聚合酶链技术检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的研究论文_李胜男

李胜男

天津市第二人民医院 300192

摘要:目的 分析聚合酶链对肝硬化患者腹水细菌DNA的检测效果。方法 选择细菌通用引物,引入到16S rRNA基因保守区,本次研究中,选择48例腹水样本,对样本行PCR扩增处理和阳性阴性对照实验。分析实验结果。结果 在分析48例标本时,在15例标本中获得了370bp DNA片段,进过检测,阳性率为31.25%。而阴性和空白对照标本则并未体现出特异性。在PCR扩增后,可以检测出10pg DNA。结论 在肝硬化腹水患者的检测中,采用聚合酶链技术,可以达到特异性和敏感性的需求,便于检测患者的细菌情况,具有较高的临床诊断价值。

关键词:肝硬化;细菌易位;聚合酶链技术;16S 核糖体RNA基因

随着医疗事业的不断发展,对细菌易位的研究不断深入,以往主要集中在对活性肠道菌通过肠道屏蔽的研究,而现阶段,则逐渐扩展到对其他器官的研究[1-2],延伸到细菌释放产物的易位。本研究尝试从细菌DNA水平探讨细菌易位的发生。

1对象与方法

1.1病例选择

研究时间为2015年8月-2017年2月,研究地点为天津市第二人民医院,在肝病科室选择48例肝硬化合并腹水患者,其中男性39例,女性9例,年龄26-69岁,平均54.5岁,纳入标准:(1)患者经过临床诊断确诊为肝硬化合并腹水;(2)患者及其家属同意本次研究且签署知情同意书。排除标准:(1)患者入院前14d内使用抗生素;(2)继发性腹膜炎患者。

1.2研究方法

1.2.1标本采集 在患者住院时,当天抽取患者腹水,对腹水进行常规检查,采用需氧菌培养和厌氧菌培养模式,另外,选择10ml腹水,分别装在5个2ml的试管,放置在-70℃的环境保存。腹水标本采集均于使用抗生素之前进行。阳性对照菌选取常见引起临床细菌感染的菌株。

1.2.2检测试剂 PCR扩增仪、GELDOC-200型凝胶成像系统、紫外分光光度计、UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒(SK1341)及HBV-DNA荧光定量检测试剂盒(上海生工生物工程有限公司)、Taq酶D334A及DL1000 DNA Marker(大连宝生物技术有限公司)。

1.2.3引物设计 文献[3]的学者在研究过程中,对引物进行设计,采用北京华大公司生产的引物进行合成和纯化处理,经过分析,发现其正向序列为,反向序列为,在片段长度方面,整体扩增了370bp。

1.2.4 DNA提取 参照上海生工生物工程有限公司UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒(SK1341)说明书进行腹水标本、阳性对照菌株、白色念珠菌及人基因组DNA的提取,HBV-DNA提取按照HBV-DNA荧光定量检测试剂盒说明书提取。

1.2.5 PCR扩增分析与测序研究

本次实验中,PCR的反应体系设计为25μL,包括

(1)12.5μL的TaqDNA聚合酶。

(2)7.5μL的灭菌双蒸水。

(3)1μL的上游引物和下游引物。

(4)3ul的模板。

在反应条件的设计方面,设计为95℃,在反应4min后,进入循环,保证循环模板在94℃的环境下运行30s,之后进行退火处理,在55℃的环境下保存30s;之后将引物延伸到72℃的环境中,持续60s,共开展30个循环,最后,将引物放置在72℃的环境下持续7min。对引物开展阳性、空白和阴性检测,通过琼脂糖凝胶电泳的方式来扩增。选择GELDOC-200设备记录成像。如果琼脂糖凝胶显示为阳性,则证明腹水中包括DNA,则完成本次实验。

2结果

2.1PCR扩增结果分析

本次研究中,分析48份样本,其有15份为阳性,琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

图1 腹水细菌DNA阳性标本电泳结果(M为DL1000marker、

1-15代表腹水DNA阳性标本、16是阴性对照、17代表空白对照)

2.2样本特异性分析

本次研究中,对10种菌株进行检测,并且进行PCR扩增处理,在370bp位置,发现存在DNA条带,通过分析发现,白色念珠菌提取DNA,并且实现扩增,但是并未发现特异性的条带,具体结果如图2。

图2 阳性、阴性及空白对照电泳结果(1-10为阳性对照、11-13为阴性对照、14为空白对照)

2.3实验敏感性

10-6g/ul-10-12g/ul浓度测试中,经过电泳分析,发现在370bp位置发现特异性条带,但是在10-13g/ul浓度以下并未发现,因此,通过结果的分析,认为10pg是最低的检测浓度。如图3所示。

图3 实验敏感度(1-10分别代表10-6g/ul-10-15g/ul浓度的DNA标本)

3 讨论

本研究通过在细菌16S rRNA基因保守区在处理过程中,对10株进行引物扩增,获取阳性DNA诊断结果,发现其与GBV-DNA并无明显的交叉,在倍比稀释的方法下,确定10pg是最低的检测浓度,因此,通过分析发现,该方法用于肝硬化检测具有较高的价值。

参考文献:

[1]申红霞,娄小平,苌新伟,等. 肝硬化患者自发性细菌性腹膜炎危险因素的Meta分析[J].世界华人消化杂志,2016,24(12):1903-1909.

[2]杨大明,孟宪镛.自发性细菌性腹膜炎研究进展.国外医学内科分册,2002,29:345-348.

[3]袁春,黄长形,连建奇.PCR测肝硬化腹水中细菌DNA的研究[J].透析与人工器官,2007,3(18):20-24.

论文作者:李胜男

论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年6月17期

论文发表时间:2018/8/16

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