多奈哌齐对Kv4.2通道抑制作用的初探论文_程能

程能

中南民族大学生命科学学院 湖北武汉 430074

【摘 要】目的:观察乙酰胆碱抑制剂多奈哌齐对Kv4.2通道的抑制作用。方法:将大鼠的Kv4.2通道转染于HEK293细胞中,在灌流系统中给予80μM多奈哌齐,运用全细胞膜片钳技术记录给药前后电流的变化。结果:80μM的多奈哌齐可以明显的抑制Kv4.2通道的电流。结论:在神经元系统中多奈哌齐除了可以乙酰胆碱酯酶之外,可能还可以抑制Kv4.2钾离子通道。

【关键词】多奈哌齐,Kv4.2通道,HEK293细胞

Abstract:objective:To observe the inhibitory effect of the acetylcholine inhibitor donepezil on Kv4.2 channel.Methods:the Kv4.2 channel of rats was transfected into HEK293 cells,and in the perfusion system,donepezil of 80 M was given,and the changes of current were recorded by the whole cell patch clamp technique.Results:the current of Kv4.2 channel can be significantly inhibited by 80 M donepezil.Conclusion:donepezil not only suppress the acetylcholinesterase,but aslo inhibits Kv4.2 potassium channels.

Key words:donepezil;Kv4.2channel;HEK293cell;

目前治疗阿尔茨海默症(AD)的一线药物是乙酰胆碱酶抑制剂,多奈派齐(Donepezil)是美国FDA批准的第2个AchE I,目前在全世界应用最广泛。特异性可逆抑制脑内AchE,对认知障碍有明显改善。其疗效好、安全性高、使用剂量小、服用方便,不良反应少,没有任何肝脏毒性,不需监测肝功能,是他克林的安全替代药[1]。

神经元细胞中广泛表达钾离子通道,其中就包括Kv4.2通道,Kv4.2和Kv4.3通道组成瞬时外向钾电流重要功能结构,在细胞的早期复极化中扮演着重要角色,这两种通道在神经系统中广泛表达[2]。它们参与了神经元的损伤和细胞死亡,Kv4.2通道的mRAN高表达于神经毒素损伤的细胞中,本研究主要初步探讨多奈哌齐对转染于HEK293中Kv4.2通道的影响。

1.材料与方法

1.1实验材料与试剂

DMEM培养基(美国Hyclone公司);HEK293细胞;胰蛋白酶(美国Hyclone公司);Lipofectamine 2000(美国invitrogen公司);PCR引物(擎科生物);DNA maker(武汉三心达);核酸染料(东盛);细胞培养瓶(美国Corning公司);胎牛血清(杭州四季青公司);24孔细胞培养板(武汉三心达公司);培养皿(美国Corning公司);OPTI-MEM(美国Hyclone公司);卡维地洛(美国Sigma公司)。

1.2实验方法

(1)细胞的培养:复苏细胞,将-80°C超低温冰箱内冻存HEK-293细胞取出,37°C的恒温水浴锅中下快速融化,该过程不超过3分钟。融化后的细胞在低速离心机中进行离心,转速为800rpm/分,时间3分钟。离心后的细胞在无菌操作台中用移液枪吸去上清液,吸取500μl的培养基于冻存管中,轻轻吹打细胞沉淀,然后将细胞悬液移入到事先准备好的培养瓶中,补充2-3ml的培养基,将培养瓶置于37℃的二氧化碳培养箱进行培养。

(2)细胞的处理:将培养的细胞置于显微镜下进行观察,选取密度比较高(约为75%HEK293细胞),贴壁好的细胞,在无菌操作台中先倒掉培养瓶中的培养基,吸取1ml的PBS溶液于培养瓶中清洗一下,倒掉PBS,加入0.5ml的胰酶消化20秒,然后倒掉胰酶,加入2ml的培养基用移液枪进行吹打,吸取细胞悬浮液于24孔板中,每个孔中滴入4-6滴细胞悬浮液,最后将24孔板置于细胞培养中进行培养,为后续质粒的转染做准备。

(3)膜片钳实验:打开开关使给药系统中的细胞外液沿着塑料管流入到灌流槽中,然后从培养箱中取出24孔板中的细胞放置于灌流槽中,打开Clampex软件,调节好软件的各种实验参数,然后打开Clamfit软件,该软件用来实验数据的分析。随后,使用电极拉制仪拉制玻璃微电极管,一般我们选取电极电阻在2 - 4 MΩ来进行全细胞的封接实验。

(4)数据分析:原始实验数据由Clampex软件记录,通过Clamfit和Origin7.5软件对数据进行分析和绘图。

2.实验结果

2.1多奈哌齐抑制了Kv4.2通道的电流

我们测试了多奈哌齐对Kv4.2通道的全细胞电流会有怎样的影响。实验刺激方案为:在-80 mV的钳制电压下,增幅为10 mV,直至+60 mV,持续时间为300 ms。从图中可以看出,80μM多奈哌齐能显著抑制Kv4.2通道电流。

2.2多奈哌齐对Kv4.2通道的I-V曲线图

将原始数据(n=)进行统计分析后绘制的电流-电压曲线(I – V曲线),在+60 mV处,对照电流为5.5± 0.3nA,在80μM多奈哌齐作用下,该通道电流减小为2.8±0.3 nA。由此可以得出多奈哌齐可以明显的抑制Kv4.2通道的电流。

3.讨论

阿尔茨海默症是一种不可逆的中枢神经系统的退行性疾病。主要临床表现为进行性学习、记忆和认知能力的减退;主要病理特征为新皮层、海马出现高密度老年斑(SP),神经纤维缠结(NFTs)和大量神经元的丢失等。β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)是构成老年斑的重要成分[3]。有资料表明,Aβ可抑制多种K+通道功能,使细胞膜复极过程延缓、动作电位时间延长,细胞兴奋性改变、放电频率增加等[4]。

乙酰胆碱酯酶(AchE)活性反映了胆碱能神经元的活性,胆碱能调节大脑皮层和海马中神经生长因子(NFG)的合成与释放[5]。Aβ沉积会增加AchE表达,造成Ach神经递质的异常,并进一步导致Aβ的沉积和NFT形成,产生恶性循环的Aβ毒害作用。目前用于治疗AD的一线药物胆碱酯酶抑制剂可阻滞突触中ACh的水解,提高大脑中Ach的水平,恢复胆碱能神经传导,从而改善病人症状[6]。有研究报道,AChE抑制剂能够影响中枢神经元钾通道,来协同其AChE抑制剂的作用。Donepezil是乙酰胆碱抑制剂,用于治疗阿尔茨海默症。有研究表明Donepezil可抑制多种钾离子通道电流,如hERG通道、Kv2.1、内向整流钾通道等[7]。

Kv4.2在神经细胞中高表达,本实验初步探究了多奈哌齐对于Kv4.2通道电流的抑制作用,为该药物新的潜在作用靶点提供了依据,但其确切的作用机制需进一步研究。

参考文献:

[1] 曾秘,顾克敏,蒋英兰.阿尔茨海默病及治疗药物研究概况[J].中国药业,2006,15(6):59-60.

[2]王勋,殷昊,周晋,张黎明.侧脑室注射中药提取物三氧化二砷对海马神经元Kv4.2和Kv4.3钾通道表达的影响[J].中医药学报,2013,41(05):66-69.

[3] Chae YJ,Lee HJ,Jeon JH,Kim IB,Choi JS,Sung KW,Hahn SJ.Effects of donepezil on hERG potassium channels.Brain Res.2015 Feb 9;1597:77-85.doi:10.1016/j.brainres.2014.11.057.PubMed PMID:25498859.

[4] 张宇.一、β淀粉样蛋白31-35片段对海马CA1神经元BK通道和[Ca2+]_i的影响:全细胞膜片钳和离子荧光成像技术观察 二、Humanin对Aβ31-35抑制大鼠海马神经元BK电流及升高[Ca2+]_i作用的观察 三、I型代谢型谷氨酸受体参与脊髓痛信号传递作用的观察[D].山西医科大学,2007.

[5] Chae YJ,Lee HJ,Jeon JH,Kim IB,Choi JS,Sung KW,Hahn SJ.Effects of donepezil on hERG potassium channels.Brain Res.2015 Feb 9;1597:77-85.doi:10.1016/j.brainres.2014.11.057.PubMed PMID:25498859.

[6] Yuan H,Wang WP,Feng N,Wang L,Wang XL.Donepezil attenuated oxygen-glucosedeprivation insult by blocking Kv2.1 potassium channels.Eur J Pharmacol.2011Apr 25;657(1-3):76-83.doi:10.1016/j.ejphar.2011.01.054.PubMed PMID:21300054.

[7] Zhong CB,Zhang W,Wang XL.[Effects of donepezil on the delayed rectifier-like potassium current in pyramidal neurons of rat hippocampus and neocortex].Yao Xue Xue Bao.2002 Jun;37(6):415-8.Chinese.PubMed PMID:12579795.

作者简介:程能(1991.08-),男,湖北省鄂州人,武汉市洪山区中南民族大学,发育生物学,硕士研究生

论文作者:程能

论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2018年2月第4期

论文发表时间:2018/7/10

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