【摘要】 目的 探讨RRM２在卵巢癌细胞侵袭中的功能.方法 siRNA 干扰SKOV－３和SKOV－３/cDDP细胞后,比较处理组与对照组间RRM２表达水平,并比较两组细胞侵袭能力.结果:处理组与对照组处理前RRM２表达水平接近,都比较高,处理组在经处理２４h、４８h后RRM２表达水平明显降低,７２h后其水平基本上不变;在经siRNA 干扰后,SKOV－３和SKOV－３/cDDP细胞的侵袭能力明显降低.结论:RRM２在卵巢癌细胞中的表达较高并且与其侵袭力呈正相关. 【关键词】 核糖核苷酸还原酶亚单位M２(RRM２);卵巢癌细胞;侵袭【中图分类号】R７１１【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－００７９－０１
RRM２是DNA 合成和修复中的限速酶,是细胞凋亡及其重要的调控基因,在妊娠滋养细胞疾病,乳腺癌,小细胞肺癌.宫颈癌,胰腺癌,子宫内膜癌等多种肿瘤中呈过表达,有研究表明,RRM２的高表达恶性肿瘤的生长以及浸润转移能力呈现正相关[１－２].本文就RRM２在卵巢癌细胞侵袭中的功能进行研究.
１ 主要材料与方法
１．１ 主要材料trizol(takara)Sybrgreen(toyobo)Transwell小室(８um,millipore)Matrigel(BD)DMEM(Hyclone)FBS(Hyclone) 双抗(Hyclone)FugeneXtremetransfectionreagent(roche)Primer:β－actin:F－AAAGACCTGTACGCCAACACR－GTCATACTCCTGCTTGCTGAT(扩增片段长度２１８bp．)RRM２:F－ACCTATGGTGAACGTGTTGTAGR－GGCATCAGTCCTCGTTTCTT(扩增片段长度１０１bp)RRM２siRNA:sense:UGCUGUUCGGAUAGAACAGd(TT)antisense:CUGUUCUAUCCGAACAGCAd(TT)NC:sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUd(TT)antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAAd(TT) １．２ 方法 (１)细胞处理１．１ SKOV－３和SKOV－３/cDDP 细胞培养在DMEM 高糖培养基中,含１０％ FBS,１％双抗１．２ siRNA 干粉１OD 用１２５ul的DEPC 水溶解后,此时siRNA 浓度为２０uM,分装放至－２０冰箱中冻存备用.１．３ 转染前一天,将SKOV－３细胞消化下来,均匀种至六孔板中,每个孔种２×１０５个细胞１．４ 第二天,取９２ulDEPCH２O＋５ulsiRNA＋３ul转染试剂至无酶EP管中, 混匀后室温静置,２０min后均匀加入６孔板一个孔中,摇晃均匀后放入培养箱中培养.培养２４h、４８h、７２h收细胞,检测siRNA 干扰效率.(２)RNA 提取
２．１ 细胞处理好后,去除培养基,往六孔板中加PBS洗__________一遍细胞,去除PBS, 加入１mltrizol,室温放置２min,将trizol转移至无RNA 酶的EP管中.２．２ 加入氯仿２００ul,用力振摇１５s,室温静置１５min,离心(４℃,１２,０００g,１５min)．２．３ 离心后液体分为三层,小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中.２．４ 加入等体积异丙醇,上下颠倒混匀,室温静置５min,离心(４℃,１２,０００g,１０min).２．５ 去上清,沉淀加入７５％乙醇１ml,轻微振荡１５s,离心(４℃,７,５００g,５min)２．６ 小心去上清,管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥３－５min．最好是用枪头吸取上清,尽量除去.２．７ 加入５０μlDEPC水溶解,nanodrop检测浓度,－８０℃冰箱保存.２．８ 逆转录２(．９ 荧光定量PCR ３)细胞侵袭实验
３．１ 消化SKOV－３和SKOV－３/cDDP细胞,在六孔板中每个孔种２×１０５个细胞,培养第二天转染NC和siRNA,培养２４h.３．２ Transwell小室制备:用５０mg/LMatrigel１:５稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,３７℃培养箱中放置１小时凝固.３．３ 制备细胞悬液:制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿１２h,进一步去除血清的影响.消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗１－２遍,用无血清培养基重悬.３．４ 接种细胞:上室接种无血清细胞悬液,每孔接种量为５００００个,下室加入含血清培养基.常规培养２４h.３．５ 培养２４h后,去除transwell小室中的培养基,用棉签去除小室中残留的细胞,加入结晶紫染色１０min,用PBS清洗后,在显微镜下拍照. ２ 结果２．１ RRM２siRNA 干扰效果检测处理组与对照组处理前RRM２表达水平接近,都比较高,处理组在经处理２４h、４８h后RRM２表达水平明显降低,７２h后其水平基本上不变.
２．２ SKOV－３和SKOV－３/cDDP细胞中RRM２干扰后,细胞侵袭能力检测 在经siRNA 干扰后,SKOV－３和SKOV－３/cDDP 细胞的侵袭能力明显降低.３ 讨论RR是DNA 通路中合成的限速酶,RRM２是RR中的一个金属结合位点, 既是催化底物转化区又具有接触抑制的功能[３],同时RRM２的表达期只出现在DNA 复制阶段,因此,在调控DNA 合成、RR酶活性以及细胞增殖等过程中M２亚基具有关键作用[４].因此它的异常表达在肿瘤细胞的发生,发展,分化, 耐药,侵袭及转移等生物学行为中起到不容忽视的作用[５].FurutaE等[６]指出RRM２在正常人组织,良性组织中低表达,恶性肿瘤组织中表达上调,在恶性肿瘤的形成、发展中起到重要的作用.也有报道指出RRM２是癌症患者预后的独立危险因素之一[７].近年来有研究发现RRM２在卵巢癌组织中也呈过表达,且随卵巢癌组织分化程度的降低及病理分期的升高,其阳性表达率呈上升趋势,并且随着RRM２表达量的升高,卵巢癌患者的预后越差,进一步证实RRM２可能在卵巢癌的发生及发展中起到关键功能[８]. 本研究结果显示:处理组与对照组处理前RRM２表达水平接近,都比较高,处理组在经处理２４h、４８h后RRM２表达水平明显降低,７２h后其水平基本上不变;在经siRNA 干扰后,SKOV－３和SKOV－３/cDDP细胞的侵袭能力明显降低.因此,RRM２在卵巢癌细胞中的表达较高并且与其侵袭力呈正相关,有望成为新的肿瘤诊断指标和治疗靶点.值得临床上重视. 参考文献[１] Grade M,HummonA B,CampsJ,etal．Agenomicyforthefunctionalvalidation of colorectalcancer genesidentifies potentialtherapeutic[ targets[J]．IntCancer,２０１１,１２８(５):１０６９－１０７９． ２] 卢飞飞,任婧婧,王黎明,等．上皮性卵巢癌组织RRM１和RRM２表达及其意义[J]．齐鲁医学杂志,２０１１,２６(５):３９３－３９８． [３] SmithBD,KarpJE．Ribonucleotidereductase:anoldtargetwithnewpoＧ[ tential[J]．LeukRes,２００３,２７(１２):１０７５－１０７６． ４] 冯同富,王琪,张玮,等．卵巢癌铂类耐药细胞株与敏感株间差异蛋白的筛选[J]．中华肿瘤防治杂志,２０１１,１８(２２):１７６６－１７６９． [５] DuxburyMS,ItoH,BenoitE,eta１．RetrovirllymediatedRNAinterferencetargeＧtingtheM２subunitofribonucleotidereductase:anoveltherapeuticstrategyin[ pancreaticcancer[J]．Surgery,２００４,１３６(２):２６１－２６９． ６] FurutaE,OkudaH,KobayashiA,etal．Metabolicgenesincancer:theirrolesintumorprogressionandclinicalimplications[J]．Biochim Biophys[ Acta,２０１０,１８０５(２):１４１－５２． ７] SouglakosJ,BoukovinasI,Taron M,etal．RibonucleotidereductasesubＧunitsM１andM２mRNAexpressionlevelsandclinicaloutcomeoflungadenocarcinomapatientstreatedwithdocetaxel/gemcitabine[J]．British[ JournalofCancer,２００８,９８(１０):１７１０－１７１５． ８] WangLM,LuFF,ZhangSY,etal．OverexpressionofcatalyticsubunitM２inpatientswithovariancancer[J]．Chin MedJ２０１２;１２５(１２):２１５１－２１５６．
论文作者:陶巍 张蓓
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/1
标签：细胞论文; 水平论文; 癌细胞论文; 培养基论文; 小室论文; 卵巢论文; 较高论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;