梁雪莲[1]2002年在《农杆菌组培及叁种非组培法在小麦和玉米上转化外源Bar基因研究》文中指出分子生物学技术为作物抗逆品种选育开辟了新的途径。在农作物上开展抗除草剂基因转化有深刻的意义:(1)可一次性清除大田杂草,大幅度提高作物产量;(2)可以免耕或少耕,避免了土壤侵蚀,有一定的生态效益;(3)使高效、灭生性除草剂得到继续发展;(4)在杂种优势中,利用显性抗除草剂基因标记去杂去劣,利用隐性抗除草剂基因简化不育系的繁种程序,还可利用细胞质叶绿体抗除草剂基因提高制种质量。本研究采用了农杆菌介导的遗传转化方法,系统比较了AS 在从诱导愈伤到感染再到共培养这一过程中的作用效果。还应用了萌动种胚处理、花粉介导和子房注射的方法,找出用农杆菌转移禾谷类作物抗除草剂基因的简便有效的方法,建立不依赖于植物细胞和组织培养的高效、规模化的转化体系。结果如下:用农杆菌转化小麦授粉10-15天的幼胚,经5‰PPT筛选获得大量正常再生植株。PCR 及PCR-Southern 杂交检测证明23%再生苗为转化bar 基因植株。总结出一套农杆菌转化小麦幼胚高效获得转基因再生植株的处理程序。用农杆菌介导转化玉米萌动种胚(此法已获国家专利),首先浸泡种子4 小时,再辅以划胚处理,后与适当浓度菌液(含AS)共培养24 小时,再播种。种苗经大田basta 喷洒筛选及PCR 电泳与Southern-blot 分子检测证明bar 基因已完整进入植株DNA 中,且其转化率比基因枪提高10 倍以上。此法简化了愈伤转化的繁琐漫长的组培过程,可操作性强,转化率高,很值得推广。还用另外两种非组培转基因方法,花粉介导与子房注射法,在玉米上转化bar基因,并与萌动种胚法就转化率作了比较,经大田筛选及PCR 和PCR-Southern 检测证明叁种方法均可获得转化植株。通过分析叁种方法的转化机理,而且通过比较他们转化率及负作用的大小,认为萌动种胚法优于花粉介导法,更优于子房注射法。
王成杰[2]2004年在《农杆菌介导小麦非组培转化方法的探讨》文中进行了进一步梳理根癌农杆菌是广泛应用于植物转基因的载体系统，是转化双子叶植物最常规的方法，近些年利用农杆菌介导单子叶植物的转化发展较快，在水稻、玉米上已经有比较成熟的转化方法，对于小麦来说，虽然在1997年就获得了突破，但经过近七年的发展，农杆菌介导法依然没有成为小麦基因转化的主导方法。原因之一是由于小麦组织培养难度高、品种依赖性强，其二是受体材料单一、方法单一。 本实验选取了小麦生长发育过程的两个时期：种子萌发期和开花期，系统的研究了利用农杆菌非组培转化小麦的方法。通过实验发现，在小麦穗中部第一小穗发育到授粉完成到成小半粒的时期进行花器浸沾接种，可以得到很高的GUS瞬时表达效率。在利用农杆菌转化小麦萌芽的实验中我们发现，难以转化的主要原因是由于农杆菌无法渗透至生长点部位、vir基因表达效率低。本实验通过在接种菌液中加入表面活性剂和真空渗透的方法促进了受体材料对农杆菌的吸收，并且在接种菌液中加入AS诱导vir基因的表达，并且在生长点部位检测到了GUS的瞬时表达。 通过实验，花器浸沾处理小麦的花器，染色频率可达到61％，对萌芽处理中生长点的染色频率也可达到22％，对染色材料的切片观察，也可以看到组织内层细胞的GUS染色现象。 本实验还尝试了一种新的利用潮霉素筛选小麦转化体的方法，通过筛选在692株经种子萌芽处理后再生的植株中筛选到6株明显呈阳性的植株。但对植株后来产生的新叶进行PCR鉴定时却没有扩增出特异性条带。
郭晓梅[3]2017年在《毛竹非组培转基因及转DhNiR基因水稻后代性状分析》文中研究指明竹子传统杂交与选择育种困难,造成育种水平滞后,成为竹产业进一步提升的限制因素。转基因是有效育种手段,但是竹子再生比较困难,遗传转化成功的报道很少。本研究主要从两方面入手,一方面通过非组培转基因研究,避开竹子组培再生的难题;另一方面是对能够促进植物再生的基因如DhNiR(Dendrocalamus hamiltonii,Dh)进行研究,通过将促进再生基因整合入双元表达载体,以提高竹子再生与转化效率。本试验的目的是分别将这两种方法应用到竹子中,使竹子的转化效率得到有效的提高。本项目首先以毛竹种子为实验材料,用农杆菌介导植物萌动种子基因转化方法将CP4-EPSPS基因成功转化到毛竹种子中,成功获得了转基因植株。试验结果如下:在共培养时,菌液浓度以OD600=0.07为最适浓度,太低或过高的浓度都不利于苗的转化和萌发;且共培养液中加入400μmol·L-1乙酰丁香酮,可使出苗率提高8%左右;经PCR分子验证获得1株毛竹转基因植株。其次是对转DhNiR基因水稻进行后代性状分析,试验结果如下:以转DhNiR的T2代水稻成熟种子和野生型水稻成熟种子为试验材料,经愈伤组织诱导及增殖后,选取生长良好的致密愈伤组织进行分化培养,愈伤诱导率和苗分化时间上均表现出差异,转DhNiR的水稻愈伤组织在转入分化培养基第25天时绿点愈伤率达到了100%,而野生型水稻绿点愈伤率仅为56.37%,且苗分化时间比野生型水稻早5天左右,表明DhNiR在水稻再生能力提高方面有促进作用;以转DhNiR基因的水稻和野生型水稻的叶片、茎、根、愈伤组织为样本,测定各个样本中的亚硝酸还原酶活性,转DhNiR基因水稻各部分组织的亚硝酸还原酶活性均高于野生型水稻,且达到了极显着差异;对转DhNiR水稻和野生型水稻的种子、叶片及根分别进行硝酸盐和亚硝酸盐含量测定,结果显示转DhNiR基因水稻各部分组织中的硝酸盐和亚硝酸盐含量也普遍高于野生型水稻。
杨云霞[4]2005年在《小麦农杆菌介导不同遗传转化体系的建立及比较研究》文中认为为探讨影响农杆菌介导小麦遗传转化的相关因素,建立和优化转化体系,本研究以4种基因型小麦的幼胚愈伤、12种基因型小麦的成熟胚愈伤为受体通过组织培养的途径,以及以12种基因型小麦的种子直接切胚、茎尖生长点转化非组织培养的途径,用携带潮霉素筛选基因和GUS标记基因的农杆菌LBA4404、C58C1对小麦进行转化,建立并优化了转化体系,同时对两种途径转化法做了比较,获得了如下结果: 1、组培转化途径中,以幼胚愈伤为受体,在MS、N6、SD2叁种基本培养基的基础上,调整激素的浓度和配比,筛选出适合幼胚愈伤高效转化的SK培养基:SD2+KT 1mg/L+6BA 0.5mg/L+ZT3mg/L;同时得出小麦的不同基因型对农杆菌介导转化有影响;幼胚愈伤的生理状态是愈伤再分化的关键因素,只有结构紧密外观淡黄色的胚性愈伤才有再分化的潜力。 2、组培转化途径中,以成熟胚愈伤为受体,改进成熟胚的诱导方式,用以往的整体成熟胚诱导为将成熟胚刮碎诱导,这种改进完全避免了成熟胚不长愈伤而直接出芽现象的发生,将成熟胚的诱导愈伤率提高了40%—50%;建立了成熟胚为受体的转化体系:SK中2,4—D的浓度为4mg/L,农杆菌活化、侵染、共培养叁个环节均添加200μM的乙酰丁香酮:同时得出小麦的基因型与出愈率无关,与胚性愈伤率、转化率有关,本实验中的山农15、山农11、扬麦158、烟农15和Bobwhite基因型小麦适宜做以成熟胚愈伤为受体的转化材料;出愈率、胚性愈伤率、转化率叁者之间不呈正相关。 3、非组培转化途径中,以12种基因型小麦种子直接切胚进行转化,对小麦种子的处理及小麦种子与农杆菌的相互作用进行了研究,建立了转化体系:小麦种子37℃水浴3—4小时切胚,与含200μM乙酰丁香酮、菌液浓度OD_(650)=0.6的农杆菌在28℃黑暗条件下,振荡培养14—16小时;同时得出转化率与小麦基因型无关。 4、非组培转化途径中,以12种基因型小麦的茎尖生长点为受体进行转化,建立了转化体系:小麦幼芽长到3—4cm时剥离茎尖生长点,用含200μM乙酰丁香酮、菌液浓度OD_(650)=0.6的农杆菌侵染30min;同时得出转化率与小麦基因型无关。 5、经GUS和PCR的初步检测,成熟胚愈伤、成熟胚切胚、成熟胚茎尖生长点为受体的转化得到了转基因植株。
程宁宁[5]2014年在《农杆菌介导紫花苜蓿子叶节的遗传转化研究》文中进行了进一步梳理紫花苜蓿是一种蛋白质含量高的优质多年生豆科牧草,在全世界各地广泛种植。随着畜牧业对苜蓿品质的要求越来越高,培育高产优质的紫花苜蓿新品种对畜牧业的发展有重大意义。由于紫花苜蓿是同源四倍体,基因组信息较复杂,且是异花授粉作物、自交不亲和,这加大了以传统的杂交回交方法育种的工作难度。近年来,利用植物基因工程手段的分子育种受到了广泛关注,它是以植物遗传转化技术为基础的。另外植物功能基因组学的研究也离不开遗传转化。本研究以紫花苜蓿子叶节作为外植体探讨了两种农杆菌介导下的苜蓿遗传转化方法,并成功获得了转基因阳性植株,为紫花苜蓿的外源基因转入提供了两种可供参考的有效途径,促进了豆科植物遗传转化技术的发展,试验的主要结果如下：1.优化了农杆菌介导的子叶节直接分化芽再生途径：切取萌发8 d左右无菌苗的子叶节,经农杆菌侵染15mmin后,接种到MS+1.0 mg/L6-BA+100 mg/L AS共培养培养基上黑暗培养3-4d,再转移到MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+100 mg/L Kan+400 mg/L Carb上进行不定芽的诱导,挑选分化出不定芽的外植体转入到生根培养基1/2MS+0.2 g/L YE+100 mg/L Kan+400 mg/L Carb上诱导生根,待根部产生多条粗而壮的根时即可进行炼苗,最后移栽。成活后的转化植株,经PCR检测鉴定确定为转基因植株。2.建立了一种非组织培养方式的遗传转化方法：对萌发4 d的紫花苜蓿幼苗切除一片子叶,在子叶节处制造伤口,用农杆菌菌液侵染剩余的小植株60min,接着在黑暗中培养2 d,然后把小植株转移到蛭石上,保持湿润环境,10 d之后将成活的植株移栽到花盆里继续生长。同样经过PCR鉴定发现其中有一部分为转基因植株。选择3株转基因阳性植株在空旷的地方继续生长发育,植株表型正常,并且最终开花结实,成功收获了转基因苜蓿的种子。
刘明雪[6]2013年在《津田芜菁花青素合成非依光型T-DNA突变体的构建及分析》文中研究表明基因组学研究的一个重要手段是构建大规模突变体库,通过分析突变体的表型从而鉴定突变基因的功能是功能基因组学研究最直接有效的方法。T-DNA是目前使用最广泛的插入元件,已在许多植物中利用其进行突变体库的构建和筛选,从而研究基因的功能。本研究组在前期的研究中发现,UV-A特异诱导津田芜菁膨大肉质根表皮的花青素合成,推测在植物中可能存在不同于UV-A/蓝光受体的UV-A特异的受体。津田芜菁花青素合成非依光型T-DNA插入突变体的构建将为研究UV-A特异诱导花青素合成途径中相关基因及信号转导因子建立平台。本研究制作了津田芜菁花青素合成非依光型T-DNA突变群体并对突变群体进行了初步鉴定分析。得到了以下结果：成功从pBI121质粒中克隆了GUS基因,测序分析显示GUS基因序列全长1812bp, Blast序列比对显示序列正确。采用Gateway技术,成功构建了表达载体pH7WG2D,1-GUS,该植物表达载体含GFP选择性标记基因、GUS选择性标记基因、潮霉素植物选择标记以及CaMV35s启动子。以津田芜菁花序轴为外植体进行农杆菌介导的组培遗传转化探索,并根据芜菁难于再分化的特性设置了35种不同6-BA和NAA组合的分化培养基,结果表明此种方法不能使芜菁分化出再生芽。采用农杆菌真空渗透萌发种子的方法进行芜菁非组培遗传转化的探索,并设置了干种子未超声、干种子超声、浸泡种子未超声、浸泡种子超声四种实验条件。绿色荧光蛋白筛选及GUS组织化学染色初步鉴定表明浸泡种子超声的转化率最高,阳性结果达到60%。对T-DNA插入突变体库进行筛选,获得花青素合成不受光诱导的全红突变体以及花青素不合成的全白突变体。通过筛选约10000株T1代津田芜菁,获得200株系目标突变体。种植筛选出的T2代突变体,共获得17个全红株系,60个全白株系。对转基因植株进行了gfp、gus、hyg和35s prmoter四个标记基因的PCR鉴定。其中全红表型突变体3、4号,全白表型突变体7、9号四个标记基因PCR结果均有条带。经TAIL-PCR分析,T-DNA插入位点在07号染色体的20002828位置和20003156位置之间,可能在两个基因之间或下游基因的启动子区。对插入位点上下游基因进行分析,发现其上游基因为叁角状五肽重复区(pentatricopeptide, PPR),下游基因编码的蛋白属多药和有毒化合物排出家族(Multidrug and Toxic Compound Extrusion, MATE)。
张婷婷[7]2011年在《植物非组培转化方法获得转基因植株》文中认为植物基因遗传转化最常用的方法农杆菌介导法和基因枪法已经使转基因作物的研究与开发取得了举世瞩目的成就。但这些方法依赖于组织培养,操作复杂,所用仪器昂贵,对操作者和实验设备都有很高的要求,难与常规育种相结合,因此植物非组培转化方法的研究具有重要意义。本研究采用超声波辅助花粉介导植物转基因方法将抗逆性相关受体类蛋白基因(OsSIK1)导入不同品种玉米白交系,以期获得对盐碱性、干旱具有一定程度抗性的转基因玉米材料,同时研究该方法在不同品种间转化率差异。此外,本研究还采用农杆菌介导的植物萌发种子基因转化法,以大豆萌发种子为外源基因受体,将含有crylAc抗虫基因的表达载体导入大豆中,以探讨该方法在大豆上的可行性,并根据大豆的具体情况对转化过程中的乙酰丁香酮浓度、超声波功率等因素进行试验,建立了适合于大豆的遗传转化体系。研究内容及结果如下：1.花粉介导法转化玉米(1)采用超声波辅助的花粉介导法,将含有OsSIK1基因的植物表达载体导入郑58,98-2-19,昌7-2叁个玉米自交系品种中,在当代直接得到了T0代转化种子,其中郑58结籽272粒(结实率63.4%),98-2-19结籽27粒(结实率14.1%),昌7-2结籽167粒(结实率31.2%)。(2)T1代植株经卡那霉素筛选和PCR检测,最终得到的转化植株数为：郑58,35株(转化率28.5%)：98-2-19,4株(转化率20.0%)：昌7-2,20株(转化率37.1%),初步外源基因已整合到玉米基因组中。(3)T2代植株遗传率为：郑58,34.3%；98-2-19,12.5%；昌7-2,55.0%。通过对这3个自交系的转化处理结实率、转化率和导入基因遗传率的比较分析,证明花粉介导法对不同自交系品种的转化率间存在差异,自交系郑58,昌7-2更适合采用花粉介导法进行遗传转化。2.植物萌发种子基因转化方法转化大豆(1)采用超声波辅助的植物萌发种子基因转化法,以大豆萌发种子为外源基因受体,将含有bar基因及cry1Ac基因的表达载体p3301ubiAc导入大豆中,通过除草剂筛选、PCR检测,证明转化率平均为6.9%。(2)优化大豆转化体系：研究了乙酰丁香酮浓度、超声波功率等因素对大豆转化效率的影响,并确定了幼苗期喷施除草剂的本底筛选浓度。结果表明,当转化的菌液浓度OD600为0.5～0.6,乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L,超声波功率为800W时转化效率较高。(3)用草丁膦浓度分别为1mg/L、1.5mg/L、2mg/L、3mg/L及5 mg/L的除草剂涂抹叶片,根据幼苗生长状态确定最佳的除草剂筛选浓度为1.5mg/L。在叁叶期使用1.5mg/L的除草剂浓度进行筛选,可以淘汰大量非转基因和表达较弱的株系或个体,大大减少田间工作量及后期检测工作。
任海红, 任小俊, 王英, 刘学义[8]2010年在《非组培遗传转化法在农作物上的应用》文中研究说明近年来,植物基因工程技术取得了重要进展,在农作物品种改良和育种方面发挥着越来越重要的作用。然而,目前植物遗传转化所采用的受体系统,大都依赖于细胞组织培养技术才能获得转基因植株。因此,对于大豆、小麦等组织培养难度高、品种依赖性强的作物,寻找新的转化方法很有必要。着重介绍了几种非组培转化方法的技术原理及其在农作物上的应用,并对今后的发展方向进行了展望。
王欣月[9]2003年在《花器喷雾法接种根癌农杆菌转化矮生菜豆条件的初步探索》文中提出目前菜豆基因转化研究的主要困难是植株再生系统难于建立和转化效率较低。农杆菌介导拟南芥的花器喷雾法(floral spray)是当前不需要组织培养及植株再生的最简单的转化方法，这种方法在其他作物上还没有成功应用。本论文是尝试将该方法用于转化矮生菜豆的研究。矮生菜豆生育期短，植株矮小直立，是比较理想的研究菜豆转化的材料。通过对农杆菌在矮生菜豆花器中的存活状况、vir基因的表达情况、T-DNA的转移情况的研究，初步探讨了该方法在农杆菌介导的矮生菜豆的遗传转化中的可行性。 为了更好的研究花器喷雾法的可行性，我们首先利用针刺注射花器的方法保证接种菌液进入到花器中去，对不同接种时期、不同接种菌液条件下的农杆菌存活、vir基因表达情况进行了研究。研究表明，接种的六个时期农杆菌存活都很好，vir基因表达水平也很高；接种菌液浓度(OD_(600)值表示)为0.8—1.3时，vir基因表达最好；糖类物质以及细胞分裂素BAP能够大大提高vir基因的表达水平，其中蔗糖的效果比葡萄糖好；接种菌液中是否加入乙酰丁香酮AS对vir基因的表达水平没有影响。我们进一步利用在T-DNA上含有GUS基因的农杆菌菌株LBA4404(pTOK233)研究最佳接种时期，结果表明，最佳接种时期应在授粉之前，菜豆花现蕾的第一天到第二天。 花器喷雾法转化植物的难点在于接种菌液能否进入到花器中去，并到达靶标位置。研究表明表面活性剂可对其有所帮助。目前花器浸蘸法所常用的表面活性剂为Silwet L-77，本研究显示该试剂用于花器喷雾时对农杆菌进入矮生菜豆花器的帮助不大。然而我们选用EMCOL 4012、渗透剂T和MORWET EFW可有效地使农杆菌进入到矮生菜豆花器内。这表明，这些表面活性剂可能有利于使菌液进入到其它植物花器中，从而有助于在其它植物上进行高效的花器转化。这对用农杆菌进行花器转化的方法改良提供了新的方向。
韩笑[10]2012年在《白菜浸花法转基因技术研究》文中进行了进一步梳理白菜（包括结球白菜和不结球白菜）在亚洲特别是中国、日本和韩国是最重要的蔬菜。白菜的生产过程易受虫害侵扰，且需水量大。通过基因工程导入外源基因，可以创造出白菜的新种质，进而从根本上改变白菜种质资源。农杆菌介导的浸花（floral-dip）转化方法是近年发展起来的一种较简便的不依赖组织培养的转基因方法。该方法的优点在于可以避开组织培养和继代培养，直接获得转基因的种子，而且相对于真空转化，对仪器设备要求较低。因此，该转化方法适用于难以进行组织培养和离体再生的植物。本研究以携带pBBB-intron-gus质粒的农杆菌C58为转化用工程菌，对5个结球白菜品系（08-1083-2，08-1084-2，02-311，02-507，06-940）和不结球白菜四九菜心进行农杆菌介导的浸花转化，以期为探索功能基因导入白菜活体的方法提供一定的理论根据。其中大白菜品系08-1083-2收获了14棵抗性株，经鉴定后证明没有获得转化株，不结球白菜四九菜心获得4棵抗性株，GUS检测为非真实转化株。为了进一步探讨农杆菌通过浸花处理难以进入白菜花器官的可能原因，对拟南芥和四九菜心两种材料不同发育阶段的花蕾进行形态及解剖观察，以研究二者在花发育节律及形态结构上的差异。结果显示，两种材料均是幼嫩子房时成开口杯状，随着花蕾长大，心皮逐渐闭合；调查新生花蕾在花序总花蕾中所占的比例，四九菜心为20%，而拟南芥高达62.6%；综合形态及解剖观察结果，可以推断花蕾期心皮闭合至开花的时间，四九菜心约为15天，而拟南芥仅需3天。有研究指出，开放的心皮形成的孔道可能是是农杆菌进入供试材料体内的途径之一，而浸花法转化发生的部位大多在未成熟花蕾中。由此可以推断，过早闭合的心皮可能是造成农杆菌不能顺利进入四九菜心的原因之一，而新生花蕾占总花蕾比例较低造成四九菜心转化率的降低。为了证实这一推测，本研究对不结球白菜引心360和拟南芥进行了平行浸花实验，分析供试材料花器官中农杆菌数量的差异，试图阐释白菜转化率低的原因。首先以含0.225g/L ppt除草剂Basta的溶液喷施处理株收获的种子，对照材料获得了抗性株（3株），其植株转化率为20%，而引心360没有获得抗性株。GUS检测证明拟南芥抗性株中外源基因得以表达。然后采用细菌平板培养法，研究处理材料花蕾内农杆菌的数量差异。结果表明，在浸花处理后的6天内，在添加拟南芥花蕾提取物的筛选平板上，仍能培养出60-900的菌落数（s/g），而在加白菜花蕾提取液的平板上，菌落形成单位为0。这说明农杆菌很难通过浸花处理进入白菜花器官内，在一定程度上解释了为何白菜的转化频率远远低于拟南芥。
参考文献：
[1]. 农杆菌组培及叁种非组培法在小麦和玉米上转化外源Bar基因研究[D]. 梁雪莲. 山西农业大学. 2002
[2]. 农杆菌介导小麦非组培转化方法的探讨[D]. 王成杰. 中国农业大学. 2004
[3]. 毛竹非组培转基因及转DhNiR基因水稻后代性状分析[D]. 郭晓梅. 浙江农林大学. 2017
[4]. 小麦农杆菌介导不同遗传转化体系的建立及比较研究[D]. 杨云霞. 中国农业科学院. 2005
[5]. 农杆菌介导紫花苜蓿子叶节的遗传转化研究[D]. 程宁宁. 河南农业大学. 2014
[6]. 津田芜菁花青素合成非依光型T-DNA突变体的构建及分析[D]. 刘明雪. 东北林业大学. 2013
[7]. 植物非组培转化方法获得转基因植株[D]. 张婷婷. 山西大学. 2011
[8]. 非组培遗传转化法在农作物上的应用[J]. 任海红, 任小俊, 王英, 刘学义. 山西农业科学. 2010
[9]. 花器喷雾法接种根癌农杆菌转化矮生菜豆条件的初步探索[D]. 王欣月. 中国农业大学. 2003
[10]. 白菜浸花法转基因技术研究[D]. 韩笑. 曲阜师范大学. 2012
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