马捷[1]2016年在《水稻（ORYZA SATIVA）细胞壁上有机、无机硅抑制镉离子吸收的化学机制》文中研究表明作为一种典型的喜硅植物,水稻(Oryza sativa)中硅的含量占其干重的百分之一到百分之十。除了水稻叶细胞壁上及特化细胞内沉积的无机二氧化硅外,初步证据已表明细胞壁上也可能存在有机硅。水稻体内的硅能够缓解各种生物和非生物胁迫,例如重金属镉的毒害,但在单细胞水平上两种不同结构的硅如何减轻镉毒害的作用机制仍然不完全清楚。为了排除组织、器官和植株体系内研究的复杂性,我们培养了生物遗传背景相似的水稻悬浮单细胞,并发现细胞壁表面存在与半纤维素组分共价交联的有机硅。在此基础上通过仿生(仿硅藻细胞壁上有序二氧化硅形成机制)硅化,进一步在水稻单细胞表面构筑了无机的二氧化硅纳米壳。利用以上两种不同细胞,借助各种现代物理化学分析手段并结合细胞及分子生物学研究方法,分别调查了细胞壁上的有机硅和无机二氧化硅如何抑制镉离子吸收的化学机制。同时利用最新发展的同位素标记相对和绝对定量的蛋白质组学技术(iTRAQ)研究了短期和长期镉胁迫下,细胞壁上的有机硅如何影响水稻单细胞蛋白的差异表达,得到的主要结果如下:1、水稻细胞壁上存在[硅-半纤维素]复合物,使细胞壁带有更多负电荷,进而可以通过[硅-半纤维素]-镉的共沉淀,抑制细胞对镉离子的吸收结合电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和X-射线光电子能谱(XPS)结果显示64%的硅可以与水稻悬浮细胞壁上的半纤维素组分共价交联。通过原子力显微镜(AFM)的凯尔文电势(KPFM)测量发现[硅-半纤维素]复合物的形成使得细胞壁产生不均一分布的负电荷,这一净负电会随着镉浓度的增加诱导[硅-半纤维素]-镉的共沉淀而被中和。使用非损伤微测(NMT)技术原位测量细胞表面的镉离子流量发现,相对于缺硅(-Si)培养的细胞,加硅(+Si)细胞的镉离子内流更低,对应细胞内(通过测定原生质体的镉含量)的镉浓度也显着降低。聚合酶链式反应(PCR)分析深入表明,细胞培养液中硅酸及镉浓度增加后可提高硅转运子(Lsi1)的表达,同时抑制镉的转运子Nramp5的表达。2、水稻悬浮细胞在短期和长期的镉胁迫下,诱导表达了100个受硅调控的蛋白,其功能分布表明存在两种不同的硅诱导的脱毒机制。在短期或长期镉胁迫下iTRAQ结果表明存在100个受硅调控的差异表达蛋白,其中70%的表达为下调,表明细胞壁上存在有机硅可改善细胞内的蛋白利用效率,并可维持细胞正常的生理生化功能。结合荧光染色和ICP-MS发现,在短期镉胁迫下与细胞壁相关的糖苷酶、细胞表面的非特异性脂质转移蛋白和一些胁迫相关蛋白的表达下调。延长胁迫时间后,加硅细胞除了能够阻止一部分镉吸收进入细胞内,还可将胞内镉隔离在特定的囊泡内,以维持谷胱甘肽系统的正常运转。3、水稻单细胞外包裹的二氧化硅纳米壳除了能提高细胞表面的力学性能外,显着降低了细胞壁表面电势,从而通过静电作用显着提高细胞壁对镉离子的吸附。借助预先吸附到带负电的细胞壁表面上的聚乙烯亚胺(PEI),催化二氧化硅前体相正硅酸甲酯(TMOS)水解形成二氧化硅纳米壳。AFM力学测量表明,二氧化硅纳米壳显着提高了细胞表面的力学强度。场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)和AFM-KPFM分析发现纳米壳是由不同尺寸的二氧化硅纳米粒子堆砌而成,拥有很大的比表面积,并带更多的负电荷从而显着吸收带正电的镉离子。NMT的测定深入表明细胞表面的二氧化硅纳米壳对镉离子的吸附是裸细胞的6-10倍,极显着地抑制了细胞对镉离子的吸收。
陈昊[2]2017年在《水稻穗粒数基因GN2的克隆与功能分析》文中进行了进一步梳理穗粒数是决定水稻产量的关键要素之一。普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)与亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)相比,穗粒数明显减少。因此,鉴定普通野生稻中穗粒数相关基因,对阐明水稻穗粒数形成以及栽培稻演化分子机理具有重要意义。本研究从一套以云南元江普通野生稻为供体亲本、籼稻品种特青为受体亲本构建的渗入系中,筛选到一个小穗渗入系YIL19。以其为研究材料,通过图位克隆的方法,分离和克隆了一个控制水稻穗粒数的新基因Grain Number 2(GN2),并对其功能和形成机制进行了研究。主要结果如下:(1)YIL19与特青相比,不仅穗粒数减少,还表现出株高降低和抽穗期推迟。穗部结构性状的分析表明YIL19穗粒数的减少是由于其一次枝梗长度较特青缩短,进而导致二次枝梗数减少引起的。(2)利用YIL19与特青回交,构建了F2次级分离群体。通过对该群体的穗粒数QTL分析,发现YIL19穗粒数减少的表型受一个主效QTL-GN2控制。GN2位于第2染色体长臂末端,来自野生稻的等位基因相对来自特青的等位基因表现为完全显性。进一步利用F2次级分离群体筛选重组交换个体,并鉴定其后代家系的表型,通过两步代换法将GN2精细定位在一个物理距离约47-kb的区间内,该区间包含6个预测基因。(3)比较GN2精细定位区间内YIL19和特青的基因组序列,发现YIL19在预测基因LOC_Os02g56630的第3个外显子上有一个长度为1094-bp的DNA片段插入。该DNA片段插入事件产生了 2种新的转录本,全长分别为497-bp和494-bp,是由不同剪切模式引起。新转录本拥有一个相同的前体,包含2个外显子和1个内含子。序列分析表明其是由部分的1094-bpDNA插入片段招募邻近基因组序列嵌合而成。新转录本在YIL19各时期各器官中呈组成型表达。(4)遗传互补实验表明,过量表达新转录本的转基因植株较对照植株穗粒数明显下降,同时株高降低,抽穗期延迟。由此可证明该转录本就是目标基因GN2。GN2的两种剪切模式表现出相似的生物学功能。(5)利用不同浓度外源赤霉素处理YIL19和特青的幼苗,发现YIL19对外源赤霉素不敏感。表达分析表明,YIL19的幼苗中GA20氧化酶基因的表达水平较特青显着提升。由此初步推测GN2可能通过赤霉素途径实现其生物学功能。(6)对1094-bp的DNA插入片段的序列分析表明,该片段被一种未知的DNA片段移动模式由LOC_Os02g45150位点"剪切"到了LOC_Os2g56630位点。该"剪切"事件产生了新的功能基因GN2,其与LOC_Os02g45150和LOC_Os02g56630的基因结构与表达模式都不同,并使植株产生了显着的表型变化。对236份代表水稻遗传多样性的种质材料的检测结果表明,GN2仅在云南元江野生稻的自然群体中被检测到,并在该群体内有较高的发生频率。这暗示了 GN2很可能是一个非常"年轻"的基因,新近形成于云南元江野生稻的自然群体中,并在该群体中受到了正向选择。
塔巴桑（MUHAMMAD, ADNAN, TABASSUM）[3]2016年在《干旱胁迫对水稻光合作用和水力导度的影响及其机理研究》文中指出水稻是世界上最重要的粮食作物之一,超过世界上一半以上的人口以水稻为主要口粮。水稻是农业生产中的耗水大户,消耗了中国大约70%左右的农业用水。干旱是农业生产中主要的非生物胁迫之一,随着全球气候的逐渐变暖,干旱胁迫将持续威胁农业尤其是水稻生产。叶片是植物进行光合作用的场所,叶片形态、结构、生理状况等功能性状及其相互关系被称为叶片经济频谱。自本世纪以来,叶片经济频谱成为植物学家们的研究热点。但是,叶片经济频谱在作物尤其是水稻中的研究较少。光合作用是作物生产的关键生理过程,大约95%的干物质来源于光合产物,并且光合作用对环境胁迫非常敏感。植物水力结构能够通过调控植物的水分状况来影响光合作用,叶片是水分在植物体内传输的主要阻力之一。但是目前尚不清楚(1)不同水稻品种之间叶片结构特征(包括比叶重、叶脉密度、大小叶脉厚度等)是否存在差异;(2)干旱胁迫如何影响叶片结构特征;(3)叶片结构特征是否能够影响植株和叶片水力导度,干旱胁迫是否能够调控它们之间的关系;(4)叶片结构特征是否能够通过调节植株水力导度来调控光合作用,并且干旱胁迫是否能够影响它们之间的关系。在本研究中,选取8个或2个抗旱能力不同的水稻品种进行营养液培养,并采用添加PEG6000的方式模拟干旱胁迫。测定叶片光合特性、叶片结构特性、植株水力导度(Kplant)和叶片水力导度(Kleaf),主要结果如下:(1)干旱胁迫条件下净光合速率(A)、气孔导度(gs)、蒸腾速率(Tr)和Kplant均显着降低,而比叶重、叶片氮素含量、SPAD值、叶脉密度和小叶脉与大叶脉的比值等均显着提高。无论在对照还是在干旱胁迫条件下,净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和植株水力导度均呈现显着的正相关关系。与对照相比,干旱胁迫下净光合速率的降低幅度与植株水力导度的降低幅度呈现显着的正相关关系,同时叶脉密度与光合速率的降低幅度呈现显着的负相关关系。(2)不同品种之间叶脉发育存在显着的差异,并且水分胁迫显着提高了叶脉密度,但显着降低了叶脉的厚度。干旱胁迫显着降低了Kplant和Kleaf,并且Kplant的降低幅度显着高于Kleaf。无论在对照还是在干旱胁迫条件下,叶脉密度均与Kleaf呈现显着的正相关关系。但是,叶脉密度与Kplant仅在对照条件下才呈现出显着的正相关关系。同样,Kleaf与Kplant也仅在对照条件下才呈现出显着的正相关关系。(3)干旱胁迫显着降低了叶片净光合速率、羧化效率、rubisco酶最大羧化能力、最大电子传递速率、气孔导度、叶肉导度和kplant。同时,净光合速率与气孔导度、叶肉导度和kplant均呈现出显着的正相关关系。(4)干旱胁迫显着抑制了净光合速率、气孔导度和kplant,并且hanyou-3的降低幅度显着高于ir-64。同时,ir-64的叶脉密度显着高于hanyou-3。净光合速率、气孔导度和kplant均呈现出显着的正相关关系,并且与叶脉密度呈现出显着的负相关关系,而与叶脉间的距离和叶脉厚度呈现出显着的正相关关系。因此,叶脉发育显着影响了叶片水力导度,但是叶片水力导度仅在对照处理下与植株水力导度呈现显着的正相关关系。气孔关闭是干旱胁迫下光合速率降低的主要原因,同时也与叶肉导度和叶片同化能力的降低有关。光合速率与植株水力导度呈现显着的正相关关系,提高叶脉密度有利于缓解干旱胁迫下光合速率的降低。
贾继增, 高丽锋, 赵光耀, 周文斌, 张卫健[4]2015年在《作物基因组学与作物科学革命》文中研究指明作物科学的发展对于世界粮食的增产起着重要的作用。本文回顾了第一次绿色革命的历史。通过比较中国与国际上矮化育种时间、矮源的来源以及同期主要绿色革命国家产量的提高幅度,证明中国应该是第一次绿色革命的策源地与发起国之一。包括"中国绿色革命"、杂交水稻等成果在内的中国作物科学研究成果对中国及世界作物生产作出了突出的贡献。当前中国的作物生产面临着严峻的挑战。第一次绿色革命之后的数十年间,中国小麦等主要粮食作物遗传改良年增长仅为0.7%—0.9%,远低于1.7%的需求;肥水利用效率仅为发达国家的1/3;机械化程度虽有较大的提高,但与发达国家相比仍有较大差距;农产品品质不能满足人们的需求,食品安全存在较大问题。鉴于上述情况,目前迫切需要开展一场以"更高产、更高效、更优质、更环保"为主要目标的新的绿色革命。尽管传统的作物科学对作物生产作出了巨大的贡献,但事实证明,仅靠传统的作物科学难以完成新的绿色革命重任。作物基因组学是当前生物科学领域发展最为迅速的一门新兴学科。当前大多数作物基因组测序已经完成,标志着作物科学已经进入基因组时代,为基于基因组学的作物科学研究奠定了基础。基因组学的发展正在促进作物科学在以下4个方面取得重要进展:(1)促进作物种质资源核心种质构建、重要农艺性状基因的克隆与种质资源的开发与利用,推动种质资源变异组学科的形成;(2)促进作物育种理论与育种方法的重大突破,推动育种基因组学的形成与发展;(3)推动环境条件与栽培措施影响基因表达调控的影响机制研究,一批受环境因素调控的基因将被发现,促进栽培学研究向栽培基因组学的方向发展;(4)迅速提高特色作物的研究水平,缩小作物间研究差距。当前是作物科学发展史上前所未有的高速发展时期,种质资源变异组学、育种基因组学与栽培基因组学的发展将引起作物科学的革命,并将由此引发新的绿色革命。文中分析了中国当前在研究队伍的组织、研究题目与研究材料的选择与研究成果的转化等方面存在的问题,并提出了解决方法及发展方向。
柯善文[5]2016年在《细茎柱花草转录组测序及耐寒相关基因的克隆与功能研究》文中提出柱花草(Stylosanthes spp.)原产于美洲的热带和亚热带地区,最适宜的生长纬度在北纬30°至南纬30°之间,是一类在全球热带地区栽培种植面积最大且应用最为广泛的优良热带豆科牧草,可用于动物的青饲料、干草粉生产、水土保持和放牧等。柱花草的生长习性为喜温多湿,可在干旱和低肥力地区生长,耐贫瘠,耐低磷,耐热,耐酸性廋土,抗虫害,但不耐低温,低温是限制柱花草向高纬度推广的重要限制因子。本研究在柱花草的育种改良过程中,从细茎柱花草(S.guianensis var.intermedia)中获得一个较为抗寒的新品系“89-1”,利用新一代Illumina测序技术对该柱花草抗寒新品系在低温(4℃)和适温(28℃)环境下的转录组进行测序,在转录组测序的基础上,对柱花草SgNAC1、SgNAC2和SgGH3基因进行克隆及功能分析,主要研究结果如下:(1)对细茎柱花草抗寒新品系89-1和圭亚那柱花草TPRC2001-1同时进行低温(4℃)处理0h、24h和48h,测定不同低温处理时期叶片的各项生理指标,结果表明,低温处理0h时,二者的各项生理指标差异不大,但低温处理48h后,TPRC2001-1的相对电导率和丙二醛含量分别是89-1的2.10与1.57倍,而89-1的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等可溶性渗透调节物质的含量分别达到TPRC2001-1的1.45、1.24和1.28倍。说明89-1对低温的抵御能力强于TPRC2001-1,对低温具有一定的抗性。(2)对转录组测序获得的序列进行过滤、拼接、组装和注释,从对照组(CK)和低温处理组(LT)中分别获得89,868,386和91,942,130条高质量reads,可拼接出222,717条长度在201~12,267nt之间的contig,这些contig进一步组装成83,873个unigenes。注释结果表明,有10,7349、63,990和53,797个contig可分别注释到NR、Swiss-Prot和KEGG数据库,序列相似匹配度最高的物种为大豆(Glycine max)。GO分类可将42.90%的contig归入到3个功能类别的54个功能组,COG功能分类将25.57%的contig分为24个功能体系,此外,KEGG将21.50%的contig归入到238条pathway。低温胁迫和适温条件下,显着差异表达的unigenes数有42,588个,其中41.18%的unigenes为上调表达。差异表达基因显着富集的pathway有18条,其中最为显着富集的pathway是角质、软木脂和蜡质生物合成途径,这些物质的合成与不饱和脂肪酸合成有关。从差异表达基因中共鉴定出9类转录因子,其中的多数参与了信号转导途径。(3)根据转录组测序获得sgnac1、sgnac2的部分cds序列和sggh3基因的cds全长序列,利用hitail-pcr技术,克隆了sgnac1和sgnac2基因的cds全长序列。sgnac1、sgnac2和sggh3的cds全长分别为909、777和1,809bp,sgnac1和sgnac2都由3个外显子和2个内含子组成,基因组dna全长分别为1,185和951bp。在sgnac1和sgnac2的蛋白结构中都含有一段保守的nam结构域,推测它们都是nac类转录因子,并通过酵母单杂交技术对其转录激活活性进行了验证。sggh3具有植物gh3蛋白特征,多序列比对和进化分析表明其属于与生长素合成相关的gh3家族成员。基因表达分析表明,sgnac1和sgnac2都在早期响应低温,而sggh3则可能属于在后期对低温进行响应的基因。(4)在原生质体的分离过程中,以柱花草的幼嫩叶片为分离材料,通过对各种影响因素的筛选,分离得到高质量柱花草原生质体的最佳酶液组合为:1.5%纤维素酶+0.4%离析酶,最适酶解时间为8h,最佳甘露醇浓度和mes浓度分别是0.4mol/l和20mmol/l。完善后的分离体系,可得到数量在3.0×106个/gfw左右、活力高于80%的原生质体。通过peg介导转化法,使融合gfp的sgnac1和sgnac2基因在35s的驱动下分别在柱花草原生质体中瞬时表达,将sgnac1和sgnac2蛋白定位于细胞核中。(5)构建了sgnac1、sgnac2和sggh3基因的过表达载体,并通过农杆菌转化技术分别转化野生型烟草,成功的获得转基因植株。通过荧光定量pcr对sgnac1、sgnac2和sggh3在转基因烟草中的表达模式进行分析,发现sgnac1、sgnac2的表达量在低温处理6h后,分别上升了2.89和2.68倍。sggh3在低温处理前期的表达量较低,24h时达到最高,为处理起始时期的6.46倍,在之后的24h内只下降了8.30%。基因表达分析表明,低温胁迫下,sgnac1和sgnac2作为转录因子较早地响应低温,而sggh3可能受其他基因的调控,在后期表达。对转基因烟草各项生理指标的测定结果表明,低温处理48h后,野生型的相对电导率和丙二醛含量分别是转基因植株sgnac1-oe、sgnac2-oe和sggh3-oe的1.32、1.24和1.48倍,脯氨酸、可溶性糖与可溶性蛋白等物质分别只达到转基因植株的71.95%、74.40%和63.11%,说明sgnac1、sgnac2和sggh3基因的过表达在一定程度上降低了细胞膜在低温下的受损程度,促进了胞内渗透调节物质的积累,提高了烟草的抗寒性。
沈雨民[6]2015年在《水稻种间杂种不育的细胞学研究及不育基因S37的精细定位》文中提出水稻作为世界上的主要粮食作物之一,在粮食安全中具有特殊的重要性。随着世界人口的不断增加,水稻产量的提高愈发为科研工作者,特别是水稻育种家们所关注。近些年来,由于一些高产水稻品种的大面积推广和应用,使得水稻遗传基础变得越来越狭窄,有利基因在育种过程中丢失,从而使得当前的水稻产量徘徊不前。亚洲栽培稻(Oryza sativa)的野生及近缘种中存在有丰富的遗传变异,通过利用这些亚洲近缘种与当前主栽品种的种间杂交,引进远缘种的有利基因,从而对现有的推广品种进行遗传改良,创造出新的种质资源,是突破水稻产量瓶颈的有效方法。而非洲栽培稻中具有许多亚洲栽培稻所急需的优良基因,如果能将这些优良基因引入到亚洲栽培稻中,将会对水稻育种产生重大的影响。但是,非洲栽培稻与亚洲栽培稻杂交后代常常出现严重的杂种不育,从而导致非洲栽培稻中有利基因难以在亚种栽培稻中直接利用。因此,迫切需要深入解析水稻种间杂种不育的分子机理,为种间杂种优势利用提供理论基础。本研究以粳稻品种滇粳优1号(DJY1)为轮回亲本,非洲栽培稻IRGC102375为供体亲本,构建了一个近等基因系(NIL),发现DJY1与NIL杂种F1败育(同时表现为花粉半不育和小穗半不育)受一对杂合基因座位控制,根据现已报道的不育基因,暂将这个不育基因位点命名为S37,本研究详细阐明了杂种F1花粉败育和胚囊败育的细胞学机理,并且对S37进行精细定位,比较了非洲栽培稻与亚洲栽培稻S37位点基因组序列的差异,为进一步的S37基因图位克隆,并最终阐明水稻栽培稻种间杂种不育的分子机理奠定了坚实的基础。本论文的主要研究结果如下:1.粳稻滇粳优1号与NIL杂交F1同时表现为花粉半不育和小穗半不育。细胞学观察显示:杂种F1花粉的败育类型为染败,败育时期为二核花粉晚期,败育的原因主要是小孢子在第二次有丝分裂后期出现异常,从而导致生殖核的败育。对花药半薄切片观察显示:杂种F1花药能够正常发育,花药内壁的绒毡层也能够正常形成和降解,花粉育性的降低与绒毡层无关。对亲本和杂种F1成熟胚囊进行激光共聚焦扫描观察显示:杂种F1胚囊出现不同程度的败育,败育的类型主要是胚囊不分化和空胚囊。随后利用石蜡切片方法对杂种F1胚嚢发育过程进行连续切片,实验结果表明F1胚囊的败育时期为功能大孢子第二次有丝分裂时期,此时期F1不能形成正常的四核胚囊,从而无法进行下一步发育。苯胺蓝染色观察发现亲本的柱头有大量花粉粒附着,并有花粉管伸入到花柱中;杂种F1柱头上花粉粒的附着较亲本稍少,花粉管能正常伸入花柱中。辅助授粉实验表明,对亲本DJY1授以杂种F1的花粉能够使DJY1的结实率达到正常水平;而对杂种F1授以亲本DJY1的花粉,F1的结实率只有41.6±3.5%。综合以上结果表明,杂种F,结实率的降低主要是由于胚囊的部分败育造成的,杂种F1花粉育性的降低对小穗结实率影响并不大。2.F2群体中出现严重的偏分离现象,半不育的植株明显偏少。为了研究雌雄配子后代传递效率,配制4个BC1F1群体,结合与S37位点紧密连锁的分子标记数据及表型数据,发现携带S37j(j:粳稻)的雌雄配子后代传递效率都极低。3.连锁分析将S37初步定位于第1染色体分子标记RM140和B1-5间的20.6cM遗传区间内,该区间包含第1染色体的着丝粒。随后,利用包含有25600个单株的F2群体(DJY1×NIL-S37)对S37位点进行了精细定位,最终将S37基因精细定位于InDel标记A16和S1之间,两标记在日本晴基因组序列间的物理距离为205kb,而在非洲栽培稻基因组序列间的物理距离只有108kb,非洲栽培稻比亚洲栽培稻缺失了97kb的序列片段。4.DJY1为典型的粳稻品种,与测序的日本晴基因组序列非常相似,对包含S37位点的205kb区域内的基因组序列进行基因预测分析,在这个区域内存在54个ORFs;而由于NIL-537相对于DJY1存在97kb片段的缺失,所以近等基因系NIL-S37预测只有29个ORFs。DJY1和非洲栽培稻序列间差异较大,亲本间的ORFs大多数都没有相同的结构和功能,除了DJY1定位区域内的ORF53和ORF54,对应于NIL-S37定位区域内的ORF28和ORF29,这两对基因可能为S37位点的候选基因。5.分离群体中与S37紧密连锁的分子标记A16到标记S4之间的重组率急剧下降,表明亚洲栽培稻和非洲栽培稻间的序列差异可能抑制了正常的重组事件。通过序列比对,发现DJY1的205kb序列和NIL-S37的108kb序列存在显着差异,在NIL-S37上存在叁个分布在不同位置片段的缺失。利用S37位点附近DJY1序列设计的引物对21个非洲栽培稻品种和42个亚洲栽培稻品种进行进化分析,反应了非洲栽培稻和亚洲栽培稻是独立驯化的。
郭洁[7]2016年在《水稻籼粳亚种间杂种不育性的克服》文中进行了进一步梳理籼粳亚种间杂种优势的利用已逐步发展成为水稻(Oryza sativa L.)超高产育种的一条重要途径。籼稻(indica)和粳稻(japonica)是亚洲栽培稻的两个亚种,其杂种F1表现出强大的杂种优势,但是,普遍存在的杂种不育现象严重阻碍了籼粳亚种间杂种优势的利用。本研究分析籼粳亚种间杂种不育基因座Sa和S5的等位基因变异,利用功能标记筛选出不同基因型的品种,为杂交育种提供更多的种质来源。并通过聚合育种培育出华粳籼74广亲和系和不同粳稻背景的粳型亲籼系,克服了籼粳亚种间的杂种不育性。本研究主要研究结果如下:1、利用杂种不育基因座S5的功能标记对来源各国及全国各地的144个品种的基因型进行分析,发掘出74个基因型为S5-i/S5-i的品种,62个基因型为S5-j/S5-j的品种,以及8个基因型为S5-n/S5-n的品种,为杂交育种提供了更多的种质来源。从华粳籼74单片段代换系文库中筛选出9个携带S5位点的单片段代换系,存在3种等位基因类型,其中携带S5-n等位基因的单片段代换系与携带S5-i等位基因的单片段代换系以及携带S5-j等位基因的单片段代换系杂交都能产生正常育性的后代,但携带S5-i等位基因的单片段代换系与携带S5-j等位基因的单片段代换系杂交的杂种F1由于携带S-j的配子败育而表现为半不育。2、利用杂种不育基因座Sa的功能标记分析供体亲本以及单片段代换系的基因型,发掘出14个携带SaM+SaF+(Sa-i)等位基因的品种,包括12个籼稻品种和2个粳稻品种,6个携带SaM-SaF-(Sa-j)等位基因的粳稻品种,6个单片段代换系全部携带Sa-i等位基因,没有携带Sa-n等位基因的材料。此外这些材料在Sa位点存在3种单倍型,其中H1为S-j等位基因,而H2和H3可能分别是具有不同分化度的S-i等位基因。3、F1花粉不育基因聚合系TISL-Dbc-Gde具有粳稻遗传背景及粳稻表型特征,是个粳型品系,并且与籼稻测交能产生具有正常花粉育性的杂种F1,但其小穗育性表现为半不育。随后将F1花粉不育基因聚合系TISL-Dbc-Gde分别与供体亲本中基因型为S5-n或S5-i的粳稻材料组配杂交,最终获得了8个粳型亲籼系。其中ICJL-T-W6、ICJL-T-W19、ICJL-T-W21、ICJL-T-W22、ICJL-T-W23、ICJL-T-W24和ICJL-T-W27这7个粳型亲籼系在花粉不育基因座Sb、Sc、Sd和Se携带S-i等位基因,在胚囊不育基因座S5携带S-n等位基因。粳型亲籼系ICJL-T-W7,在花粉不育基因座Sb、Sc、Sd和Se以及胚囊不育基因座S5都携带S-i等位基因。这8个粳型亲籼系具有粳稻的遗传背景,表现出对粳稻测验种不亲和,但对籼稻测验种具有亲和性,与籼稻测验种杂交产生的后代无论是花粉育性还是小穗育性都是正常的,有效地克服了籼粳亚种间杂种不育性。4、以华粳籼74单片段代换系文库作为平台,利用分子标记辅助选择技术,聚合携带Sc-n的单片段代换系(Sc-11,Sc-22和Sc-27)和携带S5-n的单片段代换系(S5-21,S5-23和S5-27),获得了9个华粳籼74广亲和系,该材料在5个杂种不育基因座S5、Sb、Sc、Sd和Se都携带S-n基因。与华粳籼74相比,华粳籼74广亲和系对籼稻和粳稻测验种具有更高的亲和性,与测验种杂交产生的后代无论是花粉育性还是小穗育性都是基本正常的,有效地克服了籼粳亚种间杂种不育性。本研究表明了籼粳亚种间杂种不育性主要受花粉不育基因座Sb、Sc、Sd和Se以及胚囊不育基因座S5控制。从解决实际问题的角度出发,通过聚合育种,将这4个花粉不育基因座的S-i等位基因和胚囊不育基因座S5的S5-n或S5-i等位基因聚合到粳稻品种中,获得了8个不同粳稻背景的粳型亲籼系,它们对籼稻高度亲和,有效地克服了籼粳亚种间的杂种不育性;同时将2个不育基因座的S-n等位基因聚合到华粳籼74中,获得了9个在5个杂种不育基因座都携带S-n等位基因的华粳籼74广亲和系,它们对籼稻和粳稻都具有亲和性,同样有效地克服了籼粳亚种间的杂种不育,从而实现了籼粳亚种间强大的杂种优势的利用。
李本[8]2016年在《水稻芒性基因Awn3-1、Awn4.1、Awn8-1的精细定位及Awn4-2的图位克隆》文中提出芒是水稻及其他禾本科作物重要驯化性状之一,同时也是重要的农艺性状。本研究构建了一系列芒性作图群体,利用4个精细作图群体分别定位了4个调控芒性发育基因,并对一个进行了克隆。利用粳稻品种SLG(具芒)作为供体亲本,粳稻品种日本晴(无芒)作为受体亲本构建近等基因系,在前人定位基础上,利用8103株BC4F4群体和定位区间内6个多态性连锁标记,将Awn3-1定位于3号染色体上Indel标记In316和SNP标记S9之间,物理距离为101.13kb,该区间内有9个候选基因。对候选基因在近等基因系显隐性材料间进行序列分析未发现差异。但表达分析显示Os03g0418600在显隐性材料间存在差异,推测其为调控芒性发育的基因。此外,Awn3-1和本实验室已发现的调控芒性发育基因Awn4-2对芒长和芒分布存在积加作用。利用粳稻品种高丽早稻(具芒)作为供体亲本,粳稻品种日本晴(无芒)作为受体亲本构建近等基因系,结合前人定位结果,利用7072株BC6F5群体和3个新开发多态性连锁标记,将Awn4.1在4号染色体上的定位区间缩小至20.02kb,该区间内有2个候选基因。利用叁亚抽穗期极晚的粳稻材料(具芒)作为供体亲本,与粳稻品种日本晴(无芒)杂交后构建芒性重组自交系。对F3群体的遗传分析表明,芒性状受一对显性核基因控制,命名为Awn8-1。利用BSA法结合连锁分析,将Awn8-1初步定位在8号染色体长臂上SSR标记RM7556和M3381之间。利用12204株F4群体和6个多态性连锁标记,将Awn8-1定位于SSR标记RM23337和SNP标记S3之间,物理距离为25.66kb,该区间有3个候选基因。序列分析表明,Os08g0485500基因第二外显子上存在4bp插入缺失,3’UTR上存在2个SNPs。利用粳稻品种抚宁小红芒(具芒)为供体亲本,粳稻品种日本晴(无芒)为轮回亲本构建近等基因系,对调控芒性发育的基因Awn4-2进行定位及克隆。利用11206株BC4F6群体和定位区间内7个多态性连锁标记,最终将Awn4-2定位在4号染色体SSR标记M1126和Indel标记In73之间,物理距离为62.4kb。根据RAP-DB的预测,该区段内有3个注释基因。序列分析表明,在日本晴和隐性材料中,预测基因Os04g0350700启动子区存在约4.4kb的转座子插入,基因序列存在7个SNPs。结合半定量表达分析,Os04g0350700可能是Awn4-2。Os04g0350700编码一个具有bHLH保守结构域的转录因子。序列分析表明,Awn4-2第二个外显子处的SNP可能不影响基因功能,启动子区域转座子的插入可能导致基因表达受抑制,导致芒不能正常发育。为验证其功能,我们分别构建了Awn4-2基因的RNA干扰载体和过表达载体。表达特性分析显示,该基因主要在有芒材料幼穗中表达。根据调控表型和序列差异,推测该基因为An-1的等位基因。
崔书建[9]2015年在《水稻对稻瘟菌侵染胁迫应答机制的定量蛋白质组学研究》文中研究表明水稻是世界上最重要的粮食作物之一,它广泛的适应性和高产性能使水稻生产具有巨大社会意义和重要的战略意义,在粮食危机愈演愈烈和人口总数不断增长的历史背景下,全世界对水稻生产的期望也越来越高。据预测,到2050年,水稻产量在现有基础上翻一番才能基本满足不断增长人口需求。水稻病害是造成稻谷产量下降的主要原因之一,如水稻叁大病害之一的稻瘟病每年给水稻造成11-30%的产量损失。尽管化学防治对水稻病害效果显着,但由于施用时期局限、病原菌抗药性增强、对环境造成严重污染和对稻米品质的关注提高,一定程度上限制了化学药剂的使用。与之相反,抗病水稻品种的选育及大面积推广却是多年来被证明为防治病害最经济、最有效和最安全的解决途径。本论文研究内容涉及植物生理学、生物化学、定量蛋白值组学等技术,研究内容主要包括(1)通过体外标记技术(iTRAQ)结合高通量的质谱鉴定平台(LC-MS/MS),对水稻响应稻瘟菌侵染胁迫时,不同时间段叶片样本蛋白质表达进行研究;(2)对不同抗性水稻品种响应稻瘟菌侵染胁迫时叶片样本蛋白质表达进行定量研究;(3)通过生物信息学手段结合实验验证,旨在找到稻瘟菌侵染水稻时,水稻发生差异表达的蛋白,从而从分子水平阐明抗病性机制,为培育优质、抗病的水稻新品种奠定基础,推动水稻抗稻瘟菌的分子机制研究。本论文的主要结果是:1)在水稻对稻瘟菌侵染不同时间胁迫应答的定量蛋白质组学研究中,我们提取谷梅2号在稻瘟菌(Guy11)侵染0小时、24小时、48小时后的叶片蛋白,进行定量、酶解及标记处理,再根据肽段特征,将复杂肽段进行SCX柱的初级分离,最后通过LC-MS/MS高通量质谱鉴定平台(ABSECXTripleTOFTM4600)进行图谱采集。通过ProteinPilot4.5软件(ABSCIEX,FosterCity)针对280,528条Oryzasativa蛋白序列进行搜索。数据采集时,对每个组分进行两次技术重复,即共采集20个组分,每10个组分采集图谱经过软件整合到一个文件中,每个文件分别针对Oryzasativa库进行比对搜索,两次结果表为Repeat 1 和 Repeat2。结果显示,Repeat 1 在 FDR 为 1.0%时,共鉴定到 33,373 Spectral,15,835条肽,1,604 个蛋白。Repeat2 在 FDR 为 1.0%时,共鉴定到 33,004 Spectral,15,800条肽,1,581个蛋白。取2个及2个以上肽段支持的蛋白作为分析的结果。结果表明,Repeat1共有1,234个蛋白,Repeat2共有1,210个蛋白。根据上述得到的结果,将两次实验得到的蛋白进行分类,分为上调和下调,将ratio值大于1.2的标为上调,小于0.8的标为下调,去除只有一次鉴定到的且趋势不一致的蛋白,剩余蛋白分为五组:在稻瘟菌侵染24小时和48小时后,蛋白表达量在两个时间段都上调的一组共121个蛋白;稻瘟菌侵染24小时和48小时后,蛋白表达量有一时间段上调的一组共26个蛋白;稻瘟菌侵染24小时和48小时后,蛋白表达量有一时间段下调的一组共34个蛋白;稻瘟菌侵染24小时和48小时后,蛋白表达量有一时间段上调且另一时间段下调的一组共43个蛋白;稻瘟菌侵染24小时和48小时后,蛋白表达量两个时间段都下调的一组共148个蛋白。对差异表达蛋白进行生物信息学分析、GO分类和KEGG-pathway分析,结果表明,这些差异表达蛋白共在79个通路中起着关键作用,参与较多的为光合作用途径;对差异表达蛋白进行分泌蛋白分析,发现其中61个蛋白具有信号肽,可能为分泌蛋白。进行GO enrichment分析时,发现在TCA循环、NADP代谢过程、异构酶活性等15个分类中有富集;我们还将这些蛋白进行网络互作分析,通过string在线分析发现,有314个功能被String数据库收录,分析显示,这314个蛋白存在相互作用,有两类蛋白发生聚类现象,对这些蛋白进行分析发现这两类蛋白分别为:一类为光合相关蛋白,另一类为核糖体相关蛋白。这两类蛋白在水稻中起着重要功能,光合相关蛋白参与光合作用,提供能量;核糖体蛋白与转录调控有关。提示在稻瘟菌侵染水稻时,这两类蛋白发生了变化,参与了水稻拮抗稻瘟菌的过程。在水稻受稻瘟菌侵染不同时间段表达差异的蛋白中,发现胰蛋白酶抑制剂含量显着上升。定量PCR分析结果表明,编码胰蛋白酶抑制剂基因在mRNA水平也显着上升。胰蛋白酶抑制剂是一类能够抑制蛋白水解酶活性的蛋白质,该蛋白能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶。因此它具有防止体内不必要的蛋白降解,调节蛋白代谢及调节各种蛋白酶生理活性的功能。很多植物的胰蛋白酶抑制剂还具有抑制某些病原微生物及某些昆虫体内蛋白酶的作用,是植物体的一种自然防御体。有趣的是我们在筛选差异表达蛋白质时,发现一个putative dioscorin的蛋白,dioscorin为山药储藏蛋白。有研究表明,该蛋白有胰蛋白酶抑制剂活性,在我们鉴定的结果中也显示该蛋白在水稻遭受稻瘟菌侵染时,表达量显着提升,与胰蛋白酶抑制剂的趋势是一致的。研究还表明,与光合作用密切相关的蛋白,如Rubisco的大亚基、Rubisco subunit binding-protein alpha subunit等,在水稻遭受稻瘟菌侵染时表达量急剧下降,而与能量代谢相关的蛋白,如 ATP synthase CF1 beta subunit,ATP synthase CF1 alpha chain,则在水稻遭受稻瘟菌侵染时表达量上调。2)在不同抗性水稻对稻瘟菌侵染胁迫应答的定量蛋白质组学研究中,我们对提取的稻瘟菌(Guy11)侵染24小时的抗稻瘟菌水稻(谷梅2号)和不抗稻瘟菌水稻(黑谷)的叶片蛋白进行定量、酶解及标记处理,再根据肽段特征,将复杂肽段进行SCX柱的初级分离,最后通过LC-MS/MS高通量质谱鉴定平台(ABSECXTripleTOFTM4600)进行图谱采集。通过 ProteinPilot4.5 软件(ABSCIEX,FosterCity)针对 Oryzasativa 蛋白序列进行搜索。在FDR为1.0%时,取2个及2个以上肽段支持的蛋白进行分析。两次重复分别鉴定到1,196和1,180个蛋白。将ratio值大于1.2的标为上调,小于0.8的标为下调,去除只有一次鉴定到的且趋势不一致的蛋白,在抗性水稻种得到上调表达的蛋白220个,下调表达的蛋白240个。对差异表达蛋白进行生物信息学分析、GO分类和KEGG-pathway分析,结果表明,这些差异表达蛋白共在81个通路中起着关键作用,参与较多的为糖异生/糖酵解途径。进一步将差异表达蛋白进行分泌蛋白分析,发现其中68个蛋白具有信号肽,可能为分泌蛋白。进行GO enrichment分析时,发现在光合作用、羧酸代谢过程,叶绿体组成等11个分类中有富集;我们还将这些蛋白进行网络互作分析,通过string在线分析发现,有385个功能被String数据库收录,这385个蛋白存在相互作用,有两类蛋白发生聚类现象,对这些蛋白进行分析发现这两类蛋白分别为:一类为能量代谢相关蛋白,另一类为核糖体相关蛋白。这与前面GO enrichment分析的结果是一致的,不同抗性的水稻在能量代谢和转录合成存在差异,深入研究这些差异功能,为阐明水稻抗稻瘟菌的分子机制做出贡献。在研究内容1)中我们发现,抗稻瘟菌谷梅2号在遭受稻瘟菌侵染时,胰蛋白酶抑制剂的表达显着提升,在质谱分析结果和定量PCR结果一致。在不同抗性水稻对稻瘟菌侵染胁迫应答机制研究中,我们发现抗稻瘟菌株水稻在遭遇稻瘟菌侵染时,胰蛋白酶抑制剂的表达量比不抗稻瘟菌株(黑谷)显着提升,这一结果与Peng等在番茄叶片遭受致病疫霉时结果是一致的。根据本研究的结果,我们认为稻瘟菌在侵染水稻时,可能需要大量水解蛋白以提供能量,水稻为了拮抗稻瘟菌的侵入,高表达胰蛋白酶抑制剂,从而抑制胰蛋白酶的活性,而具有胰蛋白酶抑制剂活性dioscorin(山药储藏蛋白)也急剧提升,从而达到抑制胰蛋白酶的活性,最终达到拮抗稻瘟菌的侵染。光合代谢相关的蛋白 Rubisco activase large isoform precursor 和 Rubisco subunit binding-protein alpha subunit表达在抗稻瘟菌株中比感染株中显着下调,且两个蛋白在抗稻瘟菌株中比感染株中显着下调;由此,我们推测,稻瘟菌侵染水稻,抗稻瘟菌株水稻通过下调表达 Rubisco activase large isoform precursor 和 Rubisco subunit binding-protein alpha subunit,从而降低抗稻瘟菌水稻叶片的光合作用,拮抗稻瘟菌的侵入。能量代谢相关蛋白 ATP synthase CF1 beta subunit,ATP synthase CF1 alpha chain 在不同抗性水稻遭遇稻瘟菌侵染下,ATP synthase CFI beta subunit有限上调,而ATP synthase CF1 alpha chain基本没有变化。
季芝娟[10]2016年在《水稻恶苗病抗性相关基因的鉴定及多抗基因的聚合育种利用》文中研究说明水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一,养活50%的世界人口。与其它作物类似,水稻也会遭遇许多病害,对产量造成一定的损伤。由F.fujikuroi真菌造成的水稻恶苗病,可导致作物产量减少达40%以上,造成巨大的经济损失。因此,非常有必要对恶苗病做一个系统的的研究,为恶苗病抗性的分子遗传机制研究的突破和深入研究提供参考。另外,抗性基因的挖掘最终是为了育种利用,目前,稻瘟病、白叶枯病、纹枯病、恶苗病、稻曲病、褐飞虱和白背飞虱等病虫害对水稻造成很大的产量损失。选育具有多抗基因的新品系,对确保水稻的产量安全至关重要。本研究对不同水稻品种接种恶苗病前后的幼苗进行mRNA测序和蛋白质组相对定量分析,同时利用RIL永久群体进行恶苗病抗性的QTL定位研究,通过转录组与蛋白组定量联合分析,以及QTL定位的结果,鉴定差异表达基因、差异表达蛋白和恶苗病抗性相关QTLs,阐述恶苗病抗性的分子遗传机制,为恶苗病抗性基因的克隆和育种利用奠定基础。在抗性基因的育种利用方面,本研究通过分子标记辅助选择(MAS)技术聚合抗病和抗褐飞虱基因,选育新的恢复系,并评价新品系在两年不同气候条件下人工接种病虫后的抗性表现。研究结果有利于水稻的抗性育种。1、将1个中抗恶苗病的籼稻品种9311和1个感病的粳稻品种日本晴通过RNA-Seq测序进行表达谱分析。通过对照和处理的表达谱比较分析,9311品种共获得1,152个差异表达基因,日本晴则获得1,052个差异表达基因。进一步比较两个品种在转录组水平上的差异,发现两个品种存在不同的表达模式。通过GO注释和富集分析,虽然两个品种具有一样的与防御相关的GO条目,但有部分防御相关的GO条目在9311品种中特异性富集。对防御相关的差异表达基因的具体分析发现,部分WRKYs,WAK和MAP3Ks与9311品种的恶苗病抗性有关。OsWAK112d在9311品种中上调。在日本晴品种中,与抗非生物逆境胁迫有关的POEI基因上调表达。进一步分析了各染色体上差异表达基因占总转录本的比例,并结合已有文献关于恶苗病抗性相关QTL定位的结果,我们推测,9311品种感染恶苗病后,第1染色体上的与防御相关的WRKY和MARK基因被调控,这些基因可能发挥着重要作用。但还需对这些基因进一步的鉴定和功能验证,可为水稻抗恶苗病分子育种奠定基础。2、在转录组学研究的基础上,以抗病的9311品种接种恶苗病菌,利用TMT技术,研究其蛋白质组水平的变化。结果表明,鉴定到的蛋白数量为8694个,其中差异表达蛋白有116个,包括89个上调的和27个下调的差异表达蛋白；这说明当水稻面临病害等逆境时,往往需要通过调控更多蛋白的上调表达,来抵御病菌的侵入。差异表达蛋白的PATHWAY富集分析表明,富集程度最高的主要包括苯丙氨酸代谢,氮素代谢,苯丙素的生物合成,二萜类化合物的生物合成,花生四烯酸代谢和钙信号通路等。这些代谢通路直接或间接参与水稻对恶苗病菌的抗病反应。9311的蛋白组和转录组的关联性分析发现,蛋白质组水平上116个差异表达蛋白对应的基因与转录组水平发现的1152个差异表达基因之间共有22个基因关联,这些关联基因在转录组和蛋白质组水平的调控方向基本一致。GO注释和富集结果表明,这些关联基因主要在离子结合、囊泡和催化等方面发挥作用。研究结果为后续确定深入研究的代谢通路以及关键蛋白的鉴定提供依据。3、利用1个籼籼交重组自交系(RILs, Recombinant Inbred Lines)培矮64S/9311群体的132个株系,以及1个籼粳交重组自交系日本晴/9311群体的159个株系,进行恶苗病抗性的QTL定位,其中培矮64S/9311群体在接种恶苗病菌后分别对其徒长和苗重性状进行了分析和QTL定位,日本晴/9311群体群体调查了接种恶苗病菌后的徒长性状并进行QTL定位分析。根据两个RIL群体接种恶苗病菌后徒长和苗重变化的性状,以及定位群体已有的分子遗传图谱,共检测到7个QTL,能解释表型抗性变异的11.0%-22.3%。其中,以徒长为恶苗病菌处理后调查的性状,共检测到4个QTL(qBE1.1, qBE9, qBE1.2和qBE3),它们分布于第1、3、9染色体；以苗重为调查性状,共检测到3个QTL (qBWl, qBW3和qBW6),它们分布于第1、3、6染色体。徒长和苗重两个性状表现为极显着正相关。而且,QTL物理区间的比较发现,培矮64S/9311群体苗重性状相关的QTL和日本晴/9311的徒长性状相关的QTL的物理区间较接近,即,qBWl和qBE1.2、 qBW3和qBE3之间的物理区间有重迭。进一步查询表达谱分析获得的关键基因的物理距离,并与已报道的恶苗病抗性QTL以及本研究获得的QTL位点比较,发现恶苗病抗性相关的QTL或基因,基本上都分布在第1和3染色体上。4、通过杂交、回交,结合分子标记辅助选择技术,以及基于农艺性状的背景选择育种技术,获得10个具有抗稻瘟病、白叶枯病和／或褐飞虱基因的新品系。10个新品系中只有HR13具有3个病虫害的抗性基因。通过分子标记辅助选择技术,HR39, HR41,HR42和HR43这4个新品系聚合了稻瘟病和白叶枯病抗性基因,未对褐飞虱抗性基因进行检测和聚合,但也表现为叁抗,即抗稻瘟病、白叶枯病和褐飞虱。这可能和它们的供体亲本中组14抗褐飞虱有关。聚合了Pi1和Pi2基因的新品系与具有单一抗性基因Pita的新品系在2013年的抗稻瘟病水平相当；但是,在2012年,该年田间小气候表现为稻瘟病易发气候,聚合了Pi1和Pi2基因的新品系比具有单一基因Pita的新品系抗性更好,可能Pita基因易受环境影响。
参考文献：
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[9]. 水稻对稻瘟菌侵染胁迫应答机制的定量蛋白质组学研究[D]. 崔书建. 扬州大学. 2015
[10]. 水稻恶苗病抗性相关基因的鉴定及多抗基因的聚合育种利用[D]. 季芝娟. 沈阳农业大学. 2016