张俊芳[1]2002年在《人血小板因子4（hPF4）原核高效表达体系的构建、纯化及特性研究》文中进行了进一步梳理目的 1 人血小板因子4(h PF4)原核高效表达克隆的构建 2 重组h PF4的表达及分离、纯化工艺研究 3 重组h PF4的特性研究 方法 根据原核细胞表达真核蛋白的基因表达调控特点，设计合成一对特异引物，在PT7-7-r PF4表达质粒的基础上，应用聚合酶链式反应(PCR)对其c DNA进行改造，通过DNA重组技术构建成重组h PF4原核表达质粒PBV220-r hPF4，用快速PCR检测法、DNA测序分析，鉴定重组h PF4表达质粒的正确性。 PBV220-r hPF4用氯化钙法转化大肠杆菌DH5 α、BL21(DE3)，温控诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE、Western-blotting鉴定表达产物。采用超声结合溶菌酶法破碎大肠杆菌，分析蛋白表达形式，可溶性重组蛋白部分用肝素—琼脂亲和层析、RP-HPLC纯化重组h PF4，非可溶性部分经包涵体分离、洗涤纯化。研究重组h PF4的复性条件，采用空气氧化法使重组h PF4正确重折迭。采用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验观察重组h PF4的血管生成抑制活性及复性效果。 结果 1 DNA测序证明PBV220-r hPF4表达质粒构建成功。PCR扩增得到的h PF4基因片段去除了h PF4 c DNA 3末端AT富含的侧翼区序列，原终止密码子TAG定位突变为原核系统强的串联终止密码子TAATAA，3端设有SalⅠ位点，5、末端设有EcoR Ⅰ、NcoⅠ位点，h PF4基因片段以EcoR Ⅰ/SalⅠ位点定向插入PBV220载体。 山西医科大学2002届硕士学位论文 一 2 DHS a／PBV220－r hPF4经温控诱导表达后，SDS－PAGE及凝胶密度扫描分 析，表达产物占总国体蛋白的25－30％，凝胶迁移特性与hPF4标准品相同。 Western－blotting检测表达产物与兔抗人 h PF4抗体发生特异的抗原抗体反 应。表明我们成功构建了hPF4原核高效表达体系。 3 超卢结合溶由酶法破碎人肠杆菌后，经分析 r hPF4主要以包涵体的形式存＿在，包涵体经洗涤液I uOmMTrk－mPhs．趴10OmMN＊m：0．5mME0T儿 ZM瞧：0．2％TritonX－100 0．2％DOC）洗涤，再经洗涤液 11（50mol几，PH80 Trk．C卜mo＊M N＊m 山．5＊M EDTA：4M尿素：0．2％（Vv）Tr讨。＊x－100 0．2％DOC）溶解包涵体沉淀。r hPF4纯度可达 85％ 以上。r hPF4 E透析的 同时，采川立气氧化法，加以 Cu‘至终浓度川”mol／1加速空气氧化，使 r hPF4 上确显折迭。 4 鸡胚绒毛尿素膜血管生成抑制实验测定复性后的rhPF4的生物学活性，初 步结果显示：rhPF4具有野生蛋白抑制血管生成的活性。 结论 本研究运用 PCR定点突变技术，完全去除了 hPF4 cDNA基因 3”端 UTR AT 富含区：改用大肠杆菌强串联终止密码子T AAAATAA，成功构建高效表达克隆 PBV220－rhPP4。我们构建的r hPN原核高效表达系统经m－PAGE及凝胶密度 扫描分析结果表明，r hPF4表达量占菌体总蛋白量的 25－30％，较原表达克隆 PT7－7／r h PF4提高了近80倍，经快速高效的包涵体分高纯化工艺和复性工 艺，rhPF4具有野生蛋白活性。本研究为rhPF4的结构与功能关系研究及规模 化生产奠定了坚实的基础，也为真核蛋白在原核细胞中的表达调控机理提供 了理论依据。
段毅涛[2]2012年在《大肠杆菌中多顺反子表达人血小板因子4》文中研究表明血小板第4因子(platelet factor4, PF4)是CXC趋化因子家族中的一员，储存于血小板α颗粒，血小板活化后得以释放。除了肝素中和作用外，PF4有多种生物功能：对人单核细胞和中性白细胞的趋化性，参与成纤维细胞的黏附，免疫调节和抑制肿瘤细胞的生长等。PF4属于小分子多肽，在体内易降解，半衰期短，因此其克隆、表达等常遇到一些困难，在一定程度上制约了其工业化生产。本文采用多顺反子串联表达策略，提高PF4的表达量，为其工业化生产、深入研究和临床应用奠定基础。首先，根据优化后的人PF4DNA序列设计引物，重迭PCR得到人PF4DNA序列，连接T载体；其次，又设计串联单位、第一串联单位和相应引物，重迭PCR获得串联单位和第一串联单位的DNA序列，分别连接T载体，标记为pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-f PF4；再次，用同尾酶对质粒pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-f PF4酶切、连接，得到质粒pEASY-T1-2f PF4；同理，对质粒pEASY-T1-PF4和pEASY-T1-2f PF4酶切、连接，可得质粒pEASY-T1-3f PF4；依次循环可得pEASY-T1-nfPF4(n=4,5,6)；最终，双酶切质粒pBV220、pET28a(+)和pEASY-T1-nf PF4(n=1,2…6)，分别连接大小片段，连接产物分别转化E. coliDH5α和BL21(DE3)，获得工程菌E. coli DH5α/pBV220-nf PF4和E. coliBL21(DE3)/pET28a(+)-nf PF4(n=1,2…6)。工程菌E. coli DH5α/pBV220-nf PF4经诱导表达，重组PF4蛋白没有表达或表达极少；工程菌E. coliBL21(DE3)/pET28a(+)-nf PF4培养至OD_(600)约为0.6时，加入终浓度为0.6mM的IPTG，在23°C下诱导表达12小时，PF4包涵体和可溶性蛋白均有产生；SDS-PAGE电泳和Western blot检测全菌蛋白时，发现随着拷贝数的增加，表达逐渐增加，至4个拷贝时，趋于平衡，其中工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-nfPF4(n=4,5,6)中，重组PF4分别占菌体总蛋白的44.45%、44.03%和43.28%。选工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-4f PF4诱导表达，上清可溶性蛋白经Ni亲和纯化柱和凝胶脱盐柱后其纯度可达95%以上；纯化的融合蛋白经肠激酶酶切和质谱鉴定，确为PF4。用集落形成试验验证重组人PF4的活性，发现融合蛋白可抑制HEL细胞集落的形成，抑制率为55.6%。本论文从解决重组小分子多肽药物产量低、纯化困难和纯化后的目标产品末端不能完全忠实于野生型氨基酸序列等技术难题入手，有效地改进了PF4生产工艺，同时也为其它小分子多肽药物生物合成提供了崭新的思路。
陈衍[3]2002年在《重组人血小板因子4基因的克隆、表达、纯化和活性初步鉴定》文中研究说明血小板因子4(platelet factor4，PF4)属趋化性细胞因子CXC亚家族，分子量为7767，基因定位于4号染色体长臂。它在巨核细胞中合成，在α颗粒中包装，在血小板粘附、聚集等活化状态时以高分子量蛋白多糖-PF4复合物的形式从血小板中释放。 PF4具有多种生物学功能。其除了趋化因子共有的调节炎症反应和介导免疫应答外，更主要的是一种造血及血管生成的负性调控因子。PF4能降低正常造血干细胞对化疗药物的敏感性，其机制是可逆性地抑制细胞增殖，将细胞阻止在S期，同时还可保持其活力，而对肿瘤细胞生存能力及化疗敏感性没有明显作用。因此PF4可用于临床作为治疗肿瘤时造血细胞的防护剂。PF4还是一种血管生成的抑制因子。已证实PF4在体内有抑制实体肿瘤生长的作用，就是通过抑制肿瘤诱导的血管新生机制来抑制肿瘤生长。PF4可优先同体内血管生成活跃 第四军医大学硕士论文的组织部位结合，这为肿瘤的靶向治疗提供可能。 本研究的目的是对重组人 PF4（rhPF4）基因克隆、表达、纯化及活性分析，以获得有活性的rhPF4，为下一步的深入研究和临床应用奠定基础。 本文首先人工合成了 rhPF4 cDNA的两条寡核茸酸链，经 PCR一轮反应，得到PF4基因的全长模板。再合成rhPF4基因的扩增引物，经PCR大量扩增PF4 g因。PF4基因扩增产物经纯化后，克隆入大肠杆菌克隆载体 pUC中，筛选带有插段的阳性克隆，经序列测定，证实基因正确无误。再将测序正确的PF4基因亚克隆入大肠杆菌融合表达载体pGEXAT3中，经酶切鉴定后将重组表达载体命名为pGEX－4T）PF4。将 pGEXAT3fF4转化大肠杆菌 DH5a，用 lmmol／L IPTG于 37T 4小时诱导 pGEX－4T3－PF4的表达，并进行 western blot t＊变分析和蛋白表达形式分折石DS－PAGE结果表明：重组表达载体pGEX－4T3．PF4在大肠杆菌DH5a中得到表达，表达产物GSTPF4融合蛋白分子量约为34 KDKD，与二者分子量之和相符。光密度扫描结果表明，GSTPF4融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的 20％。western blot印迹检测到了该融合蛋白的特异存在，而以空白菌株作为对照的泳道上则无任何杂交带。通过对不同裂菌组分的电泳分析发现，表达蛋白均以包涵体形式存在。 为使包涵体形式表达的GSTPF4融合蛋白以可溶形式分泌，本文尝试了改变诱导条件。我们首先将宿主菌改为BLZI（DE3卜并用WTG低温诱导（28－30℃），SDS－PAGE结果表明，表达产物有50O出现于细菌外周质中，为可溶性。接着本文利用 Glutathione Sepharose 4B对可溶性表达的GSTPF4 融合蛋白直接进行亲和层析纯化，再利用GSTPF4融合表达蛋白上的凝血酶识别位点，用凝血酶将GST从目的 ．4． 第四军医大学硕士论文蛋白的N段切除。将纯化后的蛋白进行蛋白定量，结果表明所得到的蛋白浓度约为0329／L。本文还采用鸡胚尿囊膜血管生长抑制模型 （CAM）进一步对纯化复性后的 rhPF4进行初步的活性鉴定。实验结果表明，本实验所得到的dF4对CAM血管生长具有抑制活性。 PF4作为一个多功能趋化因子，具有潜在的应用前景，随着其竹用机制的进一步阐明，它可能会成为一种有效的临床药物。以上买验结果表明rhPF4cDNA基因己成功扩增、克隆，并在融合表达载体中获得可溶性表达，表达产物得到有效纯化，纯化后初步鉴定其具有生物学活性，为进一步研究其机制及其临床应用奠定了基础。
于威[4]2001年在《人血小板因子4在家蚕细胞和幼虫体内的表达》文中进行了进一步梳理人血小板因子4(Human Platelet Factor 4，简称hPF4)是一种发现于骨髓 巨核细胞和血小板α-颗粒的蛋白质。PF4是一种典型的多功能蛋白，目前已发 现PF4具有抗肿瘤、中和肝素抗凝作用、免疫调节活性、组织损伤修复、诱发 炎症反应等多种生物学功能。近年来人们对PF4进行了广泛的研究，目前PF4 已越来越受到基础医学和临床医学的重视。 本研究首先将hPF4基因在大肠杆菌中进行了高效表达。通过PCR及酶切 反应将PF4基因克隆到大肠杆菌热诱导表达载体pBV221中，获得了大肠杆菌 表达载体pBV-PF4，并在JM109菌株中进行了热诱导表达，表达产物经Western 杂交检测具有很强的兔疫活性，在约7.8kD处有一条明显的条带，与目的蛋白 的分子量大小一致，表明PF4基因在大肠杆菌中得到了表达。ELISA检测结果 也表明表达产物具有明显的免疫活性，表达量达到 9.968μg/ml菌液。 此外，我们还首次将hPF4基因在家蚕杆状病毒表达载体系统中进行了表 达。将克隆到的PF4基因通过适当的酶切后插入转移载体质粒pBacPAKS的多 克隆位点中，获得重组转移载体pBacPAK-PF4，然后将pBacPAK-PF4与已酶切 线性化的杆状病毒BacPAK6共转染家蚕培养细胞，二者在细胞内发生同源重组， 通过空斑筛选得到了纯化的重组病毒rBacPAK-PF4。DNA点杂交和Southern杂 交结果均证实了PF4基因已经插入到了杆状病毒基因组中。我们首先在家蚕培 养细胞中表达了PF4基因，Northern杂交结果表明PF4基因在家蚕培养细胞中 发生了转录，rBacPAK-PF4以10MOI的滴度感染2×106细胞，表达产物采用体 外培养的血管内皮细胞ECV304对其生物学活性进行测定，测活结果表明家蚕 培养细胞中表达第 3天的表达量达到了最高值，为 6.088μg/2×106个细胞，胞 内表达产物对血管内皮细胞的生长抑制率达到90.6%。ELISA检测结果表明， 表达产物能与兔抗人PF4一抗发生免疫反应，表达的PF4蛋白具有兔疫活性。 Western杂交在约8kD和17kD处有两条特异性的条带，表明PF4在BmN细胞 中的表达产物可能以两种形式存在，其中17to的蛋白可能是在产物后加工过程 中糖基化等修饰比较完全所致，8kD蛋白可能是糖基化程度较低所致。 二互 ＃rBacPAKPF4在家蚕培养细胞中的表达量与接种病毒的MOI也具有一定的相关性，表达量随MOI的增加呈对数增长趋势。 同时我们也在家蚕幼虫和蛹中对hPF4进行了表达，二者的表达结果相似，都是在感染第 5天的活性最高，其中在蚕血淋巴中的表达量约为 29刀2 u g／ml，对内皮细胞生长的抑制率可达到92．3％。蚕血淋巴的Western杂交结果与在家蚕培养细胞中表达产物的杂交结果极为相似，都是在约 skD和 17kD处有两条特异性的条带，表明 PF4在蚕血淋巴中可能也是以加工后的成熟蛋白和未加工的蛋白两种形式存在。同时也采用了ELISA检测法对蚕体的表达产物进行检测，测定结果也与细胞检测结果相似。 我们还对hPF4蛋白在家蚕培养细胞、蚕体和大肠杆菌内的表达情况进行了比较，结果表明：蚕血淋巴的表达量要高于大肠杆菌的表达量，约为其2．9倍；一条蚕的表达量约等于6瓶家蚕培养细胞的表达量。 家蚕表达载体系统与现有的几种较成熟的真核表达系统相比，其突出的特点就是表达的高效性。PF4在临床上应用的有效剂量较高臼0 p g／Kg入 运用家蚕表达系统表达PF4蛋白可获得大量有生物活性的PF4蛋白，恰好可以满足在临床上的大剂量应用，且可以大幅度降低成本，为今后在临床上肿瘤化疗中的广泛应用打下基础。
参考文献：
[1]. 人血小板因子4（hPF4）原核高效表达体系的构建、纯化及特性研究[D]. 张俊芳. 山西医科大学. 2002
[2]. 大肠杆菌中多顺反子表达人血小板因子4[D]. 段毅涛. 天津大学. 2012
[3]. 重组人血小板因子4基因的克隆、表达、纯化和活性初步鉴定[D]. 陈衍. 第四军医大学. 2002
[4]. 人血小板因子4在家蚕细胞和幼虫体内的表达[D]. 于威. 浙江大学. 2001
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