王立敏1 梁显泉2 龚修云3 刘素琴3 韦卫琴3 虞晓红3（1、贵阳市第一人民医院 550000；2、贵阳市金阳医院 550000；3、贵阳医学院附属医院 550000；
【摘要】目的：探讨深部痰涂片镜检在肺部真菌感染早期诊断中的临床意义。方法：采集2008 年3 月-2014 年1 月期间疑诊肺部真菌感染患者的深部痰及普通咳痰行真菌涂片镜检、培养，结合临床资料进行回顾性分析。结果：深部痰合格率91.59%，涂片直接镜检及培养的检出率分别为62.12%、61.67%；普通咳痰合格率35.37%,对应的检出率分别为45.38%、33.61%,两者比较前者合格率、检出率显著高于后者，有统计学意义（P<0.001）；深部痰涂片镜检与培养检出率有较好的一致性，无统计学差异（P>0.05）；临床诊断肺部真菌感染376 例，以临床诊断病例为标准，深部痰检的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为66.76%、97.79%、98.82%、51.55%，治疗有效率72.18%，相关死亡率27.82%。结论：痰检前涂片镜检筛查合格标本是提高痰检阳性率及可靠性的重要保障；合格深部痰涂片直接镜检可为肺部真菌感染患者提供早诊断依据，实现抢先治疗，尤其适合重症监护病房及基层医疗机构。
【关键词】深部痰 涂片直接镜检 肺部真菌感染（PFI）【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-7165（2015）11-0095-03Clinical Value of Deep sputum smear examination which in the early diagnosisand treatment of pulmonary fungal infection in intensive care unit patientsWanglimin1 Liangxianquan2 Gongxiuyun3 Liusuqin3 Weiweiqin3 Yuxiaohong3(The first peoples Hospital of Guiyang City，Guizhou,China 550002; The second peoples Hospital of Guiyang City，Guizhou,China 550003;The AffiliatedHospital Guiyang Medical college,Guizhou,China 550004)[Abstract] Objective: To evaluate the clinical significance that the deep sputum , s smear direct microscopic examination in the early diagnosis andantifungal treatment of pulmonary fungal infection. Methods: Collecting 512 cases patients, deep sputum and common sputum to take sputum smear directmicroscopic and fungal culture who are suspected pulmonary fungal infection during in 2008 march to 2014 january. Finally, combined with the clinicaldata were retrospectively analyzed. Results: Deep sputum qualified rate was 91.59%, significantly higher than The qualified rate of the ordinarysputum35.37%.Deep sputum smear microscopy and culture of direct detection rates were 62.12% and 61.67%, corresponding to the ordinary sputumdetection rates were 45.38% and 33.61%, Statistical analysis showed deep sputum positive rate is obviously higher than that common sputum ,s,(P <0.001).Deep sputum smear direct microscopy and culture positive rates were 62.12% and 61.67%, statistical analysis it is no significant difference (P >0.05). Finally376 patients were clinically diagnosed as pulmonary fungal infection, In cases of clinical diagnosis as the standard, the deep sputum examination sensitivity,specificity, positive predictive value and negative predictive value were 66.75%, 97.79%, 97.67%, 50.98%. The effective rate of treatment was 72.18%,mortality 27.82%.Conclusion: Sputum smear screening qualified specimens is an important guarantee to improve the positive rate of sputum and reliabilitybefore Sputum examination.The deep part of the qualified sputum smear direct microscopic examination can provide early diagnosis basis for these patientswith pulmonary fungal infection, and help achieve a preemptive therapy. This method is especially suitable for the ICU and grassroots medical institutions.Keywords: deep sputum smear direct microscopic examination pulmonary fungal infection (PFI)
近年来，随着社会的老龄化、广谱抗生素、危重患者生存时间及住院时间延长等因素，促使深部真菌感染的发生率及死亡率逐年增高，肺因其自身的解剖和生理特征居所有深部真菌感染的首位，占深部真菌病60%以上［1］，相关死亡率高达30-80%［2］。早诊断、早治疗是解决问题的关键。虽然新技术的不断研发及开展，但目前仍不能完全取代传统实验室检查方法。因此笔者对拟诊肺部真菌感染患者进行深部痰痰涂片直接镜检 、真菌培养，旨在探讨深部痰在肺部真菌感染早期诊治中的临床意义。
1、资料与方法1.1 研究对象以2008.3-2014.1 贵阳医学院附属医院急诊重症病房收治的疑诊肺部真菌感染患者【具有宿主因素(高危因素)之一的基础上，新近出现不明原因的发热或呼吸系统症状和体征，经积极足量、广谱抗生素治疗>4 天无效的患者。】为研究对象。
1.2 标本采集：1.2.1 深部痰的采集：根据病人实际需求情况利用纤支镜保护性防污毛刷或一次性无菌吸痰管采集研究对象深部痰（声门以下呼吸道分泌物），盛于一次性无菌培养杯，立即送检。注：上述两种操作前需告知操作的目的及意义，取得患者及家属同意及配合，对于同一病人在使用抗真菌药物前连续3 天采集痰标本；采集深部痰的全过程均需建立无菌观念，动作轻柔迅速警惕呕吐误吸、支气管痉挛；操作过程中注观察病人生命征变化等，若有不适立即停止，让病人休息再试行。
1.2.2 普通咳痰的采集：采集研究对象清晨痰，采集前清洁口腔，咳出第一、二口痰，采集后立即送检行真菌涂片及培养，作为深部痰的对照组。
1.2.3 合格痰标本的判断标准：痰标本直接涂片后于显微镜下观察，白细胞?25 个/LP 且鳞状上皮细胞?10 个/LP 为痰标本取材合格［3］。
1.3 实验方法：1.3.1 痰涂片直接镜检：涂片前先将载玻片于火焰上快速通过1-2 次焚化原有微生物，冷却后再将痰标本直接涂于载玻片上，加一滴载液（一般为10%KOH，必要时加刚果红或革氏染色液染色），盖上盖破片，轻压盖玻片驱除气泡，用棉签洗净周围的溢液固定数秒后放在显微镜下：筛查痰标本质量及痰细胞学镜检找真菌。
1.3.2 痰的真菌培养及鉴定：所有深部痰必须镜检筛查合格后再挑选合格标本行培养，普通咳痰不论镜检合格否均行培养作为对照。
采用直接培养法，按文献［3］的操作方法，超净工作台内酒精灯旁，把采集的标本直接接种于沙堡氏斜面培养基上，放置于28℃或36℃恒温箱内培养。然后每天观察生长情况，观察时间至少14 天，14天后仍未生长为阴性培养。培养阳性者根据菌落形态、外观、涂片镜检等形态学特征，初步分出多细胞（霉菌属）及单细胞（酵母样菌属），结合显色反应、生化反应及法国梅里埃微生物快速鉴定（API）/ATB 自动生物检测仪进行进一步鉴定。
1.4 收集临床病例资料，结合临床资料及肺部真菌感染诊断标准［4］进行回顾性分析。
1.5 统计学方法：对计数资料结果以χ2 检验及率进行描述，结果以SPSS20 软件系统分析，以P<0.05 为差异显著，有统计学意义。
2、结果2.1 痰标本直接涂片及培养的结果共采集痰标本1918 例次：深部痰1442 例次（合格痰1320 例次，占91.54%）；普通咳痰476 例次（合格痰167 例次，占35.08%）。检测深部痰1320 例次，深部痰涂片镜检阳性820 例次、培养阳性814例次；检测普通咳痰476 例次，其中痰涂片镜检阳性216 例次、培养阳性160 例次。
2.1.2 深部痰与普通咳痰比较：不论涂片直接镜检还是培养的检出率均有显著差异( P 值均为0.000<0.001)，有统计学意义,详见表1。
2.1.3 痰直接湿片涂片镜下情况比较：由于污染少，深部痰较普通咳痰更易直观的观察及判断有无真菌，如下图1-2 为同一病人深部痰与普通咳痰的镜下情况。
图1.深部痰涂片镜下情况（×100）图2 普通咳痰涂片镜下情况（×100）2.2 真菌培养鉴定结果不同的真菌生长速度、菌落形态、镜下形态、显色、生化特征等均不一样。本实验中培养酵母菌菌所需时间多在1-5 天，霉菌所需时间为3-7 天，甚至14 天，真菌培养生长速度与侵袭程度成正比，侵袭越重生长速度越快。鉴定鉴定分离出974 株11 种真菌，结合菌落外观、镜下形态、显色及生化试验等方法鉴定出白念461 株，非白念株513 株。
2.3 临床病例资料回顾性分析结果2008.3-2014.1 期间6 年间EICU 共收治2165 例病人,拟诊肺部真菌感染512 例，结合临床症状、体征、G 实验、痰涂片、真菌培养及疗效等回顾性分析，按文献［4］临诊断标准，临床诊断肺部真菌感染376 例，治疗有效率71.63%，相关死亡率28.37%。以临床诊断肺部真菌感染为标准，深部痰检的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为66.76%、97.79%、98.82%、51.55%详见表3。
近年来虽然新技术例如G 实验、GM 及分子生物学技术聚合酶链式反应（PCR）检测真菌DNA 等技术的不断发展，但由于试验设备及试剂费用高昂、实验技术要求高精、特异性低等因素尚处于临床探索阶段。迄今为止尚未有一种灵敏度和特异性均令人满意的诊断方法能完全取代临床标本的真菌涂片、培养药敏及组织病理学检查等传统实验室检查方法。按文献［4］指出合格痰液或支气管肺泡灌洗液经直接镜检发现菌丝及孢子或肺孢子菌包囊、滋养体或囊内小体或真菌培养2 次阳性是临床诊断肺部真菌感染微生物学依据之一。冯伟生等人报道合格痰涂片细胞学镜检可为肺部真菌感染患者做出早期定性诊断［8］。痰标本的检查是肺部真菌感染病原学诊断最常用的方法，但由于普通痰标本易污染，合格率低即便谢懿等采取综合干预措施后痰标本合格率仍不足50%［5］；痰标本检出率低，邓博引等报道痰标本所有病原菌检出率不超过50%［7］，陈春燕等报道真菌检出率10-39%［6］；加之培养耗时等因素促使目前传统经典的痰涂片及真菌培养常被临床医务人员忽视，未真正发挥的临床它们价值。本研究采用纤支镜保护性毛刷或一次性无菌吸痰管采集深部痰与普通咳痰进行真菌相关检查的结果显示：3.1 痰检前涂片镜检筛查合格标本是提高痰检阳性率及可靠性的重要保障培养前先行涂片镜检是保障痰标本质量重要措施之一。有学者［13］认为白细胞>25 个/LP，鳞状上皮细胞<10 个/LP 为优质痰标本；白细胞>25 个/LP，鳞状上皮细胞11-19 个/LP 为中等痰标本；白细胞>10 个/LP，鳞状上皮细胞>20 个/LP 为低等痰标本；白细胞<10个/LP，鳞状上皮细胞>20 个/LP 为不合格痰标本。本组实验以白细胞>25 个/LP，鳞状上皮细胞<10 个/LP 为合格痰判断标准，结果以纤维支气管镜保护毛刷及一次性无菌吸痰管为媒介采集的深部痰合格率达91.59%，明显高于对照组普通咳痰的合格率35.08%，也高于胡必杰等人［10］研究报告中常规痰标本的合格率33.9%。考虑因正常健康人的下呼吸道一般为无菌、无痰状态，当有感染或炎症物质刺激时可出现呼吸道分泌物增多，临床表现出咳嗽咳痰，自然咳出的痰标本易被口咽部定植菌的污染，痰标本质量很难保证，而深部痰指环状软骨以下呼吸道分泌物，可避免上呼吸道正常菌群的污染。
同时发现在直接镜检中深部痰因污染少较普通咳痰易于观察。
同时本实验显示， 深部痰不论是涂片还是培养的检出率（61.68%、62.15%）均明显高于普通咳痰的检出率（45.45%、33.76%），且高于文献报道［15］。分析原因考虑所有深部痰镜检筛查合格后再挑选合格标本行真菌涂片镜检及培养，而普通咳痰不论合格与否均进行涂片及培养有关，进一步证实合格标本是提高痰检阳性率及可靠性的重要保障。因此笔者认为重视培养前痰涂片镜检，对于不合格者立即通知临床重新采集及送检标本，合格者方能进行培养，一方面确保痰检结果的准确性，另一方面可减少因培养不合格标本带来的医疗资源的浪费，甚至因等待或错误结果延误治疗时机。建议实验室人员在收集标本时先行涂片判断标本是否合格，合格者方能进行进一步的检查，不合格者及时通知临床医师。
3.2 深部合格痰涂片直接镜检结果可为抢先治疗争取一定的时机痰涂片直接镜检是一种方便、简便、价廉、实用、可重复的检查方法，其检查时间不超过2 小时，与真菌培养3-14 天比较痰涂片直接镜检能更早为临床提供病原学依据，但是临床上很多医务人员过分依赖培养或其他分子免疫学检查结果，忽略了直接镜检才是真菌入侵机体的直接证据［1］。本组实验结果显示：深部痰涂片检出率（62.15%），培养率（61.68%），两者经统计学分析无差异，有较好的一致性，且深部痰涂片检出率显著高于普通咳痰涂片（45.45%）；结合本实验中512 例疑诊肺部真菌感染患者的临床病例回顾性分析结果，以临床诊断的376 例肺部真菌感染病例为标准，深部痰检的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为66.75%、97.79%、97.67%、50.98%。提示深部痰检对肺部真菌感染诊断的有较高的特异性，敏感性也优于李俊等［16］报道的普通咳痰的敏感性41.8%。本组病例治疗有效率为72.18%高于其他报道，相关死亡率为27.82%低于其他报道［1、17］，分析与本组病例具体诊疗过程中重视深部痰标本采集、临床与实验室积极的沟通交流、涂片直接镜结果提供抢先治疗依据等有密切关系。如病人一般情况差、免疫功能低下，呼吸道症状重，即便痰涂片仅见孢子未见菌丝，培养为正常菌群如白色念珠菌，血浆G 实验阳性，仍需考虑正常菌群异位定植感染。如痰标本质量低下，甚至不合格者，涂片即便见较多菌丝，考虑污染可能，需再次采集标本重检。因此笔者建议实验室在出具痰涂片报告结果中除了报告检出病原菌结果外，常规加上该表白显微镜下白细胞及鳞状上皮细胞比例，这样便于临床医师进一步正确判断采集标本是否合格，结合临床能正确判断痰检结果的真实性、可靠性，确定是否需采集标本重新检出或调整治疗方案等，真正指导临床实现抢先及合理治疗。
综上所述，痰检前涂片镜检筛查合格标本是提高痰检阳性率及可靠性的重要保障，深部痰标本合格率及检出率明显高于普通咳痰；深部合格痰涂片与培养检出率具有较好的一致性，痰涂片直接镜检是一种更简便、价廉、实用、可重复的检查方法，在一定程度上可为肺部真菌感染提供早诊断依据，实现抢先治疗，在一定程度上可改善预后、降低死亡率及相关的医疗费用，尤其适合重症监护病房及基层医疗机构。
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论文作者:王立敏1 梁显泉2 龚修云3 刘素琴3 韦卫琴3 虞晓红3
论文发表刊物:《医师在线》2015年6月第11期供稿
论文发表时间:2015/8/13
标签：涂片论文; 真菌论文; 标本论文; 深部论文; 肺部论文; 咳痰论文; 检出论文; 《医师在线》2015年6月第11期供稿论文;