徐记迪[1]2015年在《柑橘全基因组DNA甲基化分析及调控作用研究》文中认为表观遗传是指DNA序列不发生变化,但基因表达却发生了可遗传的改变。真核生物中,表观遗传通过调控染色质构象进而影响基因表达来控制植物的发育,其调控机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和小干扰RNA。近年来,表观遗传在植物发育和环境互作中的调控作用被广泛研究,但在柑橘上的研究尚少。为了揭示表观遗传在柑橘生长发育中的调控作用,本课题研究了DNA甲基化在柑橘果实发育过程和愈伤类胡萝卜素代谢的调控作用,并对柑橘基因组中组蛋白修饰酶基因进行了鉴定和分析。另外,本研究还以柑橘胚珠为材料,利用表观组的研究方法解析了柑橘多胚发育过程中的表观变化。主要研究结果如下:1.果实发育过程中DNA甲基化的变化通过毛细管电泳测定6个果实发育时期的DNA甲基化水平,发现DNA甲基化修饰随着果实发育和成熟是动态变化的。进一步克隆了DNA甲基化控制基因,包括3类DNA甲基转移酶基因(CsMET1,CsCMTs and CsDRM1),一个染色质重塑基因(CsDDM1)和去甲基化基因(CsDMEs)。对上述基因在不同组织以及不同果实发育时期的表达分析发现,CsDRM1在幼苗、叶片和花中呈现高表达;在果实发育过程中,CsMET1、CsCMT1、CsCMT2、CsDRM1、CsDMEs在果皮中偏好表达。通过对全基因组甲基化水平的测定和DNA甲基化相关基因的表达分析,说明全基因组甲基化图谱的建立是由甲基化和去甲基化共同作用形成的,且随着生长发育过程而变化。2.5-氮胞苷处理诱导愈伤中类胡萝卜素的降解为了探究DNA甲基化在类胡萝卜素中的调控作用,本研究利用去甲基化试剂5-氮胞苷(5azaC)对高积累类胡萝卜素的愈伤系进行了梯度处理。随着处理浓度的升高,愈伤中类胡萝卜素的含量逐渐降低。上游类胡萝卜素的降解也造成了下游ABA含量的下降。对类胡萝卜素代谢途径中的基因表达分析发现,CpCCD1被大量诱导上调表达。原核表达CpCCD1蛋白到类胡萝卜素工程菌中的实验证实,CpCCD1对玉米黄质、β-胡萝卜素、番茄红素有较强的降解作用。此外,本研究发现5azaC处理虽然造成了全基因组范围内的去甲基化作用,但仍然有一些位点的甲基化水平升高。进一步对控制DNA甲基化的基因进行表达分析发现,5azaC处理可以诱导DNA甲基转移酶基因的表达,推测这些基因的上调表达造成了处理后某些位点甲基化水平的升高。对处理前后愈伤的表达谱分析发现,3380个基因在处理后差异表达,其中2047个基因上调表达,1333个基因下调表达,同时发现MYBs、WRKYs、NACs等大量的转录因子在处理后被激活。进一步的甲基化组分析发现5azaC的去甲基化作用主要发生在基因间区和基因的上游2kb和下游2kb区域。通过筛选,共鉴定出3082个甲基化差异基因(包括基因的启动子区和基因区),其中包含682个上调基因和2400个下调基因,说明5azaC处理造成了广泛的全基因组范围内的去甲基化作用。对甲基化差异基因的功能分类进行分析发现,差异基因主要分布在蛋白质水解、转录因子、信号转导、逆境响应、激素代谢等途径。3.柑橘胚珠发育过程中发生了全基因组范围内的甲基化修饰本研究利用甲基化免疫共沉淀结合高通量测序(MeDIP-seq)的方法首次对柑橘胚珠发育过程中的甲基化组进行了解析。以红夏橙开花前10天(多胚起始前)和开花后15天不授粉(多胚起始后)的胚珠为材料进行甲基化组分析,共鉴定了2349个甲基化差异基因,其中2245个基因上调,104个基因下调,大部分基因的甲基化水平上调说明在这两个时期发生了全基因组范围内的加甲基化修饰。克里曼丁(单胚)受精前后(开花前~1天;开花后15天)的胚珠中也发现了全基因组范围内的加甲基化现象。推测在配子形成过程中发生去甲基化重排后,本研究选取的胚珠组织正处于重新恢复甲基化的阶段。对红夏橙多胚起始细胞发育前后两个时期胚珠的转录组分析共得到1361个上调表达基因和1126个下调表达基因。功能分类显示差异表达基因主要参与激素信号转导、蛋白质水解以及微管等生物学过程。进一步基于前人通过遗传学定位的多胚控制区域,分析了该区域内甲基化变化的基因,并在该区域筛选出了可能与胚发育相关的候选基因。4.全基因组范围内鉴定和分析组蛋白修饰基因基于已测序的甜橙基因组序列,共鉴定了136个组蛋白修饰基因,其中包括四类修饰基因:组蛋白甲基转移酶基因(47个)、组蛋白去甲基化基因(23个)、组蛋白乙酰化基因(50个)以及组蛋白去乙酰化基因(16个)。根据序列特点,将上述基因分为11个基因家族,并对这些基因的染色体分布、基因聚类、基因结构以及保守结构域进行了分析。为了研究这些基因在柑橘果实发育过程中的潜在作用,对筛选出的42个果实高表达基因在6个果实发育时期进行了表达分析,鉴定出了一系列与果实成熟相关的组蛋白修饰基因。进一步对这些基因在响应青霉菌(Penicillium digitatum)侵染果实过程中的表达进行了分析,共筛选出了20个青霉菌侵染响应基因。基于这些分析结果,从中挑选候选基因CsSDG7进行转基因功能验证,发现在山金柑中干涉CsSDG7后,转基因系可以出现早花的表型。
高中锋[2]2016年在《DNA电化学生物传感器的构建及其生化分析新方法研究》文中提出随着精准医疗、基因测试、法医鉴定、环境检测等研究领域的迅速发展,实现对病原蛋白和特定序列DNA的快速、灵敏、简单的痕量分析越来越重要。基于DNA的电化学生物传感器由于轻巧便宜、能耗少、灵敏度高和易于微型化等优势引起了广泛的关注,成为当今生化分析、转化医学等交叉领域的前沿性课题。核酸分子体外等温扩增技术是分子生物学领域常用的一种研究方法。DNA电化学生物传感器利用电化学检测的高灵敏性,与各种可再生策略和信号放大策略相结合,可以实现对痕量靶标的灵敏检测。本文围绕DNA电化学生物传感器研究的关键问题,即如何快速制备稳定、高活性的传感界面,如何构建信号重现、可再生的新型器件、如何进行信号放大实现对靶标高灵敏的检测等问题,制备了一系列新型DNA电化学生物传感器,并将其应用于生化分析中。以DNA探针为平台,结合DNA链置换反应、生物酶催化、聚鸟嘌呤纳米线等技术,在发展DNA电化学生物传感检测方面做了以下工作:1.基于低pH和高盐浓度缓冲用于金固相界面快速组装单链DNA探针实现单链DNA(ssDNA)探针在传感界面上的快速、稳定、简单的组装,可以有力推动DNA电化学传感器临床检测、现场诊断等方面的实际应用。本章中,利用低pH高盐浓度方法实现了ssDNA在金电极表面的快速固定化,探针组装过程可以在30分钟之内完成,且不会影响DNA探针的杂交活性。更深入的探讨了固定机理,通过电化学阻抗图谱计算出ssDNA探针在电极表面的覆盖度和反应的吉布斯自由能,说明低pH高盐浓度方法是通过化学吸附,即共价键结合的方式将ssDNA固定在金电极表面。pH和盐浓度均会影响固定化进程,两者存在协同作用。这种方法相比于传统方法(生理pH缓冲)操作更加简便、快速,对不同长度DNA片段均可以作用,具有较好的普适性。因此,该方法适用于构建各种基于DNA的电化学传感器,在快速制备dna传感芯片等领域有较强的潜在应用价值。2.基于dna链置换反应和锁核酸技术构建可再生dna电化学传感器用于检测单核苷酸多态性近年来,单核苷酸多态性(snp)的灵敏检测一直是基因诊断研究中的重要课题。本章报道了一种基于锁核酸修饰技术和dna链置换反应构建的可再生电化学传感器,并将其用于p53基因273位点单碱基突变的灵敏检测。此类传感器件可以通过监测电流信号on和off的状态判断目标物存在与否。当电流信号由on转变为off时,电极表面由于目标物的存在发生了dna链置换反应。当有其他干扰序列存在时,电流信号不变,体系依旧保持on的状态。把lna和sdr技术引入到检测体系中,提高了链置换反应的速率和传感器检测的效果。此外,本章构建的传感器具有优异的选择性和稳定性,在污染缓冲和高倍数鱼精基因组中仍然可以实现对目标基因的检测。同时,实验过程中无生物酶的参与,不需要复杂的仪器操作和精密的温度控制。因此,这个新设计的dna电化学传感器对于目标dna分子的检测不仅具有较好的灵敏度,而且具有优异的选择性和可再生性,在未来的生物芯片设计中具有良好的应用前景。3.基于i-motif构象转换构建可再生dna电化学传感器用于检测葡萄糖和尿素以i-motif结构为基础开展了广泛研究,如拓扑性质、ph传感、纳米机器等。然而,利用i-motif结构作为传感器元件,探讨在生物检测方向的应用少有报道。本章通过利用富含胞嘧啶的dna探针在不同ph值下的构象转变,发展了一种新型简单且无标记的电化学方法,用于检测葡萄糖和尿素。通过葡萄糖氧化酶和脲酶的生物催化反应实现反应溶液ph值的调节,进而调节富含胞嘧啶的dna探针在单链构象和i-motif构象之间的转变。通过电化学阻抗的方法可以实现对构象转变的表征,利用电化学阻抗值的变化可以实现对目标物葡萄糖和尿素的检测。由于酶催化的优异特异性,使此传感器具有较高的选择性,其他生物分子干扰物不影响目标物的检测。此外,此传感器还具有较高的可再生性能和稳定性,具有较强的潜在应用价值。4.基于聚鸟嘌呤纳米线信号放大灵敏检测核酸片段近年来,许多信号放大测试策略已被报道用于构建灵敏的电学、光学等传感平台,实现对核酸、蛋白等生物分子的检测。但大多数检测方法具有贵重的温控仪器、复杂的实验步骤、耗时长等缺点。因此,开发简便易行、快速灵敏的新型信号放大策略具有十分重要的意义。本章中利用富含g碱基的c-mycdna序列,在钾离子存在下形成具有TMB催化活性的G-四链体,继续加入镁离子后形成一系列具有TMB催化活性的聚鸟嘌呤纳米线(G-wire)。我们将此现象作为信号放大方式应用于金电极上灵敏检测DNA片段。把巯基修饰的c-myc序列连接在金电极上,加入游离的c-myc序列和镁离子,利用计时电流法和电化学阻抗法均检测到TMB催化信号的增强。随后,利用目标DNA打开发卡结构探针,使c-myc序列暴露,形成G-wire后进行信号放大检测,最低可检出15 pM。此方法不需要生物酶的参与,避免了复杂的温控过程,可以在室温下进行。与其他方法相比,该方法在灵敏度、线性范围上具有优点,有望满足基本的复杂样品检测需求。5.基于聚鸟嘌呤纳米线信号放大灵敏检测凝血酶凝血酶的活性及含量可以作为衡量凝血机制的关键指标之一,它对相关疾病的早期诊断、治疗及愈后判断具有非常重大的意义。建立快速、准确、简便、高灵敏的分析检测策略和传感装置用于凝血酶的定量分析在化学、生物、医学等领域中十分必要。本章以聚鸟嘌呤纳米线为信号放大结构构筑了免标记型的电化学传感器用于灵敏检测凝血酶。目标蛋白凝血酶可以与电极上的适配体和溶液中的L-DNA同时结合形成夹心结构,将L-DNA组装到电极上,在游离的c-myc和镁离子的存在下引发G-wire的生成。在测试底液TMB和H2O2中,聚鸟嘌呤纳米线与hemin结合形成具有TMB催化功能的DNA酶串联体,对TMB的催化反应电流起到了明显的增强作用,从而有效地提高了电极灵敏度。实验结果表明,该电化学适体传感器制备方法简单、稳定性好、具有较高的选择性和灵敏度,将其用于临床模拟样品的分析检测得到了令人满意的结果。6.聚肾上腺素荧光有机量子点的合成及其重金属离子检测应用荧光有机纳米材料因具有低毒、较好的生物相容性、功能性可调等优点,被认为在生物成像和疾病标志物诊断等领域具有较好的应用前景。本章通过“一锅煮”的简便合成方法合成了发绿色荧光的聚肾上腺素荧光有机量子点。这种荧光材料具有较好的水溶性、光稳定性和生物相容性。Fe2+、Fe3+、Cu2+的加入可以猝灭其荧光。经过NaF的前处理,调节反应时间,根据荧光信号的变化可以区分叁种金属离子。实验进一步证明,本章中提出的PEP-FODs具有较好的细胞成像效果,可以用于胞内检测金属离子,有望作为一种新型荧光探针应用生化分析和生物成像。
陈熙[3]2016年在《有机磷农药降解质粒在土壤中的转化规律研究》文中研究表明土壤是地球上最大的生物多样性宝库,土壤微生物间的基因交流是提高生物适应环境和生存能力的重要途径,也是形成土壤生物群落多样性的遗传信息基础。随着遗传工程微生物向土壤环境中的释放呈日益增长的趋势,这些微生物及其携带的用以提高农作物产量或修复治理污染的遗传基因在环境中的安全及归宿引起了科学工作者及公众的广泛关注。本文以革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、革兰氏阴性细菌恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)及多种典型土壤矿物为材料,综合应用等温吸附与解吸、等温滴定量热和衰减全反射红外光谱技术,测定了DNA与细胞-矿物复合物作用过程吸附量、亲和力、热力学参数及基团变化,以揭示其与土壤组分的相互作用机制。并以有机磷农药降解质粒为对象,结合荧光定量PCR和流式细胞术等方法,研究了游离态及固定态胞外DNA在环境中的存留时间,及向土着微生物进行水平转移的可能性。获得如下主要结果:(1)揭示了DNA在土壤细菌-矿物复合物上的吸附行为及作用机制。选取鲑鱼精DNA、两种常见的土壤细菌(枯草芽孢杆菌和恶臭假单胞菌),以及叁种典型土壤矿物(高岭石、蒙脱石和针铁矿)为实验材料。表明所有细菌-矿物复合物对DNA的吸附可用Langmuir方程拟合。DNA在枯草芽孢杆菌-矿物复合物上的吸附量相比其在两种单一组分上的等比例吸附值之和有所提高,表明细菌与矿物的吸附能增加该体系对DNA的吸附量。DNA与枯草芽孢杆菌-矿物复合物结合时的焓变主要来自细菌与DNA分子,其主要作用力为范德华力及氢键。DNA与恶臭假单胞菌-矿物复合物相互作用的情况则受到矿物类型的影响,其与恶臭假单胞菌-高岭石复合物进行吸附时主要作用力为范德华力及氢键;而与恶臭假单胞菌-蒙脱石/-针铁矿的作用力则应归结于脱水作用及水分子重排引起的熵增。(2)成功构建携带双重标记的有机磷农药降解质粒,发现游离及固定态质粒的转化效率受质粒类型、矿物种类及宿主类别等多因素影响。以有机磷高效降解质粒pB17、广宿主载体pBHR1及抗重金属细菌恶臭假单胞菌X4的小质粒为材料,对其进行增强型绿色荧光蛋白基因egfp及卡那霉素抗性基因kmr双重标记,得到重组质粒pRB17、pXr及pBr。并对叁种游离态质粒及与蒙脱石、高岭石、针铁矿吸附后的固定态质粒进行了实验室水平的转化实验。结果表明,以广宿主载体为基础所构建的降解质粒具有向更多种类细菌转移的能力。游离态的DNA较固定态DNA有更高的降解速率。DNA与矿物吸附后进行转化,所获得转化子的数量有不同程度的降低。游离态pBr转化大肠杆菌DH5α其转化效率可达2.98×105个转化子/μg DNA,而与蒙脱石、高岭石及针铁矿吸附后,转化效率分别下降了2~4个数量级。类似的结果也出现在pXr转化DH5α的过程中,与叁种矿物结合后的转化效率下降了1~3个数量级。表明与DNA亲和力强的矿物降低DNA转化效率的作用更明显。(3)阐明了游离及固定态质粒在土壤环境中的稳定性特征及生物可利用性。结果表明DNA在进入土壤的最初阶段降解迅速,3~7天后降解曲线逐渐平缓。游离态DNA较固定态DNA在土壤中的降解速度更快,经DNA回收转化大肠杆菌后,其转化效率的下降也更为显着。DNA被不同类型矿物吸附后其降解效率也存在差异。与高岭石和针铁矿相比,吸附于蒙脱石表面的DNA分子降解速率更慢,在第3天时残留量仍保持在50%以上,而且第15天仍能成功转化至大肠杆菌中。表明蒙脱石对DNA具有更好的保护作用,使其能免受核酸酶的降解,具有更长时间的生物可利用活性。(4)比较了多种检测环境中小概率水平基因转移事件的实验手段,提出抗生素富集联用流式细胞分选术能有效分离土壤中的罕见目标细胞。证实了胞外DNA具有向土着微生物进行转移的能力。选择游离态及蒙脱石固定态质粒pBr及pXr作为土壤转化实验DNA供体,武汉市两处地点的棕红壤作为受体细菌来源,土样样品设置堆肥或有机磷农药处理组。利用荧光显微镜、标记基因PCR扩增及流式细胞术直接对土壤中的转化子进行检测,检测限均低于2×10-6,未能检测到阳性转化子的存在。通过抗生素富集及流式细胞多轮分选技术对样品进行筛选可有效将检测限提高至10-11量级。所分得菌株均为来源于菜园土和添加农药处理实验组的pBr质粒转化子,属肠杆菌目肠杆菌科。广宿主载体的使用、土壤微生物群落组成与结构及农药施用对土壤菌群的选择性压力或为转化效率增加的重要原因。
彭莘媚[4]2016年在《新型香豆素类化合物：设计、合成及其作为抗微生物制剂与DNA人工探针的相关研究》文中研究指明香豆素是一类重要的含苯并α-吡喃酮结构的芳香氧杂环化合物,具有较大的共轭体系,强的分子内电子转移能力以及良好的热力学和光化学稳定性。这种特殊的刚性稠环结构使其易于进行结构修饰并能方便地引入各种功能基团,因而在食品、燃料、香料、光电材料、医药、农药、超分子识别等众多领域具有广泛的潜在应用。尤其是在医药领域,香豆素类化合物在抗细菌、抗真菌、抗癌、抗病毒、抗氧化、抗凝血、抗炎等方面发挥着重要作用,相关研究备受关注,日益活跃,发展十分迅速。一些香豆素类药物如华法林、双香豆素、醋硝香豆醇、双香豆素乙酯、亮菌甲素、羟甲香豆素、氯达香豆素、卡波罗孟等已广泛应用于临床。在抗感染领域,基于香豆素的抗生素如香豆霉素A1、新生霉素、氯新生霉素等已得到广泛研究,它们不仅可通过抑制叁磷酸腺苷酶的活性阻碍DNA的超螺旋,导致细菌死亡,还可作用于DNA拓扑异构酶II或DNA回旋酶,干扰DNA的复制、转录和染色体的分离,从而有效抑制细菌的生长。近些年,许多人工合成的香豆素类化合物显示出了良好的抗微生物活性及宽的抗微生物谱,尤其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长具有突出的抑制作用,具有开发成药的希望,致使无数研究者致力于香豆素类抗微生物药物的开发。此外,香豆素类化合物在作为探针方面的应用也得到广泛研究,许多文献已报道了基于香豆素分子结构的生物分子探针,这类探针的开发应用有助于人们适时地了解生物体内生物大分子的活性、重要的生命过程及药物的药理学与药代动力学性质等,为疾病的预防、药物的研发与临床应用提供可靠的监测手段。鉴于此,本文基于香豆素类化合物在国内外抗菌抗真菌领域及作为生命物种探针方面的研究与开发现状,一方面结合本课题组有关香豆素类抗感染活性分子的研究基础,设计合成了一系列新型的香豆素类抗菌抗真菌化合物,探索了目标化合物的制备方法与条件,并对其进行了体外抗菌抗真菌活性、构效关系及抗菌作用机制的研究;另一方面,对新合成的香豆素叁唑基乙醇化合物作为DNA探针进行了初步的体外评估,主要工作总结如下:(1)新型香豆素喹诺酮类抗菌杂合体的合成:以取代苯酚为起始原料构筑不同结构的香豆素母核环II-3a-b,II-7和II-8,其中II-3a-b与氯乙酰氯经亲核取代反应制得中间体II-4a-b,而香豆素II-7和II-8则与二溴化合物反应得到中间体II-9a-c和II-10a-c,中间体与不同的喹诺酮化合物在乙醇的碱性溶液中回流反应即可快捷有效地得到香豆素喹诺酮类杂合体II-5a-f,II-11a-i和II-12a-i;(2)新型香豆素唑基乙醇类化合物的合成:以取代苯酚为起始原料构筑不同结构的香豆素母核环III-2和III-11,再与环氧氯丙烷经亲核取代反应快捷有效地制备环氧化合物中间体III-3和III-12,最后在乙醇为溶剂及碳酸钾为碱的条件下分别用各种唑类化合物开环得到香豆素唑基乙醇类化合物III-4a-e,III-5,III-6a-b,III-7a-b,III-8,III-9,III-13a-e,III-14,III-15a-b,III-16a-b和III-17;(3)新型香豆素查尔酮类化合物的合成:以间苯二酚为起始原料构筑7-羟基-4-甲基香豆素母核环IV-2,再经分步反应获得香豆素醛基化合物IV-3和取代的香豆素醛基化合物IV-4a-c,两者与不同取代的唑酮类化合物IV-7a-d在以甲苯为溶剂,冰醋酸和哌啶为催化剂的条件下于130 oC反应制得香豆素查尔酮类化合物IV-8a-d和IV-9a-l;(4)新型香豆素苯并咪唑类化合物的合成:以取代苯酚为起始原料构筑不同结构的香豆素母核环V-2a-b和V-15,再经分步反应制得对应的香豆素醛基化合物V-3a-b和V-16,在DMF溶液中化合物V-3a-b和V-16与邻苯二胺类化合物于80 oC下反应分别得到香豆素苯并咪唑类化合物V-4a-b、V-11a-b和V-17a-b,化合物V-4a、V-11a和V-17a再与卤代烃或卤苄类化合物在DMF的碳酸钾溶液中反应制得双取代的香豆素苯并咪唑类化合物V-5a-b、V-12a-d和V-18a-b,另外,香豆素醛V-3a与溴乙烷经进一步亲核取代反应制得中间体V-6,中间体V-3a-b、V-6和V-16再与取代的邻苯二胺类于DMF溶液中反应即可简便高效地得到单取代的香豆素苯并咪唑类化合物V-7a–b、V-10a–j、V-13a–j和V-19a–d;(5)所有新化合物的结构均用IR、1H NMR、13C NMR、MS和/或HRMS等现代波谱手段证实;(6)探索了溶剂、催化剂和反应温度对系列III香豆素唑基乙醇类化合物制备的影响,研究结果发现以乙醇为溶剂、碳酸钾为催化剂且反应温度为70 oC时目标化合物III的产率最高。(7)研究了系列II中目标化合物的体外抗细菌、抗真菌活性。活性研究结果显示大部分的香豆素喹诺酮类杂合体显示出较强的抗菌活性和较广的抗菌谱,并且对所测真菌菌株也具有较强的抑制能力。其中与香豆素4-位杂合的目标化合物II-11a–i的抗菌抗真菌活性普遍比较强,然而活性最强的杂合体是II-12g,它对所测细菌和真菌均显示出强的抑制能力,其抗菌活性优于参考药物氯霉素、诺氟沙星和氟康唑,与环丙沙星和克林沙星相当;(8)研究了香豆素喹诺酮类杂合体II-5b、II-12d和II-12g与参考药物的联用效果。发现化合物II-5b对革兰阴性菌的联用效果普遍高于革兰阳性菌,且其与环丙沙星联用时能得到更好的效果。化合物II-12d与诺氟沙星联用时对金黄色葡萄球菌的敏感度最高,FICI值为0.062。化合物II-12g与氯霉素联用时,对除金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌外的所有测试菌株均表现出协同作用,并且该化合物对MRSA的药物联用效果高于II-5b和II-12d,这一结果表示杂合体II-12g在药物联用时具有解决细菌耐药性问题的潜能。另外,化合物II-5b、II-12d和II-12g能较快地抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长,甚至在培养12代后也没有明显诱导金黄色葡萄球菌和MRSA耐药性的产生。分子对接结果显示,这叁个化合物同时还具有DNA回旋酶抑制能力;(9)研究了香豆素喹诺酮类杂合体II-12g的抗菌作用机制。利用紫外、荧光光谱法和DNA探针探索了高活性目标分子II-12g与小牛胸腺DNA的相互作用,研究结果表明化合物II-12g能以嵌入的方式与DNA碱基形成稳定的复合物,从而影响细菌和真菌DNA的复制,起到抑菌作用;(10)研究了系列III中目标化合物的体外抗细菌抗真菌活性、log P和高活性目标化合物III-14与小牛胸腺DNA的结合能力。研究结果显示与参考药物相比,部分目标化合物显示出中等或较强的抑菌能力及较广的抗菌谱。香豆素双叁唑醇化合物III-14表现出最强的抗菌活性,尤其是对于MRSA(MIC=8μg/m L),其抑菌活性与诺氟沙星(MIC=8μg/m L)相当,并强于氯霉素(MIC=16μg/m L)。与氟康唑相比,化合物III-14同样能有效地抑制所测试真菌的生长。利用紫外可见分光光度法所测理化数据log P显示,具有适宜log P值的目标化合物的抗菌抗真菌活性强于其他化合物,这说明化合物的理化性质对生物活性的影响也是相当重要的。另外化合物III-14能与小牛胸腺DNA通过氢键和范德华力与DNA的沟槽结合,形成III-14-DNA复合物,从而影响细菌和真菌DNA的复制,起到抑菌效果;(11)研究了系列IV的目标化合物香豆素类查尔酮的体外抗细菌抗真菌活性。活性研究数据显示多数目标化合物表现出有效的抗细菌抗真菌活性及较宽的抗菌谱。其中活性最好的目标化合物为IV-9h,它对所测试的所有细菌均具有较强的抑制能力,MIC范围为1-8μg/m L,强于参考药物氯霉素(MIC=8-32μg/m L),与诺氟沙星相当(MIC=1-16μg/m L)。同时,除白色念珠菌以外,化合物IV-9h对所测试真菌的敏感度也高于参考药物氟康唑,尤其是对氟康唑不敏感的黄曲霉菌,其抑制效果为氟康唑的512倍。此外化合物IV-9h不仅对藤黄微球菌和痢疾志贺菌具有较快的杀菌速度,且对金黄色葡萄球菌和MRSA即使在培养15代后仍然没有明显诱导其产生耐药性的趋势;(12)深入探讨了系列IV香豆素查尔酮类化合物的构效关系。体外活性研究数据显示,苯环上的取代基对目标化合物抗细菌抗真菌活性的影响明显不及烷基链大,没有烷基链修饰的化合物IV-8a-d及两个碳链修饰的化合物IV-9a-d的生物活性普遍低于四个及六个碳链修饰的化合物IV-9e-l,鉴于以上结果,以活性最好的目标化合物IV-9h苯环上的取代基为基准,选取化合物IV-8d、IV-9d、IV-9h和IV-9l四个化合物进行深入的构效关系研究。通过它们与小牛胸腺DNA的相互作用能力差别证明烷基链的长短对目标化合物活性影响强弱顺序为4碳链>6碳链>2/0碳链,这也进一步阐明了化合物IV-9h活性最强的原因;(13)研究了系列V香豆素苯并咪唑类目标化合物的体外抗细菌抗真菌活性和构效关系。活性研究数据显示部分目标化合物对所测试菌株表现出一定的抗细菌抗真菌活性。筛选出活性最优且抗菌谱最广的目标化合物V-19d,尤其是对藤黄微球菌和MRSA(MIC=0.5μg/m L),其活性强于参考药物氯霉素(MIC=8或32μg/m L)和诺氟沙星(MIC=2或16μg/m L)。另外,香豆素苯并咪唑化合物V-19d具有较好的水溶性(26.65 mg/L),且对金黄色葡萄球菌和MRSA即使在培养15代后仍然没有明显诱导其产生耐药性的趋势,为进一步深入研究提供了可行性。构效关系研究表明,3-位香豆素苯并咪唑化合物的抗微生物活性强于8-位香豆素苯并咪唑化合物,这一结论进一步得到量子化学研究数据分析的证实;(14)研究了香豆素苯并咪唑化合物V-19d的抗菌作用机制。实验结果表明化合物V-19d能有效地透过所测试革兰阳性菌MRSA和革兰阴性菌大肠杆菌的细胞膜。进一步实验结果显示其抑制50%生物膜生成的浓度即IC50值对MRSA和大肠杆菌分别为0.5μg/m L和1μg/m L,且其分解50%生物膜的浓度即EC50值对MRSA和大肠杆菌分别为3.2μg/m L和6.25μg/m L;(15)合成了香豆素叁唑基乙醇化合物VI-7,其结构得到现代波谱手段证实。应用紫外光谱、荧光光谱等光谱学方法研究了化合物VI-7作为DNA人工探针的潜能。实验结果显示化合物VI-7初步有望开发为基于香豆素结构的新型DNA人工探针。本论文共合成141个化合物,其中新化合物102个,包括香豆素喹诺酮杂合体24个,香豆素唑基乙醇类23个,香豆素查尔酮类化合物16个,香豆素苯并咪唑衍生物39个。
李艳丽[5]2016年在《生物高分子水凝胶的制备与表征》文中研究说明生物高分子的水凝胶,兼具了水凝胶的高含水、保水、吸水溶胀、柔软特点和生物高分子的生物相容性,降解性、生物特异性等,使得生物高分子水凝胶生物材料、再生医疗、生物组织工程以及基因治疗等生物医学领域都具有非常重要的意义。然而机械强度差和高昂的制备成本一直是制约生物高分子水凝胶的应用于发展的重要因素。本文通过构建多重互穿网络的方法,通过生物高分子之间、生物高分子与其他高分子之间的物理或化学的相互作用,制备了叁种具有较高强度的生物高分子水凝胶。首先,以CaCO3微球为模板,利用乳液聚合的方法,制备出了一种聚丙烯酰胺-海藻酸钠的高强度高膨胀微水凝胶。由于其结构中叁重互穿的高分子网络的形成,使得该水凝胶微囊表现出优异的可膨胀性和强度。在pH1.2时,该微水凝胶内的CaCO3内核分解,形成水凝胶微囊,且水凝胶微囊的体积增大到原始体积的4.2x105倍而不破裂。此外,该水凝胶微囊具有很好的包载药物的能力,并且在中性条件下保护药物,在pH1.2下,又能将药物释放出来,表现出pH敏感的药物释放功能。在pH1.2时的药物释放与传统的基于气体形成的药物释放体系(gas-formation based drug delivery system)十分的相似,同时水凝胶微囊的结构和制备方法更为简单。然后,本文采用两种生物高分子壳聚糖和海藻酸钠为骨架,构建了具备叁重互穿网络结构的高强度壳聚糖海藻酸钠水凝胶,采用发泡法,在壳聚糖海藻酸钠复合水凝胶中引入多孔结构,制备了一种壳聚糖-海藻酸钠的多孔水凝胶。这种制备方法制备出的壳聚糖海藻酸钠的多孔水凝胶,具有适宜的多孔结构和优异的机械强度,且在不同pH环境下表现出了相似的溶胀性能,此外还具有适宜做组织生长支架的降解性能和良好的生物相容性。最后,选用了具有良好的生物特异性的DNA和具有温度敏感性的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)为原料,通过构建互穿网络的方法,制备了一种DNA-PNIPAAm水凝胶。在此DNA水凝胶的制备过程中,应用简单的化学反应在DNA链上修饰上了多个双键,并保存了DNA的特异性。修饰过多个双键的DNA与NIPAAm共聚交联后,形成了具有双重互穿网络结构的DNA水凝胶。双重互穿网络的形成,把构建DNA水凝胶所需的DNA的浓度降低到了原来的0.91%,并且该DNA水凝胶也具有良好的温度敏感性能。本文通过构建多重互穿网络,提高了生物高分子水凝胶的机械强度,降低了DNA水凝胶制备过程中所需的DNA的浓度,并对制备出的几种生物高分子水凝胶的性质进行了相应的研究。
陈晓辰[6]2016年在《中草药DNA条形码分子鉴定：从基因到基因组》文中指出鉴定中药的“真伪优劣”是确保中药质量的关键所在,而其中“真伪”更是中药临床用药安全的重要前提,特别是针对贵重药材以及有毒中药而言。DNA条形码作为一项快速准确鉴定物种的方法在药用植物基原以及药材鉴定中的应用已非常广泛。通过构建标准的DNA条形码参考数据库是该技术应用的主要形式。尽管不同学者提出了诸多用于植物鉴定的DNA条形码,但由于片段长度的限制,单一序列或多序列组合的条形码在近缘种之间的鉴定仍有很大的局限性。植物叶绿体基因组作为用于筛选DNA条形码序列的研究热点,其本身也可作为超级条形码(Super barcode)用于系统进化、亲缘关系以及物种鉴定研究。本研究围绕DNA条形码鉴定技术,首先以《日本药局方》(以下简称“药局方”)中收载的生药材为对象,构建了药局方生药DNA条形码分子鉴定系统；其次,选取人参属药用植物作为名贵药材代表、乌头属药用植物作为有毒中药代表,分别对该技术在这两个属中的应用进行了研究；最后,利用高通量测序技术测定了乌头属叶绿体基因组,为叶绿体基因组作为超级条形码奠定基础,为筛选适合该属的高变异分子标记提供依据。本研究主要内容及结论如下：1、建立了一套以ITS2序列为主psbA-trnH序列为辅的汉方生药材标准DNA条形码数据鉴定系统。该系统为用户提供了汉方草药信息查询、DNA条形码物种鉴定以及从样品采集到数据分析的标准操作流程叁项主要功能。共搜集来自日本及中国不同地区的基原植物和生药材样本共计576份,从中获取的标准序列覆盖了97.3%的药局方(十六版)收载生药品种。另外搜集了100份待测样本,用来检验数据库的鉴定效果。通过BLAST结果显示,100份样品中有71份样品获得的结果与标签上所标注的物种一致,即准确鉴定到物种水平。其余29份样品鉴定到属水平。本课题建立了全世界首个国家级药品法典的DNA条形码分子鉴定在线平台,为全世界其它如中、美、韩等国家的药典提供示范作用。2、采用ITS2序列对人参属药用植物的SNP位点(single nucleotide polymorphism)进行研究,发现五个稳定的可作为独特标记用来区分人参属不同物种以及人参西洋参混合粉末的种间变异位点。同时,针对人参属ITS2序列的基因组多拷贝进行变异分析,发现ITS2序列在基因组内变异较小时,其在该种的种内变异也较小,反之亦然。再者,使用叁个常用DNA条形码(ITS2、psbA-trnH和matK),共计377条序列,对人参属药用植物的种内变异情况进行了分析,发现这叁条序列在人参、西洋参和叁七中的变异较低,呈现出高度保守的趋势,而在竹节参中的变异相对较大。本课题首次借助SNP位点鉴定人参、西洋参混合粉末,实现了基于DNA条形码方法的人参属珍稀濒危物种及名贵药材的快速准确鉴定。3、对乌头属19个物种的52份样品的ITS、ITS2、psbA-trnH以及matK序列进行扩增和测序,比较候选序列的扩增及测序成功率、种内种间遗传距离、barcodinggap分析,构建系统发育树用以评估它们在乌头属物种中的鉴定能力。结果显示,ITS和ITS2序列在扩增及测序成功率上表现最优,均为100%。psbA-trnH序列次之,matK由于长度较长且含有poly结构,致其扩增和测序成功率较低。除此以外,ITS及ITS2序列在遗传距离、barcoding gap分析上都较其余两个候选序列有明显优势。通过BLAST方法显示ITS序列在该属的鉴定成功率最高(57.9%),构建的系统发育树也显示基于ITS序列的乌头属物种呈现的单系性比例最高(57.9%)。综合上述结果,针对本研究所涉及的乌头属物种,ITS序列的表现最为突出,更适合用于该属物种的鉴定。4、利用高通量测序技术测定了乌头属北乌头(Aconitum kusnezoffi)、牛扁(Aconitum barbatum var.puberulum)以及露蕊乌头(Aconitum gymnandrum)的叶绿体基因组,共含有130个独特的基因,其中包含84个蛋白编码基因,38个tRNA和8个rRNA。通过对它们的比较分析发现大单拷贝区和小单拷贝区的变异大于两个反向重复区。本研究首次测定了植物界中毛茛科乌头属的叶绿体基因组,为其在乌头属系统进化以及物种鉴定等领域的研究提供数据支持。5、利用ClustalW2中的多序列比对功能对乌头属叶绿体基因组的基因以及基因间隔区进行了相似度比较,并从中筛选出了十个变异程度较高的基因间隔区。将筛选出的十个高变异基因间隔区按照统一的顺序进行首尾连接,使其作为一条长度在6 kb左右的长片段分子标记用于乌头属近缘物种鉴定。本研究利用长片段串联序列作为乌头属潜在高变异分子标记,为同属近缘物种分子鉴定提供崭新的研究思路。
吕明生[7]2016年在《纳米层状双氢氧化物（Mg/Fe LDH）制备、特性及其应用研究》文中提出纳米尺度材料表现出很多新的特性,具有广阔的应用前景。在纳米材料应用领域还有很多的空白需要用大量的科学研究成果去填补。纳米层状双氢氧化物(layered double hydroxides,LDHs)是由二价金属氢氧化物和叁金属氢氧化物有机结合组成的片层状结构的无机纳米材料,具有生物相容性好、低毒、保存条件要求低等等特点。LDH可以在实验室中制备且成本较低,不同的二价、叁价金属离子的组合以及比率的变化,可以合成出各种各样具有独特性质的LDHs。镁铝LDH已被美国FDA批准用于治疗胃酸过多。通过研究LDH与各种生物大分子及其化学基团与其表面的吸附机理,可以更好的指导其作为基因载体、药物载体、生物传感器等等的应用。生物机体对于铝的需求或耐受相对于铁而言要小的多;相对于镁铝LDH,对镁铁LDH的研究较少。目前,镁铁LDH的应用已进入临床试验阶段,对其深入研究的数据可以用来对其进行正确评价。已有一些关于LDH吸附DNA以及吸附癌症治疗药物的研究,然而,在吸附的机理上还不是很明确。吸附是通过什么作用力?DNA或药物中的哪些机团参与了吸附?LDH中的双金属是否起同样的作用等等。吸附机理的研究对于DNA和药物的吸附和释放具有重要意义。本论文研究了镁铁LDH的合成、吸附DNA和药物的机理及其在生物学中的应用。首先,进行了镁铁LDH的合成及其材料表征研究。研究了LDH的快速合成方法和镁铁比率不同对LDH特性的影响。比率不同对合成的LDH纳米材料的实际比率、颜色和大小差异较大。合成时所配制的溶液的比例比实际制备的LDH中镁铁的比例略高,主要表现为镁的游离。两者之间呈现良好的线性关系,因此,可以通过控制合成溶液中的镁铁的比率获得所需要的镁铁比率的LDH。快速合成得到的LDH的晶型与典型LDH的晶型一致。较大幅度的减少了合成所需要的时间。随着镁铁比率的提高,产物颜色从棕色逐渐地变化到浅黄色透明、再到无色透明。LDH的粒度也呈现上升的趋势。从2:1、2.5:1、3:1到4:1,它们的大小分别为25±12nm,38±21nm,68±24nm和64±28nm。且粒度分布均匀。几种不同比率的LDH的表面电势很高,都在60mV左右,所以胶体学稳定性好。XRD数据显示,不同的晶化时间对晶形没有影响。镁铁比率3:1的ldh的结构和大小较为理想,以此为基础,研究了ldh吸附dna的机理。fam标记dna被镁铁ldh吸附后,其荧光信号被淬灭。在不同缓冲液中,ldh的表面电势受到较大影响,其在偏碱的水中很稳定。通过竞争试验发现,碱基、核糖和肽核酸对dna的吸附没有作用;单核苷酸与磷酸缓冲液对吸附有较大影响,表明是dna的磷酸骨架与ldh相互作用。1mm的磷酸缓冲液可以影响ldh对dna的吸附,而40mm的磷酸缓冲液对已吸附了的dna有洗脱作用。在dna与ldh的吸附中,是磷酸基团发挥作用。铁、镁与dna都有较强的吸附作用,ftir试验也验证了铁与磷酸基团产生了配位作用,而镁通过表面的水合分子与磷酸吸引。氯化钠对ldh吸附dna没有影响,通过ldh与碱基、单核苷酸和dna结合物的xrd证明,dna只吸附在ldh的表面,没有进入层间。在碱基长度相同的单、双链dna中,ldh对双链的吸附作用远大于单链dna。在前面研究的基础上,进行了ldh作为dna的载体的输入效果和细胞毒性研究。二株肿瘤细胞系分别为乳腺癌细胞mda-mb-231和肺癌细胞a549。用dna(fam-24mer)替代sirna做了细胞传输和细胞毒性。在20nm到1000nm的dna浓度范围的试验表明,相对于单纯的dna,ldh可以大幅度提高基因的传输效率。dna的浓度、处理时间对其细胞传输有很大的影响。dna浓度为100nm时细胞传输效率最高。随着处理时间的增加,mda-mb-231细胞传输的效果增加,然而,a549细胞传输效果在3小时达到最好,时间继续增加,则细胞传输效果降低。检测的荧光信号显示,对a549细胞传输的效果要略好于mda-mb-231细胞。ldh对两个肿瘤细胞的毒性有差异,a549细胞对ldh耐受性很高,在72小时的实验中,细胞生长不受影响。相反,ldh对mda-mb-231的细胞毒性较高,72小时的实验结果表明60%以上的细胞死亡。细胞毒性和ldh的浓度与作用时间密切相关,可以通过调整ldh的浓度和作用时间的方法降低细胞毒性。激光共聚焦照片显示,细胞对单纯的dna摄入能力很弱,而通过ldh大幅度地提高了dna的细胞传输。同时,显微照片大面积荧光表明,ldh已不能淬灭fam的荧光,dna已从ldh表面释放,这有利于传输的基因发挥作用。ldh在增加dna的细胞传输中起到了桥梁作用,使细胞对dna的吸附、摄入大幅增加。ldh可以在基因治疗中发挥重要作用。阿霉素是蒽环类抗肿瘤抗生素,对多种癌症有效,是癌症化学疗法中经常使用的一种重要药物。ldh可以作为阿霉素药物载体,对其吸附机理进行了研究。ldh能够淬灭阿霉素的荧光信号,且对其有较强吸附能力。结果显示,阿霉素的类似物:蒽、7脱氧阿霉素和阿霉素-M都能与ldh吸附,后两种的吸附作用要强于蒽。而高浓度的葡萄糖和尿素的竞争吸附实验显示阿霉素的吸附没有受到影响。因此,阿霉素中呈现出负电性的蒽环和其上的酮基与ldh的表面正电荷相互吸引,静电是两者之间吸附的主要作用力,乙醇洗脱试验表明,疏水作用力也对吸附起到了一定的作用。而阿霉素中的糖环和氨基对吸附没有发挥作用。ldh中的铁、镁都可以淬灭阿霉素荧光信号,从淬灭荧光信号的程度中看,它们对阿霉素的吸附都有作用。氯化钠因破坏了ldh的水合层,造成ldh发生一定程度的聚集而对吸附有一定的影响,这只在一定的浓度范围内(60mmnacl)发挥作用,超过了60mm则影响不再增加。傅立叶远红外光谱的也显示蒽环、酮基与ldh的相互作用。ldh吸附阿霉素的晶体衍射表明阿霉素进入了ldh的层间。根据层间距推测,阿霉素的蒽环面与ldh的层面相结合的,两个阿霉素相互重迭,蒽环向外(蒽环π电子极化和酮基的酸性),氨基部分在内(显示正电)。即,阿霉素通过蒽环的静电和疏水作用力与ldh吸附,进入了ldh的片层之间。通过药物载体增加药效以及实现靶向给药是癌症治疗中的核心目标,分别研究了ldh作为阿霉素的载体对癌细胞的作用效果,用脂质体对ldh和药物进行包裹的作用效果,以及在脂质体上链接核酸适配体(aptamer)以识别目标细胞的作用效果。试验表明,在中性pbs缓冲液的条件下,ldh吸附阿霉素,可以对药物起到缓释的作用。酸度增加,ldh对阿霉素的释放增加。这有利于药物在细胞内细胞器中的释放。ldh对阿霉素的吸附量较大,是一个较好的药物载体。用超声的方法可以使脂质体对ldh与药物结合物进行较为理想的包裹,结合物的粒度只有较小的变化,没有聚集、絮凝发生,粒度大小仍然适合作为静脉用药。脂质体对药物起到了保护作用,在不同ph的磷酸缓冲液中其释放的量要少于未包裹的。镁铁ldh本身对mda-mb-231肿瘤细胞具有一定的细胞毒性,而对a549肿瘤细胞则没有细胞毒性;其能够促进细胞对药物的摄取作用。脂质体本身对细胞也表现出了毒性差异,对a549的细胞毒性要高于对mda-mb-231。脂质体可以与细胞膜进行融合,增加了肿瘤细胞对药物的摄入。对两种肿瘤细胞的杀灭作用都较大幅度地提高。syl3c是可以与肿瘤细胞分泌的上皮细胞粘附因子(epcam)结合的核酸核配体,然而,在本试验中没有体现出识别效应。用化学方法链接适配体后,构型是否正确以及影响识别率因素,还需要进一步的研究。柠檬酸是一种重要的食品添加剂,在轻工,食品,化妆等行业的产品生产中具有重要作用。在研究中发现低浓度的柠檬酸对ldh吸附dna的影响很大,在各种酸根阴离子中,ldh对柠檬酸根的选择性很高;即使在10倍于柠檬酸根离子的其它各种酸根离子存在的情况下,仍然具有较高的选择性。检测结果显示,线性关系好,检测限可以达到10.66 nM。可以应用于低浓度情况下的柠檬酸的检测。通FTIR检测,柠檬酸根通过羰基与LDH吸附。结合了柠檬酸根的LDH的XRD结果显示,LDH的晶形变化较大,层间距变大,柠檬酸根进入了LDH的层间。柠檬酸根通过静电与LDH结合,没有特异性,在复杂体系中,干扰大,特别是磷酸根对其亲和力也很强,但由于其检测限低,对一些相对单纯的体系中的柠檬酸进行定量分析,这是一种简便、快捷的方法。
马建[8]2016年在《基于固态纳米孔基因测序的关键技术研究》文中研究说明基因测序技术不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据,而且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。自从1977年第一代测序技术问世以来,经过叁十几年的努力,基因测序技术已经取得了重大进展,在第一代和第二代测序技术的基础上,以单分子测序为特点的下一代测序技术应运而生。纳米孔测序技术被认为是最有可能成为下一代基因测序的技术之一,它不仅有可能将目前的DNA序列分析的成本大大降低,分析速度大大提高,还将推进基于基因组技术的个性化医学向现实迈进一步,从而引起医学界的一次变革。本文以下一代基因测序的纳米检测传感器的设计理论、制造工艺和生物分子辨识为研究内容,开展了微纳制造方面器件结构设计和纳通道内的离子输运基础理论的研究工作,搭建了生物分子检测平台,实现了对生物大分子的检测。取得创新研究成果如下：(1)在纳米孔制备方面实现了叁种不同基底材料纳米通道的研制。基于硅基材料的加工方法,结合聚焦离子束(FIB)以及透射电子显微镜(TEM)高能离子束和电子束制造技术,提出对氮化硅基底进行先减薄后溅射的加工工艺,成功研制出孔径小于5nm的叁维纳米孔,总结工艺参数对纳米孔加工质量、几何结构和几何参数的影响规律。利用低压气相沉积技术实现了大面积的石墨烯薄膜制备并且成功实现石墨烯薄膜的转移,对石墨烯在高能电子束辐照下的热力学响应过程进行了系统研究,提出一种新颖的石墨烯纳米孔加工工艺,成功制备出孔径可以控制在单位纳米精度的石墨烯纳米孔。在纳米通道制备方面利用包埋氧化聚乙烯(PEO)纳米纤维的方法成功制备出长度在毫米,孔径却在数十纳米的聚二甲基硅氧烷(PDMS)纳米通道。(2)针对基于纳通道的纳流体传感器的流体输运特性,进行电解质溶液在纳米受限空间下的流变行为研究,开展了离子在纳通道内输运的基础理论研究工作。对氯化钠(NaCl)溶液在纳米通道内的电导率进行了从低到高不同浓度的测量,在国际上,最先完成了纳米通道内高浓度的电解质溶液中离子输运的数据的测量。提出在低浓度时纳米孔的电导率主要由孔内的电荷密度所决定,而在高浓度且当孔径小到4.5nm时,其电导率偏离体态电导率的行为,并通过分子动力学模型对纳米孔内离子输运特性进行了深入分析研究,对纳米通道内离子输运特性异于体态特性给出了全新的解释。同时发现PDMS纳米通道内电导率会随着电解质溶液溶度不断提高而下降的现象,即在纳米通道内随着溶液浓度的提高,离子迁移率的下降导致其电导率随电解质溶液浓度上升而下降现象。通过对纳米孔进行亲水处理与疏水处理的对比实验,发现经过亲水处理后可以大大改善纳米孔的整流效应,这一结果有效地提高DNA检测时DNA分子的捕获率。(3)根据纳米孔内噪音类型以及噪音来源的理论分析,对硅基纳米孔基底材料分别进行涂覆PDMS、亲水处理以及沉积氧化铝等不同方法对纳米孔进行了表面修饰,大大地降低了纳米孔基准电流噪音信号,有效地提高了纳米孔检测DNA分子过孔信号的信噪比。(4)实现纳米孔与检测平台之间的集成,搭建了纳米孔生物分子检测的实验平台,并且通过该实验平台成功实现对48kb λDNA过孔姿态的识别,根据生物分子过孔时诱导的离子电流变化量以及电流信号持续的时间这两个特征量,分析不同形态的过孔信号特征实现单分子的过孔姿态的识别,并对DNA过孔时引起的阻塞电流信号进行理论推导,对DNA过孔时间的影响因素进行了系统研究。通过对纳米孔壁面进行修饰有效地实现DNA过孔速度的降低。在纳米孔孔径缩小至2.5nm时成功对叁碱基单链聚合分子GGG与TTT进行识别,为单碱基检测提供了可靠的参考数据。同时在石墨烯纳米孔检测DNA研究中,实现了在不同偏置电压下均对48kb λDNA识别,并且确定了偏置电压与阻塞电流幅值之间的关系。在此基础上设计了不同浓度差实验,首次实现了利用石墨烯纳米孔对CCC与GGG聚合分子的识别。
梁会营[9]2016年在《基于靶向外显子深度测序的转移性乳腺癌患者循环肿瘤DNA定量检测及其临床应用研究》文中指出无论从发达国家还是从发展中国家,无论从每年新发病例数量出发还是从每年死亡情况来看,乳腺癌都是威胁女性健康最常见的癌症。其中,转移性乳腺癌(Metastatic Breast Cancer, MBC)仍是不可治愈的疾病,治疗目的主要是为了减轻症状,改善生活质量和延长生存期。因此,为了避免无效治疗的持续、为了预防不必要的医疗毒性、为了明确治疗应答、合理搭配宝贵的医疗资源,筛选高灵敏并且强特异的生物标志物用于监测转移性乳腺癌患者治疗过程中肿瘤负荷的变化,具有重要的科学及社会意义。随着近年来肿瘤细胞生物学及分子生物学的深入研究,以及检测技术手段的快速发展,循环肿瘤标记由于检测的便利性和非侵入性正逐步取代受到标本采集以及无法连续监测追踪等诸多限制的组织学肿瘤标记用于肿瘤治疗过程中反应的监测。如癌抗原15-3(CA 15-3)和循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTC)等标志物已得到广泛研究。随着“液体活检”概念的推广,携带有肿瘤特异性变异的循环肿瘤DNA (Circulating Tumor DNA, ctDNA)逐渐被人们所重视,并成为肿瘤细胞生物学及分子生物学研究领域的热点和亮点。第一章基于数据挖掘技术的乳腺癌靶向外显子的筛选和验证背景：对于癌症来说,发生突变的基因仅占整个基因组的很小一部分,这表明只有有限数量的基因参与了某一类型癌症的发生和发展。因此,只有这些与癌症相关联的一组基因是监测治疗过程中肿瘤负荷变化所必需的。但遗憾的是尚无一种能够科学完整而又非常集约化的策略来明确这些与特定肿瘤类型相关的目标基因区域。目的：本部分拟基于生物信息学和数据挖掘技术筛选出与乳腺癌高度相关的目标基因区域,为后续的靶向捕获测序提供靶标,减少盲目性,节约实验成本,使检测技术的针对性更强,适用性更广。方法：从癌症基因组图谱库(TCGA)中963例乳腺癌患者中,随机选取776例作为训练集,剩余的187例作为预测集；基于肿瘤体细胞突变目录(COSMIC)数据库,筛选出乳腺癌相关基因突变所在的基因功能区域；用筛选出的潜在“靶向区域(Selector)",覆盖训练集中乳腺癌患者的遗传学改变信息进行；应用迭代算法使"Selector"在覆盖训练集中尽可能多的患者的同时达到尽可能的精简；使用生物信息学分析技术对"Selector"所涉及基因,进行KEGG pathway和Gene Ontology分析；最后通过预测集乳腺癌患者和临床生物标本对已筛选出的"Selector"进行覆盖度验证并优化完善。结果："Selector"共计包含了834个乳腺癌相关基因,961个外显子,23982049个单核苷酸变异(SNVs),134个Indels,52个Fusions,长度为118.24kb,遍布在所有编号染色体上。按照生物学过程分类："Selector"所涉及基因所属的GO-BP分类有1348个,最多的5种途径分别是：cellular component organization or biogenesis,cellular component organization,collagen catabolic process, single-organism developmental process和multicellular organismal catabolic process。按照细胞组件注释："Selector"所涉及基因所属的GO-CC分类有239个,前五位分别是:cell projection, cytosol, endoplasmic reticulum lumen, membrane region和cytoplasm。按照分子功能注释："Selector"所涉及基因所属的GO-MF分类有269个,前5种功能分别是：ATP binding, adenyl ribonucleotide binding, adenyl nucleotide binding, anion binding和extracellular matrix structural constituent.."Selector"所涉及基因可能参与调节的KEGG信号通路包括73条,前五位主要涉及黏着斑、子宫内膜癌、小细胞肺癌、阿米巴病和促性腺激素释放激素信号通路。"Selector"在训练阶段可以覆盖100%的乳腺癌患者,预测集验证阶段亦可以覆盖高达88.7%的乳腺癌患者,平均识别每位患者2个及以上SNVs。40例独立转移性乳腺癌患者不同治疗阶段的72份生物标本验证结果显示,该区域可以覆盖100%的患者和生物标本。结论："Selector"有效的将乳腺癌相关的靶向测序区段浓缩至整个基因组大小的3.7/10万,使得后续深度测序得以实现,为后续研究提供了靶标,减少了实验测序盲目性,节约了实验成本。第二章转移性乳腺癌患者治疗前后血浆游离DNA水平变化及其监测价值研究背景：能否成功延长转移性乳腺癌患者的生存期主要与疗效监测、更换治疗方案时机的把握程度密切相关。但目前用于治疗过程中疗效监测的影像学改变和传统生物标志物多具有敏感性和特异性不足的缺点。外周血游离DNA(Circulating Cell Free DNA, cfDNA)作为一种新的肿瘤标志物,在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面均具有广阔的应用前景。目的：本部分以β-actin为目标管家基因,以已知浓度的人类基因组DNA为标准品,基于Digital PCR技术平台定量检测cfDNA的浓度水平(Genome Equivalent/mL, GE/mL),系统分析转移性乳腺癌患者化疗前后cfDNA水平的变化规律,评估血浆cfDNA在转移性乳腺癌患者病情监测、疗效评价、预后转归预测中的应用价值。阐明cfDNA检测作为一种快速、微创、敏感、特异的转移性乳腺病情和疗效监测指标的可行性。方法：采用前瞻性临床病例队列研究的设计方法,对40例具有明确可测量转移病灶的首程化疗乳腺癌患者,进行前瞻性预后随访并采集外周血标本直至第150天或不良预后事件(疾病进展)出现。以β-actin作为检测靶基因,运用DigitalPCR技术检测全组转移性乳腺癌患者治疗前后各随诊时点外周血cfDNA水平。分析转移性乳腺癌患者外周血cfDNA水平在治疗过程中的变化规律,以及与临床特征和预后的关系。结果：全组病例中位随访时间为106天(67-113天),肿瘤无进展生存率为50.2%；治疗前和首程化疗后随诊时的cfDNA中位基因组当量分别为1015(749.3-1315.3)与916.5 (519.3-1124.3) GE/mL,治疗前后Wilcoxon配对秩和检验结果显示无统计学差异(Z=-1.74,P=0.08)。转移性乳腺癌患者治疗前后各时点外周血cfDNA水平变化非参数Friedman检验结果显示无统计学差异(χ2=5.26,P=0.39)。Mann-Whitney U检验结果显示不同临床特征组转移性乳腺癌患者治疗前后各时点外周血cfDNA水平的差异均无统计学意义(P值均大于0.05)。ROC曲线分析结果显示治疗前和首程化疗后血浆游离DNA水平预测疾病短期进展的曲线下面积分别为0.66 (95%CI:0.48-0.82, z=1.65, P=0.09)和0.60(95%CI：0.42-0.76, z=0.91, P=0.37);最佳切点分别为9386 GE/mL和812 GE/mL,对应的灵敏度和特异度分别为70.0%和66.7%,80.0%和54.2%。短期疗效分析发现全组患者治疗前外周血游离DNA水平<9386 GE/mL组的中位无进展生存期(126天)和无进展生存率(44.7%)均优于>9386 GE/mL组(110天和40.9%), Log-rank (Mantel-Cox) test检验结果显示χ2=4.05,P=0.04。在校正了年龄、月经生育史、ER, PR和Her2表达状态、肿瘤大小和内脏转移情况之后的多因素Cox回归分析结果显示：与<9386 GE/mL组相比,治疗前外周血cfDNA水平>9386 GE/mL组患者(HR=13.27,95%CI:1.14-154.16)在治疗过程中发生短期疾病进展的风险显着增加。结论：转移性乳腺癌患者治疗过程中各时点血浆cfDNA水平变化无统计学差异,且与肿瘤临床特征、患者疾病健康史未见统计学关联。转移性乳腺癌患者治疗前血浆中cfDNA水平对患者短期疗效转归具有一定的的预测价值,但灵敏度和特异度均不太理想。第叁章基于靶向外显子深度测序的转移性乳腺癌患者循环肿瘤DNA定量检测及监测价值研究背景：随着“液体活检”的概念深入人心,从传统标记物到循环肿瘤细胞(CTC),紧接着一部分研究者对循环系统内的来自肿瘤组织的核酸片段(循环肿瘤DNA, ctDNA)产生了越来越浓厚的兴趣。ctDNA是一种有前景的无创性评估肿瘤负荷的生物标志物,但现有针对ctDNA检测的方法多具有灵敏度不足或缺乏广泛的临床适用性的缺点。而且由于乳腺癌患者之间的高度遗传异质性,目前最为流行的是通过组合几个已知突变来定量癌症患者cfDNA中ctDNA浓度水平的技术,但这一技术却面临着严重的患者覆盖度低的问题。目的：本部分拟在第一部分和第二部分研究成果的基础上,建立一种超灵敏高覆盖的ctDNA定量检测技术。进而系统分析转移性乳腺癌患者化疗前后血浆ctDNA水平的变化规律及其与临床特征之间的关系；比较治疗前后ctDNA与癌抗原CA 15-3及cfDNA在转移性乳腺癌患者随访监测、治疗效果评价、预后转归评价中应用价值的优劣。本部分旨在阐明血浆ctDNA定量检测作为一种快速、微创、敏感、特异的转移性乳腺随访疗效观察和耐药性监测指标的可行性。方法：本研究采用靶向捕获深度测序的技术对40例转移性乳腺癌患者的外周血进行乳腺癌相关基因区域突变的检测,经过对照血细胞和血浆样本的循环游离DNA基因遗传学改变,筛选出血细胞样本阴性、血浆样本阳性的乳腺癌特异性基因突变,结合生物信息学分析方法计算出ctDNA在cfDNA中的占比；结合第二部分外周血cfDNA的定量结果计算出转移性乳腺癌患者治疗前后各时点的ctDNA水平。进而分析转移性乳腺癌患者血浆ctDNA水平在治疗过程中的变化规律,以及与临床特征和预后的关系；并评价ctDNA与癌抗原CA 15-3及血浆cfDNA在转移性乳腺癌随访监测、治疗效果评价、预后判断中应用价值的优劣。结果：(1)乳腺癌特异性基因突变检测：应用乳腺癌相关基因目标区域靶向捕获深度测序技术检测乳腺癌特异性体细胞基因突变,平均测序深度～2000×。结果显示：在40例转移性乳腺癌患者治疗前和首程化疗后随诊时采集的共计72例标本中,100%检测到此前确定的SNVs,并发现了许多额外的体细胞变异。(2)ctDNA水平定量：治疗前和首程化疗后随诊时的血浆ctDNA在cfDNA中占比分别为1.28%(0.56%-2.57%)和1.56%(0.80%-3.07%),中位基因组当量分别为136.1(60.5-238.5) GE/mL和136.3(52.4-239.4) GE/mL,治疗前后Wilcoxon配对秩和检验结果显示差异无统计学意义(Z=-0.17, P=0.86)。(3) Mann-Whitney U检验结果显示：不同Her2表达状态和是否合并糖尿病组间转移性乳腺癌患者血浆ctDNA水平差异存在统计学意义：Her2+组患者治疗前ctDNA中位数为114.1(45.9-206.4) GE/mL,明显低于Her-组的224.2 (102.8-274.2) GE/mL;合并糖尿病患者首程化疗ctDNA水平远高于未合并糖尿病患者(357.0 GE/mL vs. 125.6 GE/mL). (4) cfDNA, ctDNA和CA15-3在患者中检测灵敏度比较结果显示：癌抗原CA15-3在患者和标本中的异常(>25U/mL)检出率分别为46.9%和44.4%; cfDNA在患者和标本中的异常(>9386 GE/mL)检出率分别为70%和52.8%：而ctDNA无论在患者中还是所有标本中,检出率均为100%。(5)疾病进展组和疾病稳定缓解组之间,治疗前后癌抗原CA15-3和cfDNA的浓度差异均无统计学意义(P>0.05),但疾病进展组患者的ctDNA水平(治疗前-223.4GE/mL,首程化疗-259.0 GE/mL)明显高于疾病稳定缓解组(治疗前-111.4 GE/mL,首程化疗-86.1 GE/mL), P值均小于0.05. (6) cfDNA、ctDNA和CA15-3首程化疗后是否升高与疾病进展的关联性分析结果显示：与治疗前相比,ctDNA水平升高组中发生短期疾病进展的比例高达47.1%,与ctDNA水平降低组(11.8%)相比,差异有统计学意义(χ2=5.10,P=0.02)；与治疗前相比CA15-3浓度升高组中短期疾病进展比例达42.9%,与CA15-3浓度降低组(12.5%)相比,差异无统计学意义(χ2=3.52,P=0.06)；与治疗前相比cfDNA水平升高组中短期疾病进展比例达50%,与cfDNA水平降低组相比(18.2%),呈边缘性统计学差异(χ2=3.79, P=0.05)。(7) ROC曲线分析结果显示治疗前后血浆ctDNA预测短期疾病进展的曲线下面积分别为0.74 (95%CI:0.56-0.87, z=2.33, P=0.02)和0.86 (95%CI:0.70-0.95, z=4.51, P=0.0001),与参考线相比均达统计学差异；最佳切点分别为135.21 GE/mL和183.34 GE/mL,对应的灵敏度和特异度分别为90.0%和58.3%,90.0%和79.2%。(8)短期疗效分析发现,治疗前外周血ctDNA≤135.21 GE/mL组的无进展生存率明显高于后者(92.3%和27.1%),Log-rank (Mantel-Cox) test检验结果显示χ2=4.95,P=0.03。首程化疗≤183.34GE/mL组的无进展生存率(88.8%)明显高于>183.34 GE/mL组(18.8%),Log-rank (Mantel-Cox) test检验结果显示χ2=8.98,P=0.002。(9)在校正了年龄、月经生育史、ER、PR和Her2表达状态、肿瘤大小和内脏转移情况之后的多因素回归分析结果显示：与首程化疗外周血血浆ctDNA≤183.34 GE/mL组相比,首程化疗外周血血浆ctDNA>183.34 GE/mL组(HR= 39.02,95%CI:1.19-1284.67)患者在治疗过程中发生疾病短期进展的风险显着增加。(10)案例分析结果显示,ctDNA的动态变化能够灵敏地反映转移性乳腺癌患者病情的进展和缓解,而cfDNA的动态变化与转移性乳腺癌患者病情的进展并不尽一致。结论：(1)本研究建立了一种对乳腺癌相关基因进行靶向捕获深度测序的方法,可实现对转移性乳腺癌患者血浆ctDNA高覆盖超灵敏的定量,为转移性乳腺癌患者治疗过程中的疗效监测提供了一种可行的“液体活检”方案。(2)不同Her2表达状态、是否合并糖尿病基础疾病会影响转移性乳腺癌患者血浆ctDNA浓度水平的高低。(3) ctDNA在转移性乳腺癌患者的检测灵敏度优于CA15-3和cfDNA异常升高检出率,并且与治疗过程中肿瘤负荷的动态变化高度相关。(4)转移性乳腺癌患者首程化疗后血浆中ctDNA水平检测对患者短期疗效转归具有良好的预测价值。(5)与治疗前相比首程化疗后血浆ctDNA升高者和首程化疗后ctDNA高于183.34 GE/mL者疾病在短期内进展的风险显着升高。(6)与cfDNA相比
何开雨[10]2015年在《基于DNA功能纳米结构的生物传感及分子逻辑电路研究》文中进行了进一步梳理DNA的结构具有多样性,除了广为人知的双螺旋结构,科学家们通过体内发现和体外筛选获得了更为多样的DNA结构类型,如叁链DNA、DNA十字叉结构、G-四链体结构、i-motif四链结构以及各种脱氧核酶、DNA适配体等特有的叁维立体结构。这些特殊的结构具有一定的功能,例如,脱氧核酶和DNA适配体的特殊序列,通过分子内的氢键、碱基堆迭作用、静电相互作用以及金属离子配位作用等,形成特定空间结构而表现出催化活性或者识别能力。除了这些体内发现和体外筛选获得的功能DNA纳米结构,还可以利用结构DNA纳米技术使DNA通过碱基互补配对自组装成具有可控形状和尺寸的DNA纳米结构。这些自然界存在的以及人工创造的DNA结构,为构建具有广阔应用前景的基于DNA的纳米器件提供了基础。一方面,利用这些功能DNA纳米结构的构象转换,可发展新传感原理,用于金属离子、小分子、生物大分子、病毒和细胞等一系列目标物的分析检测;另一方面,各种自组装DNA纳米结构也为基于DNA的智能纳米器件的构建提供了全新的平台。基于以上两个方面的考虑,我们利用DNA发夹结构、G-四链体结构、DNA杂交体等功能DNA纳米结构的独特性质,发展免标记比色生化分析方法,用于检测单碱基错配以及与核酸新陈代谢相关的酶。更进一步,我们利用结构DNA纳米技术构建结构可控的DNA纳米结构,并将其作为分子计算模块,用于分子逻辑电路的设计,为构建基于DNA的智能纳米器件提供基础。围绕着这些目标,我们主要开展了以下研究工作:(1)开发了一种基于G-四链体-氯化血红素DNA酶的酶活性分析法(DNA酶-based enzyme activity assay(DEAA)),该方法可作为一种通用型方法,用于比色分析多种与DNA新陈代谢相关的酶的活性。在DEAA中,我们用到了DNA发夹结构和G-四链体结构等简单的DNA纳米结构,并且,我们设计了自组装DNA纳米机器,使其体外等温扩增能形成G-四链体结构的序列,用于放大检测信号,提高检测灵敏度。DEAA是一种低成本、可视化、多目标、具有普适性的检测与DNA新陈代谢相关的酶的活性的分析技术,而且,该技术还能扩展用于酶的抑制剂的筛选以及单碱基错配的比色分析。这个研究工作展示了简单的功能DNA纳米结构在生化分析中的应用潜力。(2)结构DNA纳米技术为构建结构复杂精细的叁维DNA纳米结构提供了途径,然而,已有的组装叁维DNA纳米结构的方法大都复杂且需要较多种类的DNA链,针对这些问题,我们利用DNA纳米结构的几何对称性,在充分保留叁维DNA纳米结构的可寻址性的前提下,以极少种类的DNA链模块化地组装叁维DNA纳米结构,极大地减小了组装叁维DNA纳米结构的成本。作为例证,我们以7条不同的DNA链组装了具有良好可寻址性的DNA纳米叁棱柱。该DNA纳米叁棱柱为正叁棱柱,其上下底面是边长约为7.14 nm的等边叁角形,棱柱的高度约为3.40 nm,叁棱柱内部空腔体积约为75 nm3。我们使用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和荧光共振能量转移技术表征了DNA纳米叁棱柱的自组装。我们考察了DNA纳米叁棱柱结构的热稳定性。DNA纳米叁棱柱的熔解温度曲线显示,该DNA纳米叁棱柱在43°C时开始解构,表明棱柱在室温或者生理温度下能很好地保持其结构的稳定性。另外,我们还考察了棱柱在人血清中的稳定性。在37°C,10%(v/v)的人血清中,棱柱能保持其结构的完整性约6.0 h,表明该DNA纳米叁棱柱有望应用于复杂生物体系中。(3)在上述研究结果的基础上,我们将DNA纳米叁棱柱作为一个通用型的分子计算模块,构建分子逻辑门。我们采用集成设计策略,将DNA叁棱柱的不同部分作为逻辑器件的不同功能元件。这种集成设计策略,使DNA纳米棱柱成为一个通用型的平台能构建多种分子逻辑门,如二进制基本逻辑门(“或”门、“与”门、“抑制”门、“异或”门),组合逻辑门(“抑制-或”门),多值逻辑门(叁进制“抑制”门)。而且,仅使用这一个DNA纳米棱柱和四条单链DNA我们便成功构建了一个DNA计算体系,可区分自然数中的奇数和偶数。此外,我们还证明了该刺激响应型的DNA纳米棱柱能在含有人血清的复杂生物基质中稳健地执行逻辑操作。(4)最后,我们将自组装DNA纳米结构与氧化石墨烯结合,构建新型的DNA纳米结构复合材料,并将其作为一个通用型的平台用于分子逻辑电路的设计。我们利用DNA纳米技术组装了一个DNA纳米叁脚架(DNA nanotripod),并将其作为支架在纳米尺度上调控其负载的荧光小分子与氧化石墨烯的相互作用,实现了一个叁输入的majority逻辑门。该majority逻辑门可在“或”逻辑门和“与”逻辑门之间切换,使其成为一个多功能的模块,也可构建更多逻辑门和复杂的分子逻辑电路,如“异或”逻辑门和“抑制”逻辑门等基本逻辑门以及组合逻辑门。在这些基础之上,我们利用该平台的通用性,建立了一个分子逻辑运算体系,用于10以内自然数中合数的筛选。同样,我们也证明了该平台能在细胞裂解液中稳健地执行逻辑运算。
参考文献：
[1]. 柑橘全基因组DNA甲基化分析及调控作用研究[D]. 徐记迪. 华中农业大学. 2015
[2]. DNA电化学生物传感器的构建及其生化分析新方法研究[D]. 高中锋. 西南大学. 2016
[3]. 有机磷农药降解质粒在土壤中的转化规律研究[D]. 陈熙. 华中农业大学. 2016
[4]. 新型香豆素类化合物：设计、合成及其作为抗微生物制剂与DNA人工探针的相关研究[D]. 彭莘媚. 西南大学. 2016
[5]. 生物高分子水凝胶的制备与表征[D]. 李艳丽. 东南大学. 2016
[6]. 中草药DNA条形码分子鉴定：从基因到基因组[D]. 陈晓辰. 北京协和医学院. 2016
[7]. 纳米层状双氢氧化物（Mg/Fe LDH）制备、特性及其应用研究[D]. 吕明生. 上海海洋大学. 2016
[8]. 基于固态纳米孔基因测序的关键技术研究[D]. 马建. 东南大学. 2016
[9]. 基于靶向外显子深度测序的转移性乳腺癌患者循环肿瘤DNA定量检测及其临床应用研究[D]. 梁会营. 南方医科大学. 2016
[10]. 基于DNA功能纳米结构的生物传感及分子逻辑电路研究[D]. 何开雨. 湖南大学. 2015
标签：生物学论文; 香豆素论文; 甲基论文; 基因合成论文; dna论文; 基因探针论文; 基因结构论文; 科学论文; 细胞周期论文; 生物转化论文; 水凝胶论文; 细菌结构论文; 科普论文; dna甲基化论文; dna序列论文;