明显。3．Survivin ASODN封闭survivin基因的表达，可诱导结肠癌Lovo细胞的凋亡。4．VEGF启动子驱动的双自杀基因对大肠癌Lovo细胞具有明显的体外杀伤作用，其杀伤作用强于单自杀基因。5．VEGF启动子驱动的双自杀基因作用机制为对靶细胞的直接杀伤作用及旁观者效应，表现为处理后抑制靶细胞的增殖及诱导靶细胞的凋亡。6．VEGF启动子驱动的双自杀基因和Survivin反义寡核苷酸联合应用在体外实验中，对抑制大肠癌Lovo细胞的增殖和诱导细胞凋亡过程起协同作用。7．VEGF启动子驱动的双自杀基因和Survivin反义寡核苷酸均具有一定的体内抑瘤作用，而且二者联合应用，对于肿瘤的抑制作用更加显着，具有协同作用。
刘志毅[6]2008年在《KDR启动子驱动双自杀基因CD/TK对大肠癌SW480细胞杀伤作用的实验研究》文中研究指明大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其常用的治疗方式是手术、化疗、放疗等,近年来生物治疗引人注目,成为大肠癌治疗的第四种方式,尤其是肿瘤基因治疗已成为研究热点。自杀基因又称为酶解前药基因,是利用转基因技术,将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因(自杀基因)转导入肿瘤细胞,该基因表达的产物,可以将无毒的或低毒的药物前体,转化为细胞毒性和/或对放疗敏感的药物,从而影响肿瘤细胞的遗传物质合成,引起肿瘤细胞的死亡。双自杀基因疗法是利用基因工程的技术,将两种自杀基因整合在一起,通过载体转导入肿瘤细胞,使其在肿瘤细胞内表达融合基因产物,此产物具有两种自杀基因编码的酶的活性。然后给予双前体药物治疗,从而对两类不同的前体药物敏感,而发挥双功能的杀伤作用。目前双自杀基因多为CD-TK融合基因。KDR(kinase domain insert containing receptor)是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的4种受体之一,其在肿瘤血管内皮细胞能高效表达,在肿瘤血管形成过程中起着关键作用,高表达于肿瘤新生血管内皮细胞及恶性程度高的肿瘤细胞[1,2] ,且肿瘤细胞表达多强于内皮细胞,是一个具有高度特异性的肿瘤治疗靶点。为此我们构建含有HSV-TK,GCV-CD,KDR基因的共表达的腺病毒载体;研究KDR-CD-TK系统对大肠癌细胞的杀伤作用。利用重组DNA技术,构建含HSV-TK、GCV-CD,KDR基因的共表达载体pAdKDR-CDglyTK。在脂质体介导下转染293包装细胞,G418筛选出抗性克隆SW480,以PCR、RT-PCR、等对pKDR-CDglyTK系统修饰的SW480细胞进行鉴定。通过观察基因修饰细胞生长状况、MTT法及流式细胞仪观察GCV、5-FC对SW480细胞的杀伤效应。在体外,GCV、5-FC可诱导SW480细胞凋亡,且凋亡百分率随GCV+5-FC作用时间的增加而升高;经GCV5-FC作用后的SW480细胞,阻滞于S期;大肠癌细胞SW480对GCV+5-FC系统高度敏感。并且对体内其他部位未转染KDR-TK/CD基因大肠癌细胞,产生远距离旁观者效应明显。经过1.0GyCo60对SW480细胞照射后,腺病毒转染率明显生高,γ射线能够增加转染TK/CD基因的SW480细胞对前药的敏感性,前药(GCV+5-FC)能提高细胞对γ射线具有放射敏感性,与γ射线具有协同作用。
林书瀚[7]2018年在《大病理切片下大肠癌浸润转移的组织形态和生物机制研究》文中研究指明第一部分大肠癌大病理切片下的细胞和组织形态研究目的:通过结直肠癌肿瘤原发灶和转移灶大病理切片的细胞和组织形态学观察研究,探讨大肠癌原发灶及其不同转移灶组织和细胞形态改变的特点和细胞分布的规律;探讨其生物学性状及行为的特点与组织及细胞形态学改变之间的关系;通过组织及细胞形态学的观察研究,反映肿瘤的生物学性状和行为现象,进一步揭示结直肠癌浸润和转移可能相关的机制。方法:本研究共选取了52例III-IV期结直肠癌患者,其中淋巴结转移52例、肝转移11例、卵巢转移6例。完整收集患者原发灶、肝转移灶、淋巴结转移灶和卵巢转移灶组织,分别制成大病理切片并进行常规HE染色,通过EVOS auto智能全自动荧光显微成像系统对病理大切片进行全层和多层扫描,获得大病理切片全景和局部放大图。为了便于对比观察,原发灶根据细胞分布的情况分为肿瘤主体病变区(低倍镜下肿瘤性组织和结构最集中的部分)、肿瘤外围病变区(低倍镜下主体病变区肿瘤性组织和结构连续性外延的区域)、肿瘤延展病变区(低倍镜下肿瘤性组织和结构连续性外延终端外,肿瘤的组织和细胞呈散在性、非连续性的分布区域)和正常组织区四个区域。重点观察原发瘤各个区域、淋巴结、肝转移灶和卵巢转移灶、癌组织与正常组织交界区等细胞分布和组织结构的形态特点和规律,测量相关径线的数据。观察其细胞形态及细胞增殖情况的变化。本研究中统计学采用IBM SPSS Statistics 16.0软件进行数据分析。对于服从正态分布或近似正态分布的计量数据采用均数±标准差((?)±s)的形式来描述,组间比较使用独立样本t检验;对于严重偏态的数据则使用中位数[四分位数间距](median[IQR])的形式来描述,两个指标间比较则使用Mann-Whitney检验,叁个指标间比较使用Kruskal-Wallis H检验,若整体差异有统计学意义,进一步的两两比较采用Bonferroni检验。本文以双侧P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)原发灶:绝大部分标本都可以看到肿瘤细胞呈四个区分布的规律性;主体病变区粘膜底层结构明显破坏,细胞聚集明显、呈多种形态并向粘膜表层和深部肌层拓展,甚至完全破坏粘膜表层形成溃疡区;至肿瘤外围病变区交界处粘膜底层的结构逐渐恢复可辨,但粘膜底层细胞存在明显恶性形态学改变,其附近组织中有大量连续分布的肿瘤细胞,常累及部分粘膜表层。越靠近肿瘤的延展区,表面的正常粘膜越厚,病变的细胞逐渐集中于粘膜底层,这一区域肌层的浸润也较轻,肿瘤细胞明显呈散在性分布,细胞或各个小癌灶之间相互不连贯,从整体形态结构的改变来看,肿瘤从主体区向周边沿着粘膜底层拓展延伸的形态学特征明显可见。以粘膜底层的走向为轴线进行测量发现,肿瘤沿粘膜底层病变延伸的长度,远大于主体病变区的宽度,P<0.05。而就肿瘤细胞在粘膜底层上下两侧分布的宽度而言,在延展区明显呈鼠尾状,主体病变区的上下径明显大于延展区,P<0.05;在延展区与正常组织的交界处的粘膜底层,易见异型细胞和细胞渐变的形态学表现,其异型细胞数量明显多于其它区域,P<0.05。但完全看不到有肿瘤细胞对正常结构产生整体性挤压、推移的形态学特征。(2)肝转移灶:大部分肝转移灶与正常组织的交界区与原发灶明显不同,存在环绕转移灶主体的纤维组织结构,形成类似包膜样的结构,纤维组织结构邻近肝组织可见到散在分布的肿瘤细胞或异型细胞;主灶细胞呈巢状分布,无分布的规律性和方向性,形态上接近于原发灶肿瘤,细胞大小和形态的一致性好于原发灶主体病变区,仅从细胞形态学的情况无法区分其与原发灶细胞及淋巴结转移灶细胞的差别。(3)卵巢转移灶:本组卵巢转移灶都分布于卵巢实质内,肿瘤细胞在卵巢实质内呈巢状分布,形态上类似于肿瘤原发灶的主体区,癌巢周围没有纤维组织环绕,常见散在性分布的异型细胞,且癌巢周围的边界不清晰,卵巢病变区的组织形态与肝及淋巴结转移灶相比明显混乱,细胞形态呈多样性,常见小圆细胞,难以鉴别细胞的来源和形态特征,与原发灶及其他部位转移灶存在明显的形态学差异。(4)淋巴结转移灶:肿瘤细胞主要也呈巢状分布,形态类似于原发灶主体区,癌巢周围无纤维组织环绕,可见散在分布的肿瘤细胞或异型细胞,与正常的淋巴细胞及异型细胞间杂分布,肿瘤细胞的形态与原发灶及肝转移灶接近,无法靠形态学区分,细胞大小和形态的一致性较好。结论:本组以上大肠癌不同病灶大病理切片形态学观察研究的结果提示:(1)大肠癌不同病灶的组织和细胞形态学改变有一定的规律,且可反映不同病灶肿瘤细胞各自的某些生物学性状和行为特点;(2)肿瘤细胞在大肠癌原发灶的不同区域和不同的病灶中存在行为学的异质性,这种异质性的产生可能与肿瘤细胞的生物学性状和多向分化传代有关;(3)肿瘤的浸润、转移及生长发展方式可能与肿瘤细胞的生物学性状有关,而细胞增殖可能是大肠癌各转移灶和原发灶主体病变区的主要生长方式;(4)卵巢转移灶形态学的明显差异提示,大肠癌的卵巢转移可能不仅仅是细胞事件,可能与卵巢自身特殊的生物结构环境和肿瘤的全身环境有关。第二部分干细胞诱导实验及原发灶和转移灶叁种分子蛋白表达的检测目的:在大病理切片组织形态学研究的基础上,通过对原发灶不同区域及不同转移灶蛋白表达情况的对比检测和脐带间充质干细胞诱导培养的观察,进一步综合了解和揭示肿瘤原发灶不同区域及相关转移灶肿瘤细胞生物学性状差异的情况,初步判断多向分化潜能细胞在特定生物环境下被诱导生长的可能性,进一步说明肿瘤不同区域组织形态学特点的差异可能与肿瘤细胞的生物学性状差异有关。方法:(1)大病理切片特殊染色分析:在前述大病理切片基础上,分别对原发灶及不同部位的转移灶组织进行P53、VEGF和β-catenin的免疫组化染色,通过EVOS auto智能全自动荧光显微成像系统对切片进行全层和多层扫描,获得切片全景和局部放大图,由两位资深(副高以上)病理科医生分别读片,原发灶按前述分区,分别观察记录叁种检测指标在不同病灶和区域的表达情况和数据,意见不一致时二人会诊讨论决定。(2)脐带间充质干细胞诱导培养观察:把经过质检的同一来源批次和数量的脐带间充质干细胞分为对照组和实验组;对照组用标准培养液加健康血清,实验组用标准培养液加晚期结直肠癌病人去细胞癌性腹水在同一条件下进行培养;分别于培养后24和48小时对细胞生长情况和细胞形态学情况进行观察,计数和记录。本研究中统计学采用IBM SPSS Statistics 16.0软件进行数据分析。对于服从正态分布或近似正态分布的计量数据采用均数±标准差((?)±s)的形式来描述,组间比较使用独立样本t检验;对于严重偏态的数据则使用中位数[四分位数间距](median[IQR])的形式来描述,两个指标间比较则使用Mann-Whitney检验,叁个指标间比较使用Kruskal-Wallis H检验,若整体差异有统计学意义,进一步的两两比较采用Bonferroni检验。本文以双侧P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、原发灶不同区域及不同转移灶蛋白表达情况:(1)原发灶:P53在原发灶的各区均有表达,但以肿瘤主体病变区最为明显;VEGF在肿瘤的各个区域也均有表达,但肿瘤的外围区及延展区表达明显高于主体病变区;而β-catenin在肿瘤的外围区表达最为明显,主体病变区、延展区及正常组织区也有表达;结果提示,原发灶肿瘤主体区、肿瘤外围区、延展区及正常组织区P53、VEGF和β-catenin的表达情况,差异均有统计学意义(P<0.001)。两两比较亦显示,任意两个区的P53、VEGF表达情况,差异亦有统计学意义(P<0.05)。(2)肝转移灶:叁种蛋白表达物的表达与其他病灶也存在差异,VEGF主要在肝转移灶的周边区表达率较高(8/11,73%),但P53则呈整体表达。(3)卵巢转移灶:P53、VEGF和β-catenin蛋白在卵巢转移灶均呈较高表达表达但其表达强度仍存在不同的差异。(4)淋巴结转移灶:叁种蛋白表达物在淋巴结转移灶的表达与卵巢转移灶的表达情况较接近,但与原发灶不同区域的表达对比存在明显差异。2、脐带间充质干细胞诱导培养观察结果:观察结果提示,诱导培养前后间充质干细胞的形态明显发生变化,诱导培养前细胞的形态均一,细胞扁平,形态类似成纤维细胞,分布均匀,排列有序。诱导培养24和48h后,与对照组细胞相比,MSCs的细胞形态均发生显着变化,细胞变圆变短,细胞核增大。同时,与对照组相比细胞的增殖速率显着提高,增殖曲线上移,并随着腹水比例的增加而显着上升。结论:根据本组大肠癌原发灶及不同转移灶免疫组化检测和脐带间充质干细胞诱导培养观察所见,结合前述常规大病理切片研究的结果,有以下几点值得总结:(1)大肠癌原发灶不同区域的细胞确实存在生物表达的差异,说明其生物学性状存在差异,也可以初步说明其行为学及相应组织形态差异的可能原因。(2)大肠癌原发灶不同区域以及各转移灶之间的生物表达存在差异,提示不同的转移灶细胞可能来源于原发灶的不同区域或细胞。(3)大肠癌原发灶和不同转移灶细胞生物学性状及行为的异质性,可能与大肠癌原发灶中细胞的多向分化有关。(4)脐带间充质干细胞诱导培养的结果提示,肿瘤性的生物环境,极有可能对具有分化潜能的细胞产生生物诱导作用,是否对肿瘤的转移、浸润机制具有生物学意义,应该进一步深入研究。
左锋[8]2007年在《血管内皮细胞生长因子与大肠癌临床分期的研究》文中指出目的：研究血管内皮细胞生长因子(VEGF)在大肠癌标本肿瘤组织(T)与远癌切端正常组织(N)中的表达，及其与大肠癌临床分期的关系。方法：本实验采用逆转录-多聚酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法，在半定量水平上，分别检测33例大肠癌肿瘤组织标本(T)与远癌切端正常组织(N)中VEGF在转录水平(mRNA)的表达；同时应用免疫组织化学S-P法测定大肠癌标本肿瘤组织(T)与远癌切端正常组织(N)中微血管(MVD)的数值；使用Western Blot方法测定VEGF蛋白在肿瘤和距肿瘤最远切端大肠标本的表达，用统计学分析各检测结果与临床指标的关系。结果：1．大肠癌组织中VEGF在转录水平和翻译水平的表达均高于其在远癌切端正常组织的表达。2．大肠癌组织中VEGF在转录水平和翻译水平的表达与大肠癌组织中MVD的数值、淋巴结转移、原发肿瘤浸润深度及Dukes分期呈正相关。3．大肠癌组织中VEGF在转录水平和翻译水平的表达与大肠癌病理分型及分化程度无关。4．大肠癌组织中VEGF在转录水平和翻译水平的表达呈正相关。5．在远癌切端正常组织中，VEGF在转录水平和翻译水平的表达均呈正相关。6．大肠癌组织中MVD的数值高于在远癌切端正常组织中的MVD数值。7．大肠癌组织中MVD的数值与淋巴结转移及Dukes分期呈正相关，与原发肿瘤浸润深度、大肠癌病理分型及分化程度无关。结论：1．大肠癌肿瘤组织中VEGF的高表达及与肿瘤淋巴结转移、浸润深度及Dukes分期正相关，提示其在大肠癌侵袭转移中发挥重要作用。2．VEGF对MVD具有调节作，VEGF促进微血管生长。而大肠癌组织中MVD的数值与淋巴结转移及Dukes分期呈正相关，说明恶性肿瘤通过调节肿瘤血管生成来完成其恶性生物学行为。3．肿瘤血管生成依靠血管调节因子的作用，在正常组织中，VEGF呈正常表达；在大肠癌肿瘤组织中，VEGF呈高表达，肿瘤血管生成开始。
参考文献：
[1]. 大肠癌血管生成及p53基因对其调控作用的研究[D]. 钟世顺. 第一军医大学. 2001
[2]. △Np73基因对大肠癌侵袭性的影响及其反义基因对大肠癌的治疗作用研究[D]. 吴红涛. 第叁军医大学. 2008
[3]. 腺病毒5型E1A基因绿色荧光蛋白真核表达载体的构建及其对大肠癌治疗作用的研究[D]. 张学斌. 吉林大学. 2006
[4]. 抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及其体内外抑瘤作用[D]. 徐晓红. 吉林大学. 2010
[5]. VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸治疗大肠癌的实验研究[D]. 李瑞. 第一军医大学. 2007
[6]. KDR启动子驱动双自杀基因CD/TK对大肠癌SW480细胞杀伤作用的实验研究[D]. 刘志毅. 吉林大学. 2008
[7]. 大病理切片下大肠癌浸润转移的组织形态和生物机制研究[D]. 林书瀚. 广西医科大学. 2018
[8]. 血管内皮细胞生长因子与大肠癌临床分期的研究[D]. 左锋. 天津医科大学. 2007
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