高秀丽[1]2004年在《基因芯片检测转基因植物方法学的建立》文中指出转基因技术的发展给人们的生活带来了更多的机遇。通过生物技术可使品种改良如产量增加、品质提高、抗性(抗虫、抗旱、抗病、抗逆)增强等，但200多年来的工业文明告诉人类，科学是一把双刃剑，在给人类带来无限益处的同时，也引起了人们的担忧。从转基因技术诞生至今，人类一直进行着有关转基因技术的食品安全、环境风险、生态安全、社会伦理道德以及国际经济和政治安全等一系列问题的思考及争论。因此，转基因植物的检测的愈发重要，只有准确地检测转基因食品，才能有效的对上市的转基因食品进行监控。 本论文建立了用基因芯片检测转基因植物的方法，利用基因芯片信息量大的特点，能同时对转基因植物中的启动子、终止子、报告基因进行检测。和PCR这些传统检测转基因植物的方法相比，具有灵敏度高、特异性高，操作简便、快速，自动化程度高及结果准确率高等特点。 和以往基于杂交检测原理的基因芯片不同，我们探讨了基于引物延伸原理的芯片检测方法。利用此种基因芯片对转基因样品进行检测，能够实现样品扩增、标记、检测的一体化，大大缩短了检测时间，也为目前基因芯片中大片段待测样品和小片段探针杂交的技术难题提供了一种新的思路。我们利用此种芯片实现了对质粒pCAMBIA1301中所含的四个基因GUS、35S启动子、hpt、aadA的特异性同步检测。 我们还讨论了利用微测序基因芯片来检测转基因植物，基于微测序检测原理的基因芯片，不仅通过探针和目的片段杂交时的热稳定性来区分样品，还利用了DNA聚合酶的特异性延伸来对样品进行检测，因此理论上具有更高的特异性。我们初步利用质粒pCAMBIA1301中GUS、35S启动子、hpt、aadA基因的PCR产物作为检测的对象，实现对这几个基因的特异性检测，为以后直接利用质粒或基因组DNA作为检测对象奠定了基础。 通过本论文的研究表明，基因芯片是一种可行有效的转基因植物检测方法，具有广阔的应用前景。
杜亚楠[2]2018年在《基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法生物基因定性、定量、高通量检测技术研究》文中进行了进一步梳理检测食品和饲料中的转基因成分和致病菌在原料控制、食品产业、食品销售中尤为重要。而传统的生物基因定性、定量检测技术每次只能检测一种生物基因,而对于成分复杂的核酸样品,需要采用多种方法、进行多次实验才能确定,费时、费力、成本高。虽然常规多重PCR已应用于同时检测多种生物基因,但在同一反应中,经常会优先扩增短片段,并且同时扩增多个目的基因的效果常常很差。而且常规多重PCR通过电泳进行检测,只能定性,不能定量,通量有限。实时荧光定量PCR技术可以通过标准曲线对模板进行定量分析,但因其有限的检测通道,检测通量不高。基因芯片技术可以实现对核酸样品的高通量检测,但由于定量效果不好,制备过程复杂,费用高昂等缺点并没有得到广泛的应用。因此,研究一种可以同时对多种核酸样品进行定性、定量和高通量检测的方法就显得非常重要。我们将微滴PCR技术与荧光标记技术结合起来建立了一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法生物基因定性、定量、高通量检测方法。微滴PCR技术是将反应水相逐滴地加入油相中,形成均一的“油包水”乳化剂,包含109个油包水的微滴,每个微滴都可以作为一个微反应器,独立地平行地进行PCR扩增。微滴PCR技术,提高了PCR反应的通量,由于每个微反应器中只含有1-2个模板,因此避免了模板与模板之间的干扰,同时降低了对宝贵的试剂和样品的消耗。本方法采用荧光标记技术和荧光酶标仪检测荧光基团荧光强度来实现多重微滴PCR多种扩增产物的定性、定量和高通量分析。在不同生物基因的特异性引物的5’端标记不同的荧光基团,经过微滴PCR扩增和产物纯化后,每一种微滴PCR产物都会被标记上特定的荧光。不同的产物由不同的荧光识别,通过荧光酶标仪荧光强度测定可以对实现不同生物基因的定性、定量分析。在同一个反应管中,每种DNA分子都由特定的的荧光标记,因此将微滴PCR与荧光分光光度法结合起来,可以通过384孔酶标板可以实现高通量检测。本研究以转基因玉米(BT176、GA21、NK603和TC1507)为实验材料对这一理论进行了验证。首先分别设计它们旁临序列的特异性引物,选择合适的荧光基团对各对引物的5’端进行标记,配制相应的微滴PCR反应液和乳液,反应液和乳液在搅拌子的作用下混匀形成微滴,经过微滴PCR扩增和产物纯化后,用酶标仪检测产物中相应荧光基团的荧光强度来同时对四种转基因玉米进行定性、定量分析。单重特异性实验表明,BT176、GA21、NK603和TC1507品系特异性引物和内标基因特异性引物的特异性均很好,无交叉反应。单重灵敏度实验表明微滴PCR偶联荧光分光光度法可检测低至0.5%的转基因玉米,灵敏度高。单重定量检测四种转基因玉米的检测限为103拷贝,且线性关系良好,说明微滴PCR偶联荧光分光光度法可用于转基因样品的定量检测。多重微滴PCR偶联荧光分光光度法实验表明,该方法的特异性很好,灵敏度很高,可用于定性和定量分析检测四种转基因玉米混合物。多重重复性实验表明,批内各个转基因玉米的扩增变异系数都在3%以内,说明该研究中建立的实验方法是稳定可靠的,批间各个转基因玉米的变异系数都在15%以内,同样说明了本研究中建立的实验方法的重复性很好。模拟样品检测实验结果表明,模拟百分含量的四种转基因玉米经过微滴PCR扩增后进行荧光值测定,得出的GM含量基本与事先预混的样品的理论值接近,因此,该实验方法可实际应用于转基因玉米的定量和百分含量分析。通过以上实验进行验证得出,利用多重微滴PCR偶联荧光分光光度法可实现四种转基因玉米(BT176、GA21、NK603和TC1507)的定性、定量和高通量检测。以食源性病原菌为实验材料对微滴PCR偶联荧光分光光度法这一技术进行重演性分析。重演性分析实验表明,以转基因玉米为实验材料建立的基于重微滴PCR偶联荧光分光光度法可成功应用于四种食源性病原菌的定性、定量和高通量分析。重演性结果可以说明,本研究中建立的多重微滴PCR偶联荧光分光光度法可以用于所有生物基因的定性、定量和高通量检测。本研究采用的引物荧光标记技术对靶基因的大小和序列没有要求,是根据标记的荧光基团进行识别的,只要引物特异性好,能特异性扩增靶基因,微滴PCR产物就能被识别。这对于DNA序列同源性很高,保守区很短的多种基因同时检测优势尤为明显。采用荧光酶标仪对标记后的微滴PCR产物进行检测非常快速,检测一种基因只需1秒钟时间。Thermo Varioskan Flash多功能酶标仪的激发波长范围为200-1000 nm,对荧光基团的激发波长和发射波长进行适当调整,可同时检测20种荧光标记物,使用384孔酶标板,则一次可检测6000多种基因。微滴PCR偶联荧光分光光度法提高了目的基因检测和分析的通量,具有方便、快速、成本低廉、易于推广、环境污染少等优点,可用于所有生物基因的定性、定量和高通量检测。
马路遥[3]2013年在《环介导等温扩增技术检测转基因油菜RT73》文中进行了进一步梳理目前在国际市场中，转基因油菜频繁地进入我国，不规范管理极容易引起食品安全和环境安全问题。目前检测转基因的方法技术中，最普遍的是检测是否含有外源插入基因的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法和实时荧光PCR技术（real time PCR）。鉴于开展TaqMan实时荧光PCR检测需要相对较高的技术要求和设备要求，并不适用于其他监管要求相对较低的地区，因此目前急需制定在检验检疫一线的基层实验室能够普遍适用的快速、简便、准确的标准检测方法。2000年，日本荣研化学株式会社的Notimi T博士在PCR技术的基础上发明了另一种扩增技术-环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamnlification，LAMP)。该扩增过程需要四对引物，识别靶序列的六个特定区域，在链置换聚合酶的作用下，恒温条件即可完成扩增反应。相对于普通PCR近乎2个小时的反应时间，LAMP反应仅需要30～60分钟，扩增产率在一个小时内可以达到1.0×109～1.01010倍，扩增的结果用肉眼就可以直接观察。LAMP具有特异性高，扩增产率高的优点，而且不需要PCR仪和昂贵的试剂，适用于在基层使用，在普通的实验室具有很好的应用前景。本研究项目在前期LAMP研究的基础上，将该检测方法应用于转基因油菜RT73品系的检测上。实验针对RT73品系外源基因和内源基因交汇处序列以及内源序列E9分别设计RT73特异引物和内参引物；建立并优化LAMP检测转基因油菜RT73反应体系；确定引物的特异性、灵敏度、稳定性；在室内验证部分，将LAMP法和实时荧光PCR法从稳定性、灵敏度、特异性、检测时间、判读方法等几个方面对两种方法进行对比分析。LAMP方法检测转基因油菜含量≥0.5％时稳定性良好，灵敏度0.01％（相当于0.01ngDNA），定性检测限0.1％，特异性100％，实时浊度法检测时间30min～40min，染色法仅需10min左右。LAMP方法的检测结果通过实时浊度仪检测方法、染色法、目视法叁种途径进行判读，并相互补充、相互验证。实时荧光PCR检测转基因油菜RT73的重复性极佳；灵敏度为0.01％，相当于0.01ng的转基因油菜RT73DNA，与LAMP法的灵敏度相同；特异性达100％；检测时间100min左右，较LAMP耗时；结果主要根据扩增曲线的形状进行判读。LAMP法相对于实时荧光PCR具有快速、结果判读简便的优势，灵敏度和实时荧光PCR相同，但是用方法检测低转基因含量（≤0.01%）的样品的稳定性和重复性有待于进一步发展和完善。LAMP技术的缺点是其过高的灵敏度致使极少量的基因污染就会导致实验假阳性，因此在实验室进行LAMP实验时务必要小心谨慎，杜绝扩增产物污染。LAMP技术有望代替耗材高昂的实时荧光PCR，作为进出境口岸检验检疫部门检测转基因样品的新方法。
王琴芳, 彭朝辉, 张哓志, 陈培拉, 岳文[4]2004年在《2020年中国生物科学和技术发展研究》文中指出一、农业领域的生命科学技术分子生物学的诞生及现代生物技术的兴起是20世纪生命科学领域最伟大的事件。在世纪之交,基因组学研究的一系列突破又推动生物技术进入了更加迅猛发展的新阶段。包括植物、动物和微生物生物技术在内的农业生物技术已经成为新的农业科技革命的强大动力,不仅能在21世纪头20年全面建设小康社会,加快实现传统农业向现代农业跨越发展中发挥重要作用,而且将成为21世
黄鹂[5]2007年在《白菜叁种雄性不育系与保持系花蕾转录组差异分析及叁个花粉发育相关基因功能鉴定》文中认为利用植物雄性不育特性来选育雄性不育系是作物杂种优势利用中简化制种程序、降低制种成本的重要手段。十字花科作物是杂种优势利用最为普遍的一类作物，雄性不育系(简称不育系)是其生产一代杂种的理想系统。但植物雄性不育产生的机理极其复杂，至今尚未完全解开。花粉败育是植物雄性不育发生的表型体现，弄清花粉发育的全过程和分子机理是研究雄性不育的基础和关键所在。花粉发育涉及众多基因的表达调控，从转录组入手分析花粉发育突变体是获得花粉基因动态表达的途径之一，并可获得较大数目的花粉发育相关基因，有助于在整体水平上理解花粉发育的特征和花粉发育的分子调控机制。本文在获得共享同一保持系(核不育两用系的可育株系)的白菜(Brassica campestris L．ssp．chinensis Makino，syn．B．rapa ssp．chinensis)‘矮脚黄’核不育(‘Aijiaohuang’genic male sterility，ajhGMS)两用系‘Bcajh97-01A／B’、‘Polima’核质互作不育(polima genic-cytoplasmic male sterility，polG-CMS)系‘Bcpol97-05A’以及'Ogura'细胞质不育(Ogura cytoplasmic male sterility，oguCMS)系‘Bcogu97-06A’材料体系的基础上，采用扩增互补脱氧核糖核酸片断长度多态性(complementary deoxyribonucleic acid amplified fragment length polymorphism，cDNA-AFLP)及拟南芥基因芯片分析其花蕾转录组差异，对花粉基因表达谱进行系统分析，研究不同雄性不育遗传模式的基因突变导致下游系列基因表达变化的异同，为建立不同雄性不育遗传模式植物花粉基因表达谱的基本框架奠定基础，并鉴定出一批白菜花粉发育相关基因。进而采用反义RNA或RNA干涉(RNAinterference，RNAi)技术，对细胞壁合成与调控相关的两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)基因BcMF2(Brassica campestris male fertility 2)和BcMF9(Brassica campestris male fertility 9)，以及一个未知功能的新基因BcMF10(Brassica campestris male fertility 10)进行功能验证，从形态学、分子生物学、细胞学等方面入手鉴别叁个基因在白菜花粉发育过程中的作用机制。同时，从基因结构、表达特点、作用方式等方面，比较了白菜花粉表达的PG基因家族成员BcMF2、BcMF9和BcMF6(Brassica campestris male fertility 6)的异同。取得的主要结果如下：(1)形态和细胞学观察发现‘Bcajh97-01A’为雄性减数分裂的胞质分裂突变体mmc，对应基因MMC可能编码特异作用于雄性减数分裂的蛋白质。形态和细胞学观察发现，ajhGMS两用系不育株系‘Bcajh97-01A’与可育株系'Bcajh97-01B'的差异仅表现在花粉花药发育上，‘Bcajh97-01A’小孢子在减数分裂末期的胞质分裂中出现异常，不能形成胞间壁而导致四分体形成及后续的花粉发育各过程受阻，最终引起花粉败育。遗传学分析表明该不育性状由单基因位点控制，因此，‘Bcajh97-01A’实际上是一个受单基因位点控制的雄性减数分裂的胞质分裂突变体mmc(male meiotic cytokinesis)，其对应基因MMC可能编码一个特异与雄性减数分裂核分裂完成后的胞质分裂相关的蛋白质。(2)利用cDNA-AFLP技术结合拟南芥基因芯片分析白菜不同不育系之间及与其共同保持系之间的花蕾转录组差异，发现不同遗传模式不育系花蕾基因表达有相似之处，但不尽相同。利用cDNA-AFLP技术及拟南芥ATH1基因芯片，对白菜ojhGMS‘Bcajh97-01A’、polG-CMS‘Bcpol97-05A’和oguCMS‘Bcogu97-06A’，以及它们共同的保持系‘Bcajh97-01B’进行了花蕾转录组比较分析，发现不同的不育基因作用下均引起花蕾正常转录组的巨大变化，不育基因下游众多基因的表达受到抑制，也有相当一部分的基因被激活或表达上升，但作用的不育基因不同，引起的下游基因表达变化也不尽相同。与同一保持系‘Bcajh97-01B’相比，检测到在‘Bcajh97-01A’花蕾中上调表达基因93个、下调表达基因158个；在‘Bcpol97-05A’花蕾中上调表达基因174个、下调表达基因212个；在‘Bcogu97-06A’花蕾中上调表达基因196个、下调表达基因242个。其中。在叁种不育系中共同下调表达的基因有37个，上调表达的24个；‘Bcajh97-01A’和‘Bcpol97-05A’共同下调和共同下调表达的基因各5个；‘Bcajh97-01A’和‘Bcogu97-06A’共同下调表达基因为70个，共同上调表达基因9个；‘Bcpol97-05A’和‘Bcogu97-06A’共同下调表达基因7O个，共同上调表达的基因45个。(3)通过差异表达基因功能分类，发现许多花粉花药发育相关基因功能未知，白菜不同不育系与保持系的花蕾转录组差异分析扩充了植物花粉表达或特异表达基因的数目。对在叁种不育系与其共同保持系花蕾转录组中检测到的差异表达基因进行功能分类，发现约50％的基因功能未知。基于叁种不育系和保持系花蕾的差别仅表现在花药发育和花粉形成上，在不育系和保持系花蕾中差异表达的基因最可能与花粉花药发育相关。我们发现的这些差异表达基因在一定程度上扩充了植物花粉花药表达和特异表达基因的数目。(4)基于基因功能分类对不同不育系与保持系花蕾基因表达差异进行的分析表明，不同遗传模式花粉花药转录组尽管具有相似的模块，但具有不同的组成特征。对差异表达基因进行功能分类发现，不育系与保持系差异表达的叁组基因可分为大致相同的功能类别，但每一功能类别在每组差异基因中所占的比例不尽相同。在叁种不育系花蕾中下调均较多的已知功能的基因与转运通道、蛋白质代谢、电子传递和能量途径、防卫和胁迫反应相关，上调均较多的基因与转运通道、转录调控和普通新陈代谢相关。除此之外，‘Bcajh97-01A’与‘Bcogu97-06A’在花粉花药基因表达上具有更大的共性，在两者花蕾中均下调表达的基因中，细胞壁合成与调控基因排在第一位，细胞骨架蛋白及信号转导相关基因也占了较大的比例，而转录相关基因的比例较小；两者下调表达的基因中，蛋白质代谢相关基因均比较多。‘Bcajh97-01A’与‘Bcogu97-06A’的花蕾转录组的组成特征与拟南芥花粉转录组特征较一致。相比之下，‘Bcpol97-05A’花蕾转录组的组成成分与其他两种不育系有较大的差别。突出表现在细胞壁合成与调控基因、细胞骨架蛋白基因以及信号转导相关基因在不育系花蕾中占较大的比例，而保持系与其相比，这叁种类别基因的表达并不占优势，反而更少。由此可见，不同遗传模式花粉花药转录组尽管具有相似的模块，但组成特征各异。(5)时空表达模式分析发现叁种不育系与其共同保持系花蕾差异表达的基因具不同的表达动态。对27条在叁种不育系和保持系花蕾中差异表达的片段进行了时空表达模式分析，发现大多数差异片段所代表的基因表达在小孢子有丝分裂前后开始被检测到，在花粉成熟过程中继续积累，但在不同组织和发育阶段中的表达水平不尽相同。此外也有在花粉发育早期就检测到表达的基因。我们的研究结果证实了花粉花药发育中的基因表达调控是极其复杂的。在花粉花药发育的不同时期表达或不表达，以及表达水平有序地发生变化都是与花粉花药正常发育、实现其功能所需相对应的。我们的研究为明确白菜花粉花药发育不同时期的基因群作出了有益的探索。(6)表达和功能分析发现BcMF2可能是一个与花粉内壁发育相关的新PG基因。对本实验室前期从‘Bcajh97-01B’花蕾中分离得到的PG基因BcMF2进行时空表达模式分析，发现其转录本最早在四分体时期的花蕾中开始出现，随后在单核花粉粒时期的花蕾中表达量达到最高，之后，随着花粉发育的进行表达量逐渐降低直至花粉成熟，表明其属于花粉表达“早期”基因。利用反义RNA技术研究BcMF2的功能，发现BcMF2表达受抑制的转基因植株花粉体外正常萌发率大幅度降低。约80％的花粉管生长到一定程度后顶端膨大形成泡状结构，花粉管能穿过柱头组织，但在花柱道中的生长停止。进一步观察显示转基因植株花粉畸形，萌发沟的数目及分布不规则，萌发沟在形成过程中位置和数目紊乱，花粉粒内壁异常增厚。推测BcMF2表达受抑制影响了花粉内壁中果胶的动态代谢平衡而导致萌发沟及花粉粒内壁发育的异常。BcMF2与已知的在花粉发育早期起作用的PG基因没有序列及表达特点的相似性，因此它可能是一个新的在花粉发育早期表达的PG基因。(7)表达和功能分析发现分离获得的另一个白菜PG基因BcMF9可能参与花粉内壁和外壁的发育。分离获得在可育株‘Bcajh97-01B’花蕾中特异表达的差异片段BBS13／BPO023的全长序列BcMF9，发现该基因具有典型的PG基因结构特征。分子进化分析表明其属于花粉表达或特异表达的PG基因类群。时空表达模式分析显示BcMF9属于花粉表达“晚期”基因，因其表达最早出现在四分小孢子中，在单核小孢子中开始增强，然后一直持续较高水平的表达直到花粉成熟。BcMF9的转录本亦在绒毡层中出现，从四分体时期开始直到绒毡层降解退化，一直在绒毡层细胞中维持很强的表达信号。转反义BcMF9的植株花粉离体正常萌发率明显降低，约81％的花粉萌发时花粉管爆裂。花粉管能穿过柱头组织，但不久便停止生长。扫描电镜和透射电镜观察显示，BcMF9表达受抑制产生外壁网纹浅的畸形花粉，花粉粒萌发沟处内壁增厚异常，萌发沟的位置和数目紊乱，花粉发育晚期外壁的覆盖层和基粒棒部分脱落，含油层外溢，说明BcMF9可能参与花粉壁的发育。此外，发现转反义BcMF9植株花药绒毡层降解速度加快，绒毡层发育发生异常前的小孢子发育正常，而异常后的花粉外壁发育受影响。推测BcMF9表达受抑制可能破坏了绒毡层细胞的程序性死亡过程，启动了另一个死亡途径，加速了绒毡层的解体。绒毡层正常程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)的破坏，导致其向花粉外壁输送物质过程的改变，从而影响了花粉壁的正常发育。但由于BcMF9编码的蛋白在其N端有一段信号肽序列，而它的表达首先出现在四分体时期的绒毡层和小孢子中，且在绒毡层中的表达信号要比在小孢子中强。因此推测其功能发挥还有另一个可能：BcMF9在绒毡层表达，表达产物分泌到花粉囊腔，进而在花粉壁的发育中直接起作用。(8)比较分析发现PG基因家族成员BcMF2、BcMF6和BcMF9在花粉发育中可能扮演各自不同的角色。从基因序列特征、表达模式特点、基因进化关系及生物学功能等方面比较叁个花粉发育相关的PG基因BcMF2、BcMF6和BcMF9的异同，发现尽管3个PG基因的表达所出现的发育阶段一致，但叁者在各个发育阶段的表达量及表达变化的趋势各不相同。叁者在十字花科物种中的进化特点也不完全一致。3个PG基因的表达受抑制引发了类似的结果，但并不尽相同，说明它们在花粉发育中所起的作用及作用模式可能各异。(9)分离获得在‘Bcajh97-01B’和‘Bcpol97-05A’花蕾中高水平表达的基因BcMF10，序列特征分析提示其可能与信号转导途径相关，RNAi研究发现BcMF10表达受抑制导致花粉萌发异常。分离获得在‘Bcajh97-01B’和‘Bcpol97-05A’花蕾中高水平表达，但在‘Bcajh97-01A’和‘Bcogu97-06A’花蕾中沉默的基因片段BBS31／BPO079的全长序列BcMF10。利用生物信息学分析发现预测的BcMF10氨基酸序列中具有可能与细胞增殖、分化和PCD相关的蛋白激酶C磷酸化位点，参与调控信号转导相关的蛋白激酶的酪氨酸磷酸化位点，及其它与细胞内信号转导、蛋白定位以及黏附等过程有关的位点。推测BcMF10编码的蛋白可能在花粉发育过程的信号转导中发挥重要作用。利用RT-PCR(reverse transcriptase PCR，反转录PCR)和原位杂交分析了BcMF10的时空表达特点，发现其转录本最早出现在‘Bcajh97-01B’花药发育早期的花粉母细胞和绒毡层细胞中，随后在减数分裂时期的小孢子和绒毡层中表达量进一步提高，之后随着发育的进行，表达量逐渐降低，但表达部位没有改变，在花粉成熟期消失，属于花粉表达“早期”基因。通过构建含BcA9绒毡层特异启动子的BcMF10 RNAi表达载体，利用转基因阻断内源BcMF10的表达，发现75％左右的转基因植株花粉不能正常萌发，约15.6％的花粉能长出花粉管，但花粉管长到一定长度时顶端爆裂，正常萌发率只有10.5％，说明BcMF10表达受抑制影响了花粉的正常萌发。但与通常发现的花粉管一伸出萌发孔即发生爆裂的现象不同，BcMF10表达受抑制植株花粉管能长到一定长度，然后将内容物从顶端喷出，花粉管生长停止，推测BcMF10也可能与花粉壁的发育相关。根据BcMF10预测蛋白质的结构特征及其在早期绒毡层细胞和小孢子中共表达的特点，可以认为其可能作用于细胞壁发育过程中绒毡层与花粉的信号传递过程。
缪卫国[6]2009年在《转hpa1_（Xoo）基因棉花抗病虫防卫反应与全基因组转录谱分析及棉花角斑病菌hpa_（Xm）基因的功能》文中研究说明棉花是世界上重要的纤维作物,也是重要的油料来源。在许多植棉国家,棉花黄萎病、枯萎病是危害棉花的两大病害。从1993年以来,黄萎病在我国严重发生,发病面积占全国植棉面积的50%左右,每年损失皮棉约10万吨。目前尚无有效的方法控制该类病害的危害。通过植物基因工程,可以把优良抗性基因转移到植物体内,对植物进行定向改造,从而培育新的优良抗病品种,为棉花黄、枯萎病的有效防治开辟了新的防治途径。已经证明harpin是一类蛋白激发子,具有无毒、无公害和对环境友好等优点。先前研究表明喷施harpin能增强植物抗病、抗虫性,而内源表达harpin显示转基因植物(水稻、烟草、梨等)能抗多种病害。由此,通过基因工程方法将harpin编码基因hrp导入重要的经济作物棉花中,是否会使棉花获得各种抗性及其它有益表型呢?此外,harpin在分子水平上的作用机理和作用位点还不是很清楚,尤其在无胁迫下内源表达的harpin对植物的防卫、生长发育会产生怎样的影响?本研究将来自水稻白叶枯病菌的hpa1xoo基因转入棉花,使harpin的多种功能在棉花中得以表达,获得抗棉花黄、枯萎病等多种有益表型的转基因棉花株系,并力图解析harpin对植物的作用机理；与此同时,我们还从棉花角斑病菌(X. citri subsp. malvacearum)基因组中克隆了编码harpin的hpaXm基因。现将结果分述如下：利用含有农杆菌T-DNA区的重组质粒,结合花粉管通道技术,将hpa1xoo基因分别转化陆地棉品种中棉35(Z35)、海岛棉品种新海21等棉花品种,通过苗期的卡那霉素或除草剂筛选并结合室内和病圃枯萎病和黄萎病抗性单株筛选,获得了30份转基因材料。在卡那抗性植株筛选基础上,大部分转基因植株符合孟德尔遗传规律,即后代存在3：1或者1：3的分离。部分转基因株系到T6代就具有100%的纯合株系(如T-34部分单株株系后代)。同时采用农杆菌茎尖介导法,也获得携带有hpa1xoo基因的转基因植株。选择部分转基因植株进行加代选育,在棉花黄、枯萎病病圃进行了抗病性、农艺性状评价,以及采用生测法评价转基因植株的抗虫性。供试转基因材料中,针对棉花黄萎病,获得了抗病材料(系)8个,耐病材料(系)8个,病指范围在13.75%-38.49%,转基因材料病指均低于出发品种(Z35),Z35病指为45.34%。与Z35相比,转基因棉黄萎病平均发病率减少42.9%,病指减少7.35%-26.22%；枯萎病病指减少52.46%-59.02%；立枯病病指减少58.70%-59.24%。在抗虫性调查的初步结果中,部分转基因材料(如T-3、T-34)对棉铃虫表现出较好的抗性。饲喂T-34棉叶的棉铃虫发育明显迟缓,直至死亡,5天后棉铃虫死亡率为90.95%,而饲喂Z35棉叶的棉铃虫死亡率为12.20%。这些结果表明harpinxoo的表达赋予转hpa1xoo基因棉花抗病虫性。转基因抗病材料的棉铃有大、有小。生长前期,转基因植株的株高一般低于出发品种,但开花以后至成熟,转基因材料的生长逐渐与出发品种接近,与出发品种无显着性差异。转基因棉花生育期为120-121天,长于Z35(116天)。部分转基因材料在农艺性状方面优于Z35,如转基因株系T-33,在棉花吐絮期(2007),与Z35相比,无效枝数低了0.12个,有效桃数多了0.1个；转基因株系T-34果枝数比对照Z35多了0.1个。部分转基因材料田间吐絮较畅,纤维品质有所改善。2006年通过农业部棉花纤维检测中心检测,转基因材料T-33的纤维上半部平均长度为29.0mm,对照Z35的纤维长度为28.8mm；纤维整齐度方面,所有转基因材料(85%)都高于出发品种(83%)；马克隆值方面,所有的转基因材料为B级,对照Z35为C级。转基因株系T-34纤维伸长率为5.8%,而对照(Z35)的纤维伸长率为5.5%。因此,综合诸多性状,我们选择转基因植株T-34(或T-33)作为本研究的主要对象。从PCR扩增到目的基因(hpalxoo)的阳性植株中选择了T-34和T-33,作进一步的分子鉴定。PCR Southern blot和基因组Southern blot确定了hpalxoo已经整合到棉花基因组中,且具有至少3个拷贝,提取PCR检测均为阳性的植株的可溶性蛋白,进行了Western blot分析,在PCR阳性植株中可检测到harpinxoo蛋白的表达。RT-PCR结果同样证实了hpa1xoo在转录水平的表达。采用免疫胶体金定位技术,观察到harpinxoo免疫金颗粒主要分布在植物的细胞壁上,胶体金颗粒在转基因植物细胞壁上呈10-20粒簇状特异性分布,在叶绿体或线粒体上则未见到特异性吸附,这个结果说明harpinxoo在转基因棉花中作用位点是细胞壁。同时,采用PCR和Bt蛋白检测试纸条方法检测转基因材料中是否含有Bt基因及其编码蛋白,结果表明供检测的转hpa1xoo基因棉花对棉铃虫的抗性是由于取食表达harpinxoo 6勺植株引起的,而与Bt基因无关。表达harpinxoo转基因棉花材料T-34在田间和室内均对棉花黄萎病表现出较好的抗性,因此,我们进一步从细胞和分子水平上验证T-34对棉花黄萎病菌的抗性机理。通过T-34悬浮细胞与棉花黄萎病菌分生孢子共培养,转基因棉花T-34的悬浮细胞的生存能力显着高于其出发品种Z35。在无病原菌侵染时,T-34叶片的H202积累高于Z35,但未观察到肉眼可见的氧爆发(reactive oxygen intermediates, ROI)现象,说明T-34较Z35更易处于一种引发状态(Priming state),一旦遭到病原菌侵染,T-34叶片中的过氧化氢酶受到抑制,在T-34叶组织中可以观察到明显的氧爆发和微过敏(Micro HR)现象,H202含量也有较高的积累,并呈现病原菌与植物非亲和互作的双峰典型特征,而在Z35叶组织中没有观察到氧爆发和微过敏。与这种现象一致,通过Real Time-PCR检测,氧爆发和微过敏的标志基因ghAOXl、hsr203J及hinl等基因的相对表达量也显着高于出发品种。这些结果证明了,由于harpinxoo在转基因植物体中的表达,激活了植株对病原菌攻击的防卫反应,harpinxoo是植物与病原菌非亲合互作中必要的激发子。Harpin赋予转基因棉花多种抗性和多个有益的农艺性状表型,但是在无胁迫下harpin影响植株的分子模式还不清楚。为此我们使用棉花12K cDNA芯片,采用生物芯片技术,分析了harpinxoo转基因棉花(T-34)与其出发品种(Z35)的全基因组转录谱,从而使我们能够广泛理解harpinxoo是如何在转基因棉花中调控基因表达的。结果显示,与Z35相比,在T-34叶片中存在530个差异表达基因。这些差异表达基因中很多基因涉及过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)、水杨酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、生长素(auxin)、脱落酸(abscisic acid)和乙烯(ethylene, ET)等基本防卫反应途径。在转基因棉花中,Harpinxoo作为内源激发子,与受体作用或者直接作用于一些蛋白激酶,造成编码NADPH氧化酶、NAD泛素氧化还原酶、离子通道蛋白(如CLC-C)钙结合蛋白、苯丙氨酸裂解酶(PAL2)、植保素合成酶(如CHS)、MAPK激酶等蛋白酶的基因上调表达,并通过乙烯或生长素转录因子(如ERF、ARF)等进一步激活下游防卫和生长发育有关的反应。Harpinxoo在转基因棉花中调控生长素相关基因的表达符合生长素信号途径；同时,在LRR-PRKs途径中多个激酶编码基因的表达,表明LRR-PRKs在harpinxoo诱导的信号传导中也担任重要角色。通过对芯片上9个防卫相关基因采用定量或半定量PCR验证,显示芯片数据具有88.98%的可信度。经Realtime PCR检测,病原菌侵染后,6个防卫相关基因在转基因植株中超表达。这个结果进一步说明在无胁迫下harpinxoo的表达赋予转基因棉防卫水平高于其受体,并保持着基本的防卫水平,但在遭受病原菌胁迫下,harpinxoo的表达具有增强转hpalxoo基因棉防卫水平的能力。同时,差异表达基因中的共性上调和下调表达以及涉及能量产生和消耗途径的基因表达水平的提高,这些结果意味着在无胁迫下转基因植物体中维持着一种能量平衡,仅仅当病原菌侵染时才在植物体中产生高能量的需求。用转hpa1xoo基因棉花新鲜叶片饲喂棉铃虫,造成棉铃虫发育明显迟缓。为了更好地解析这一现象,将转基因棉花T-34和出发品种Z35叶片分别饲喂棉铃虫,提取棉铃虫幼虫RNA,利用和棉铃虫同属鳞翅目的家蚕的23K寡核苷酸(Oligo)探针,通过生物芯片技术,制作了其Oligo表达谱芯片。芯片结果显示检测到了2927个基因,T-34对Z35在转录水平上存在有872个差异表达基因,其中Ratio值大于2.0的上调表达基因有328个,Ratio值小于0.5的下调表达基因有544个。872个差异表达基因主要涉及13种生物功能,96个通路(pathway)。棉铃虫取食表达Harpinxoo的棉花叶片后,激发棉铃虫体内编码蛋白水解酶、细胞色素P450等的基因超表达,打破了离子调节体系和渗透压平衡体系,消耗棉铃虫的大量ATP,从而影响棉铃虫蛋白酶分解和合成、ATP合成等多个生物途径的正常代谢,造成棉铃虫不能很好取食。因此,采用芯片技术,通过异源家蚕oligo芯片信息的比对,初步解析了转hpalxoo棉花对棉铃虫的抗性机理,可能与棉铃虫取食后正常代谢受到干扰,影响发育有关。本研究结果为hpa1xoo,作为新的基因资源用于抗棉铃虫育种提供了初步证据,并为抗棉铃虫机理研究展示了新的途径。Xanthomonas campestris pv. malvacearum (E.F. Smith) Dye (Xcm)是引起棉花角斑病的病原。2006年该病菌学名更名为X. citri subsp. malvacearum nov. comb. nov. nom. nov. (Xcm)。在Xanthomonas中一些编码harpin的基因已经被克隆,但在Xcm中尚未有该基因克隆的报道。本研究首次报道了编码harpin like protein的hpaXm基因。用PCR技术从Xcm基因组中扩增了hpaXm基因。该基因具有402bp,其编码的蛋白为HpaXm,含有133个氨基酸,大小为13.3kD,GC含量为60.70%,富含甘氨酸,含量为21.80%,缺乏半胱氨酸。HpaXm的GST融合蛋白表达的最佳条件是IPTG0.05mM、37℃3h。纯化的HpaXm具有热稳定性,煮沸或未煮沸处理的HpaXm都能在烟草上激发HR.HpaXm能够增强烟草对TMV的抗病性,也能激发nprl、hsr203Jpr-la、pr-1b等防卫基因的表达。在Xcm基因组中,采用TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR)方法,在hpaXm左翼扩增到了与X. oryzae pv. oryzae中hrcC基因具有93%同源性的1826bp序列,命名为hrcCXm,但在hrcCXm与hpaXm之间有704bp的间隔序列；在hpaXm右翼,扩增得到了与X. oryzae pv. oryzae中hpa2基因具有89%同源性的630bp序列,命名为助a2Xm。在HpaXm蛋白序列中存在有两个Alpha helix区域。HpaXm可能拥有Coiled coil区域及亮氨酸拉链。通过完整地氨基酸序列及N端a-helix中13个保守的残基(H2N-SEKQLDQLLTQLI-COOH)进化树分析,HpaXm与HpaGXac、HpaXac进化关系要比与Hpa1Xoo和Hpa1Xoc更近。我们对HpaXm N端α-helix区域中含有两个heptad的多肽(39-LDQLLTQ-LIMALLQ-52)进行合成,生物活性测定表明其能在烟草上诱导HR；改变相应残基的该多肽衍生物HpaXmAT44C和HpaXmAM48Q,显示出HR活性减弱的表型。通过信号肽软件预测和GST检测实验,在HpaXm的N端可能具有潜在的信号肽,可能以sec-dependent pathway必出胞外。
李全芬[7]2011年在《转基因牛基因芯片检测方法的建立》文中研究表明转基因技术是把“双刃剑”在给人类带来经济和社会利益的同时,也引发了许多问题。因转基因动物是人类将所需要的优良基因转入受体体内所得,并非自然界本来存在,所以比自然界本来存在的生物更具生存优势和竞争力,同时也加大了它的潜在威胁。短期内转基因动物对人类健康的直接影响较小,但是长期、潜在的影响还很难定论；其可能还会通过跨物种感染影响生态环境和生物多样性,因此转基因动物的安全性有待进一步考察。随着转基因技术的发展,转基因动物商品化的范围会逐步扩大,为做到防患于未然,有必要进行科学的检测。目前GMO的检测主要集中在转基因作物及其产品方面,转基因动物的检测体系还未建立完善,因此对转基因动物及其产品检测方法的研究在口岸未来的监测工作中具有一定的意义。转基因产品的检测目前主要是以PCR为主的DNA检测方法和蛋白质检测方法,一次只能检测一个基因或一种样品,已不能满足现阶段转基因产品种类和数量不断增多的现状。寡核苷酸基因芯片因具有高通量、微型化的特点,可以对同一转基因样品进行不同方面的分析以及对多种转基因样品同时进行检测,适合转基因产品的检测本研究是应用基因芯片结合多重PCR的方法对转基因牛进行检测,首先根据能代表种属特异性的线粒体基因：牛线粒体16s rRNA基因(BOS mtDNA16s rRNA, BOS)、羊线粒体12s rRNA基因(Ovis mtDNA12s rRNA)、猪线粒体NADH5基因(Sus NADH5);和转基因动物常用的标记基因：新霉素磷酸转移酶编码基因(NPTⅡ)、绿色荧光蛋白编码基因(EGFP);以及特异的外源转入基因：人乳铁蛋白编码基因(Human Lactoferrin gene, hLF)、人-α-乳清蛋白编码基因(Humanα-Lactalbumin gene, ha-LALBA)基因、人溶菌酶编码基因(Human Lysozyme gene, hLYZ),应用DNA star、Primer 5.0、MEGA、DNAMAN、AnnHyb等生物学软件比对、筛选设计了8对符合多重PCR的特异性引物和16条特异性基因芯片70mer探针,均具有良好的特异性。通过对该方法扩增条件的优化,成功建立多重PCR方法。通过对多重不对称PCR上下游引物比例的优化,杂交体系、杂交条件的优化,洗涤条件的优化,建立了一种转基因牛检测型基因芯片,试验结果表明针对8种基因的16条特异性探针均得到了较好的杂交结果,特异性强,与转人防御素3基因奶牛样品、转omega-3基样品等均无交叉反应,灵敏度高,检测极限达1pg,适合转基因牛的检测。本研究建立了一种转基因牛基因芯片检测方法,不仅可以对牛、羊、猪进行动物源性的检测,还可以筛查转基因牛样品,又可以进一步确认转基因牛外源基因。本研究是对转基因动物及其产品检测技术的一种初步探索。此方法可以为转基因动物及其产品的检测提供技术储备,为相关领域检测技术的发展奠定基础。
陈伟庭[8]2016年在《转基因番木瓜检测用阳性标准分子的构建与应用》文中研究说明自1996年转基因作物开始商业化种植以来,全球的转基因作物产业飞速发展。同时,转基因生物和产品的安全性备受关注,为了满足消费这的知情权、选择权和加强对转基因生物的研发与应用的安全管理,各国都采取相应的措施对转基因作物和产品进行监管。建立准确的转基因检测方法是转基因生物安全管理的前提,而转基因标准物质是转基因检测技术中不可或缺的物质基础。转基因标准质粒分子作为其中一种标准物质,被业内成为“转基因金标准物质”。转基因番木瓜Event“55-1”和“华农1号”早在1998年和2006年就相继开始商业化种植,但是我国尚未有相应的检测标准,同时也缺乏标准物质。本研究是以Event“55-1”和“华农1号”两种转基因番木瓜为研究对象,尝试构建适合转基因番木瓜检测用的阳性质粒标准分子,并检测其在转基因检测中的应用性,为转基因检测的阳性标准物质的开发和应用提供参考。同时采集田间种植的番木瓜和市售的番木瓜产品,以构建的阳性标准质粒分子为阳性对照,对样品进行番木瓜的转基因成分检测。本研究取得的主要实验结果如下:1、通过对公共数据库的搜索和文献查询,经过评价,找到并确认用于构建质粒分子的核苷酸序列。2、成功构建了含有木瓜内标准基因papain、Chy、夏威夷转基因番木瓜Event 55-1特异序列我国自主研发的转基因番木瓜“华农1号”特异序列的阳性质粒标准分子。3、对阳性质粒分子进行灵敏性、特异性的分析和替代性分析,分析结果表明阳性质粒分子具有较好的特异性,可替代基体物质作为阳性对照,定性PCR检测限为1000拷贝。4、以番木瓜叶片、青皮番木瓜干、番木瓜果肉及番木瓜种子和果脯等为检测对象,检验阳性质粒分子在转基因番木瓜检测中的实际应用情况,同时对转基因番木瓜的田间种植,转基因番木瓜产品在市场的销售情况做一个初步调查。结果表明,阳性质粒分子可替代基体标准物质作为阳性对照。
徐景升[9]2004年在《转基因农产品检测基因芯片研制》文中认为随着转基因技术的发展和应用，转基因作物的种类和数目越来越多，种植面积逐年增加。转基因生物安全问题引起了广泛的争论，各国政府纷纷制定相关政策法规，加强对转基因农产品的安全管理，开展转基因生物检测技术的研究。目前，转基因农产品检测技术主要以PCR技术为基础，检测外源基因序列。PCR技术简单方便，灵敏度高，但无法实现转基因农产品高通量检测。基因芯片技术的发展为转基因农产品高通量检测提供了技术平台。 本研究利用基因芯片技术，开展了有关转基因农产品检测芯片的研制工作，主要结果如下： 1．改良了传统的CTAB方法，成功地从供试大豆种子及豆粕中提取出了高质量的DNA。建立了转基因大豆单基因PCR检测和MPCR检测体系，其中MPCR检测体系的建立提高了转基因大豆的检测效率。 2．自制聚赖氨酸片基，并与进口片基进行打印测试比较，结果表明，自制片基与进口片基质量相同，完全满足制作基因芯片的要求。自制片基使片基制作成本降到原来的1／5，大大节省了实验开支。 3．利用自制的片基制作基因芯片，同时优化了基因芯片的制作参数，确定了最佳点样液种类和上样体积；深入研究了激光对荧光染料的漂白作用，量化了激光对荧光染料的漂白效应；比较了不同PMT值下荧光增益与信噪比之间的关系。 4．收集了商业化转基因作物常用转基因元件的序列信息，确定了这些元件的保守区段。然后通过各种渠道收集含有这些转基因元件的克隆载体或表达载体，并设计了相应PCR引物扩增保守区段，将其制备为探针。用机械手将这些探针点到聚赖氨酸包被的载玻片上，制备了转基因检测芯片。 5．利用本研究制作的转基因农产品检测芯片，成功地从转基因大豆中检测出外源基因序列。结果表明，基因芯片不仅能够进行高通量的检测，而且检测效率大大高于MPCR。同时，由于基因芯片建立在分子杂交基础上，检测结果可信度大大提高。
吴影[10]2006年在《Bt基因的组织特异性表达及转基因水稻分子检测方法的研究》文中研究表明自转基因作物问世以来，转基因产品的安全性问题一直是人们关注的焦点。水稻作为最重要的一种粮食作物之一，其转基因工作早在上个世纪90年代就开始了，但其商业化进程却相对迟缓，这主要缘于其潜在食用安全性问题未能得到有效的解决。为此，本文拟从转Bt基因水稻组织特异性表达技术和转基因水稻检测技术两方面入手进行初步研究，以期为转基因水稻食用风险的降低和商业化进程的推进做些有益探索。论文工作取得的主要的研究结果如下：1．借助生物信息学手段，参照拟南芥基因序列，筛选到六个水稻组织特异性表达启动子，经过RT-PCR组织谱筛选后得到两个可用组织特异性表达启动子TspⅠ和TspⅡ，并对其序列和调控元件进行了初步分析。然后将克隆到的TspⅡ和35S启动子，插入到植物表达载体pYP-TspⅠ-GFP中，替换掉先期构建的TspⅠ启动子，调控GFP基因的表达，以便转化水稻后监测启动子的组织表达情况。2．以“克螟稻”为材料，利用PCR技术克隆到Bt全长基因，并将其构建到pYP-TspⅠ-GFP载体中替换了GFP基因，得到组织特异性植物表达载体pYP-TspⅠ-Bt。3．利用基因枪法，将构建的pYP-TspⅠ-GFP和pYP-TspⅠ-Bt表达载体导入“皖粳97”水稻材料中，经PPT筛选得到了分化的抗性愈伤组织。4．针对转基因水稻中常用的转基因元件，优化并建立了转基因水稻的定性PCR检测体系。研究结果表明，建立的PCR定性检测体系能够很好地从转基因水稻中检测出这些转基因材料特有的转基因元件。5．在定性检测的基础上，分别尝试用SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探针法对转基因水稻进行了荧光定量PCR检测，对检测的技术体系进行了初步探索，并成功地对自配已知浓度的转基因水稻进行了定量检测，检测值与实际设定值也较为接近。
参考文献：
[1]. 基因芯片检测转基因植物方法学的建立[D]. 高秀丽. 中国科学院研究生院（上海微系统与信息技术研究所）. 2004
[2]. 基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法生物基因定性、定量、高通量检测技术研究[D]. 杜亚楠. 上海师范大学. 2018
[3]. 环介导等温扩增技术检测转基因油菜RT73[D]. 马路遥. 吉林大学. 2013
[4]. 2020年中国生物科学和技术发展研究[C]. 王琴芳, 彭朝辉, 张哓志, 陈培拉, 岳文. 2020年中国科学和技术发展研究（下）. 2004
[5]. 白菜叁种雄性不育系与保持系花蕾转录组差异分析及叁个花粉发育相关基因功能鉴定[D]. 黄鹂. 浙江大学. 2007
[6]. 转hpa1_（Xoo）基因棉花抗病虫防卫反应与全基因组转录谱分析及棉花角斑病菌hpa_（Xm）基因的功能[D]. 缪卫国. 南京农业大学. 2009
[7]. 转基因牛基因芯片检测方法的建立[D]. 李全芬. 南京师范大学. 2011
[8]. 转基因番木瓜检测用阳性标准分子的构建与应用[D]. 陈伟庭. 仲恺农业工程学院. 2016
[9]. 转基因农产品检测基因芯片研制[D]. 徐景升. 福建农林大学. 2004
[10]. Bt基因的组织特异性表达及转基因水稻分子检测方法的研究[D]. 吴影. 安徽农业大学. 2006
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