霍娟[1]2004年在《杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究》文中认为内生真菌普遍存在于植物体中，其重要性正日益受到关注，不同植物体内的内生真菌种类与数量也不相同，自然界中存在大量的内生真菌资源有待开发。本研究选取杜仲Eucommia ulmoides Oliv．为研究材料，进行其内生真菌资源的研究工作。结果从不同地区杜仲组织中共分离到254株内生真菌菌株，分属于蜜孢霉 Sphacelia、刺孢壳 Chaetomella、交链孢 Alternaria、壳明单隔孢属 Diplodina、刺盘孢 Colletotrichum、匐柄霉 Stemphylium、头孢霉 Cephalosporium、球座菌 Guignardia和青霉菌 Penicillium等真菌属中。从两个采集地点来看，南京地区内生真菌类群比西安地区类群较丰富、优势种群分离率较高；从植株部位上看，叶片组织内生真菌类群较枝条和树皮丰富，且分离率高；此外，一些菌株还表现出一定的组织特异性。在所研究的杜仲内生真菌类群中，刺孢壳比较普遍存在，且分离率较高，属优势种群之一。生物活性研究表明：刺孢壳 Chaetomella菌株Z18的发酵代谢产物具有较广谱的抗菌作用和较高的抗氧化活性，TLC与HPLC检测显示它的抗氧化活性成分中可能含有与芦丁相同或相似的黄酮类化合物。刺孢壳 Chaetomella活性菌株Z18在不同的固体和液体培养时，不同碳源、氮源、培养温度、pH值、装液量以及生长因子等条件对其生长有不同的影响。在马铃薯葡萄糖培养基和马丁氏培养基中生长较好；比较适宜的碳氮比、培养温度、pH值、装液量和转速分别为10：1，25℃，pH 6，150mL／250mL和200rpm；VB_1、VB_6和叶酸等维生素以及Ca~(2+)、Fe~(2+)、Mg~(2+)等无机离子均能不同程度地对其产生促生长作用。利用随机引物扩增多态性(RAPD)分析优势的刺孢壳 Chaetomella种群表明，其DNA多态性与宿主来源和分离部位存在一定相关性，同一地区的菌株之间亲缘关系较近，分离自同一部位的菌株之间亲缘关系也比较近。菌株表现出一定的地理分化和宿主组织分化。
张弘弛[2]2012年在《两种药用植物内生真菌次生代谢产物及其生物活性的研究》文中研究指明植物内生真菌是具有高度多样性的微生物资源，代谢产物多种多样，目前被认为是抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、杀虫等天然活性物质的重要资源。为了寻找更多的生物活性物质，本论文采用活性追踪的方法，研究了4株来源于药用植物的内生真菌的活性代谢产物。内容包括：药用植物（杜仲和无花果）内生真菌的分离的初步鉴定；抗菌活性菌株的分级组合筛选；活性菌株的鉴定和发酵条件考察；活性成分的追踪分离；单体化合物的结构解析；单体化合物生物活性的初步评价。概括如下:（1）以杜仲和无花果为研究对象，共获得了119株内生真菌。从杜仲根、茎、叶中分离得到62株内生真菌，初步形态学鉴定，这些内生真菌分属于7目，9科，15属，其中曲霉属Aspergillus sp.，镰孢霉属Fusrium sp.，链格孢属Alternaria sp.是杜仲内生真菌的优势种群。从无花果根、茎、叶中分离得到57株内生真菌，初步形态学鉴定，分属于7目，10科，21属。其中镰孢霉属Fusrium sp.，青霉属Penicillium sp.，曲霉属Aspergillus sp.是无花果内生真菌的优势种属。不同部位分离内生真菌的数量、种类和分布不尽相同，这就表明这两种药用植物的不同部位内生真菌的数量、分布和种群存在差异。（2）采用抗菌活性筛选为主、代谢产物化学成分筛选为辅的二级组合筛选模式，得到如下结果：抗菌活性初筛确定活性菌株共有20株（杜仲内生真菌11株，无花果内生真菌9株），筛选率为16.8%；抗菌活性复筛筛选到12株高抗菌活性的内生真菌，筛选率为10.1%；结合化学成分复筛最后确定了ER12、EL09、FR02、FL10这4株具有高抗菌活性，并且代谢产物种类丰富的内生真菌作为本论文的研究对象。（3）根据菌株的形态、培养特征、18S rDNA以及ITS序列分析结果，对活性菌株ER12、EL09、FR02和FL10进行菌种鉴定，分别鉴定为刀孢蜡蚧菌、黑曲霉、溜曲霉以及叁线镰孢。以菌丝体生物量、发酵产物重量、抗菌活性、薄层色谱分析以及高效液相色谱分析为评价依据，对4株活性内生真菌进行了发酵产物稳定性试验，培养基选择试验，发酵时间试验，萃取实验，确定了4株活性内生真菌的扩大培养条件以及提取条件。（4）经过扩大培养，采用常规的硅胶柱层析、反相硅胶柱层析，凝胶Sephadex LH-20柱层析、制备薄层层析以及重结晶等分离手段，从4株活性内生真菌分离到90个单体化合物。利用各种现代波谱技术（EI-MS、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC等）并结合化学方法鉴定了这90个化合物的结构，其中新化合物3个，分别是malformin E（19）、cyclo-(N-methyl-Trp-Leu)（62）和helovlic acid ester（83）。从ER12中分离到34个化合物，其代谢产物的结构类型是12个环二肽类化合物（3-10，13-16），1个新的环五肽化合物（19），4个fumiquinazoline生物碱类化合物（17，18，22，23），2个二苯酮类化合物（20，21），1个咪唑类化合物（12），2个甾体化合物（1，2），8个苯的衍生物（11，24-28，31，32）及4个核酸苷（29，30，33，34）。从EL09中分离到18个化合物，其代谢产物的结构类型是9个甾体类化合物（38-44,1,2），3个脂肪酸（35-37），2个呋喃类化合物（45，46），2个多羟基醇化合物（47，48）及2个吲哚类化合物（49，50）。从FR02中分离到22个化合物，其代谢产物的结构类型是13个吲哚二酮哌嗪类化合物（53-65，其中62为新化合物，65为新天然产物），2个萜类化合物（51，52），2个甾体化合物（1，39），2个多元羧酸（67，68）和1个多元醇（66）。从FL10中分离到33个化合物，其代谢产物的结构类型是7个gliotoxin类化合物（74-80），3个烟曲霉酸的衍生物（81-83），3个环二肽化合物（13，14，84），5个脂肪酸（69-71，36，37），4个甾体化合物（1，39，72，73），3个苯的衍生物（87-89），4个碱基或核酸苷（29，30，85，86）及4个多元羧酸或多元醇（47，48，68，90）。（5）采用MIC法，以11种指示菌（4个细菌和7个植物病原真菌）为模型，对4株活性内生真菌产生的90个单体化合物进行抑菌活性评价，结果表明有26个化合物对指示菌显示了较强的抑制作用。新化合物19（malformin E）和83（helovlic acid ester）对多种指示菌表现了很强的抗菌作用。综合分析抗菌活性测试的结果，明确了4株活性内生真菌生物活性物质的类别，ER12Lecanicillium psalliotae的活性物质主要是fumiquinazoline类生物碱和环肽类化合物；EL09Aspergillus niger的活性物质主要是甾醇类和呋喃类化合物；FR02Aspergillus tamarii的活性物质主要是吲哚二酮哌嗪生物碱类化合物；FL10Fusarium tricinctumi的活性物质主要是gliotoxin类生物碱和烟曲霉酸类化合物。采用MTT法，以3个肿瘤细胞株（MCF-7人乳腺癌细胞、HepG2人肝癌细胞、A549人肺癌细胞）为模型，对分离得到的新化合物和生物碱类代谢产物的抗肿瘤活性进行了初步评价，结果表明这些化合物对不同肿瘤细胞系表现出不同程度的增殖抑制活性。其中新化合物malformin E（19）MCF-7和HepG2系表现出很好的细胞毒活性，IC50分别是0.65和2.42μM；fumiquinazoline C（18）和fumiquinazoline J（23）对HepG2和A549肿瘤细胞的增殖有抑制作用，verruculogen（56）对HepG2和A549肿瘤细胞表现出很强的细胞毒性，IC50分别是1.95和2.56μM。总之，本文经过筛选获得4株活性内生真菌，通过分离鉴定阐明了4株内生真菌中90个化合物的结构，其中包括3个新化合物。评价了这些单体化合物的抗菌活性和抗肿瘤活性，发现了26个单体化合物具有较强抗菌活性和4个单体化合物具有较强抗肿瘤活性。上述研究结果证明植物内生真菌作为植物生态一个重要的组成部分，是新结构和新活性物质的主要来源，是寻找药物先导化合物的重要资源。
姜交龙[3]2013年在《杜仲内生真菌的分离及其代谢产物抑菌性质研究》文中认为内生真菌（Endophytic fungi）通常是指生长在健康植物体的根、茎及叶等组织中的细胞间隙或者细胞内一类对植物体没有明显病害的真菌，是植物微生态系统的重要组成部分。近年来研究表明，从药用植物中分离出的内生真菌能够产生和宿主植株相同或者相似的生物活性物质。内生真菌活性代谢产物为新的活性物质开发提供了宝贵的资源，具有非常广泛的应用前景。本课题从传统药用植物杜仲（Eucommia ulmoides）中分离出75株内生真菌并对其代谢产物抑菌活性进行研究。采用组织分离法，对产于江苏盐城的杜仲各组织内生真菌进行分离，共得到75株内生真菌，其中来自叶22株，茎19株，根34株，分离率分别为16.34%、21.33%和36.27%。杜仲各组织内生真菌的分布有所区别，根部组织分离得到内生真菌的内生真菌最多，这可能与根部组织的生长环境有关。对75株杜仲内生真菌代谢产物的抑菌活性进行研究，发现杜仲内生真菌的代谢产物普遍具有抑菌活性。其中，30.67%的内生真菌对E. coli有强的抑菌活性，21.34%内生真菌对B. subtilis有强的抑菌活性，17.33%的内生真菌对S. aureus有强的抑菌活性，12%的内生真菌对Sh. dysenteriae有强的抑菌活性，16%的内生真菌对S. typhimurium有强的抑菌活性。内生真菌Y18代谢产物对各类指示细菌表现出较强的抑菌活性。经形态学观察和ITS鉴定分析，内生真菌Y18为一株木贼镰孢菌（Fusarium equiseti）。对内生真菌Y18的生物学特性研究表明，内生真菌Y18生长的最适温度为30oC，最适pH为7.0，最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为牛肉膏，光照作用对内生真菌Y18的生长情况影响不大。通过流式细胞仪和电导率仪检测发现经内生真菌Y18代谢产物处理后E. coli和S. aureus细胞膜均受到不同程度的破坏。处理4h后，E. coli菌液相对电导率为16.22%，PI阳性细胞的比例达到25.31%。同样，S. aureus菌液相对电导率为14.5%，PI阳性细胞的比例达到19.64%。这些都表明经过内生真菌Y18代谢产物处理后，细菌细胞膜结构受到了破坏，细胞膜选择透过性的功能受到了影响，从而影响了细菌细胞正常的生物活性。采用FT-IR光谱进一步研究处理前后细菌细胞生理活性的变化。通过对细菌全细胞红外吸收图谱进行二阶导数处理分析，发现经过内生真菌Y18代谢产物处理后细菌的细胞膜、蛋白质和核酸的特征吸收峰发生了明显的变化。E. coli全细胞蛋白结构变化主要体现在β折叠增加，α螺旋、无规卷曲、β转角结构均有降低。β折叠由处理前的34.60%增加到41.47%，无规卷曲下降最为明显，由21.80%下降到18.67%。核酸物质结构也发生了明显变化；S. aureus全细胞蛋白结构变化主要是β折叠和无规卷曲结构含量增加，β折叠由处理前的30.37%增加到34.97%，无规卷曲由处理前的23.59%增加到27.48%。β转角和α螺旋结构含量降低，其中，β转角含量由处理前的18.58%降低到16.22%，α螺旋结构含量降低最明显，由处理前的27.46%降低到21.33%。通过圆二色谱检测进一步分析发现，经过Y18内生真菌代谢产物处理后，细菌基因组DNA碱基的堆积作用减弱，结构变得更松散。对内生真菌Y18的代谢产物基本组成成分进行分析，结果显示水相中存在肽类、生物碱、皂苷、黄酮以及有机酸等物质，未检测到酚类和萜类物质，而其乙酸乙酯相中主要存在生物碱类和黄酮类物质，具体是何种物质还需要进一步研究。
沈书庆[4]2008年在《濒危药用植物杜仲产活性成分内生真菌的研究》文中研究表明选用珍稀药用植物杜仲,采用常规的真菌分离方法,从中分离出了44株内生真菌,并以此为对象进行了以下研究工作。根据黄酮类和环烯醚萜类化合物所具有的颜色反应,初步筛选出可能生产黄酮类化合物的菌株3株——DZ2、DZY5、DZ11。进一步通过紫外-可见光光谱扫描,并检测其产物稳定性,最终确定菌株DZ11可能产黄酮类化合物——槲皮素,并且产量相对稳定,故作为下一步的实验菌株。绘制DZ11菌株的生长曲线和槲皮素产量的变化曲线,通过紫外分光光度法和TLC法测定槲皮素的最高产量,分别为0.418mg/L和0.340mg/L。利用HPLC法分析发现DZ11菌株所产槲皮素在发酵液和菌丝体内都存在,但菌丝体内含量相对较少。通过常规湿法装柱,对DZ11菌株发酵液进行柱层析分离,得到6种不同Rf值的成分,其中第5部分有着与槲皮素标准品相同的紫外-可见光光谱。经再次纯化,通过质谱检测其[M+H]~+的m/z为303.38,与槲皮素的分子量302.23正好相符。再对照样品和槲皮素标准品的红外吸收图谱,发现它们的红外光谱图几乎相同,也就是说明它们含有相同的结构基团或化学键。由此确定DZ11菌株所产的活性物质中含有槲皮素。通过对不同固体培养基中菌落的生长速率和长势分析,发现在豆芽汁培养基上不但菌丝生长较快而且菌丝较为浓密。通过对不同液体培养基中DZ11的生物量和槲皮素产生量的对比,筛选出适合DZ11菌丝生长及产物槲皮素合成的豆芽汁液体培养基。在基本液体培养基的基础上,通过单因素分析实验,确定实验室发酵DZ11菌株的最佳碳源、氮源、PH值和温度分别是蔗糖、脲、7.0和28℃。通过正交试验,得出适合菌丝生长的培养基为:把豆芽汁液体培养基中的蔗糖量改为25g.L~(-1),添加脲2g.L~(-1),装量为120ml/300ml;适合槲皮素积累的培养基的为:把豆芽汁液体培养基的蔗糖量改为30g.L~(-1),添加脲2.5g.L~(-1),装量为100ml/300ml。根据DZ11菌株的显微结构特征,对DZ11菌株进行了分类,初步确定为:真菌门,半知菌类,腔孢纲,球壳孢目,球壳孢科中的刺茎点菌属。
孙奎[5]2004年在《杜仲和无花果内生真菌的初步研究》文中进行了进一步梳理植物内生真菌是在植物寄主中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类真菌。它是一个庞大的特殊的真菌类群，几乎所有的植物组织中，都发现有内生真菌的存在。 本文以杜仲和无花果两种药用植物为研究对象，从这两种植物的不同部位分别分离出80株和87株内生真菌。经初步鉴定杜仲内生真菌菌株归类为链格孢属(Alterna，．ia sp．)、镰孢霉属(Fusrium sp．)、茎点菌属(Phoma sp．)、腐霉属(Pythium sp．)、葡萄孢属(Botrytis sp．)粉孢霉属(Oidium sp．)、丝核菌属(Rhizoctonia sp．)、拟青霉属(Penicilliopsis sp．)、卵形孢霉属(Oospora sp．)、瘤座霉属(Tubercularia sp．)、尾孢霉属(Cercospora sp．)、疫霉属(PhytophthD朋sp．)、球黑粉菌属(Tolyposporium sp．)和实球黑粉菌属(Doassnia sp．)等14个属；无花果内生真菌菌株归类为链格孢属(Alternaria sp．)、镰孢霉属(Fusrium sp．)、鲜壳孢属(Zythia sp．)、 聚端孢霉属(Trichothecium sp．)、瘤座霉属(Tubercularia sp．)、葡萄孢属(Botrytis sp．)、瓶梗 青霉属(Paecilomyces sp．)、拟青霉属(Penicilliopsis sp．)、赤座梭孢属(AschPrsonia sp．)、丛 赤壳属(Nectria sp．)、粉孢霉属(Oidium sp．)、曲霉属(Aspergillus sp．)、青霉属(Pe刀fc，盯f甜脚 sp．)和拟粉孢霉属(Oidiopshs sp．)等14属。在杜仲和无花果中链格孢属(Alteraria sp．)和 镰孢霉属(Fusrium sp．)分离的数量都占有优势，是整个杜仲和无花果植物内生真菌的优势种 类；不同部位分离内生真菌的数量、种类和分布不尽相同，这就表明杜仲和无花果的不同部 位内生真菌的数量、分布和种群存在差异。 以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌为指示菌种，对杜仲和无花果的部分内生真菌及其发酵代谢产物进行活性筛选，结果表明杜仲和无花果内生真菌中存在着广泛的生物活性物质。通过对杜仲内生真菌的活性筛选，初步筛选出7株代谢产物乙酸乙酯相有较好活性的菌株，经初步鉴定为链格孢属、粉孢霉属、葡萄孢属、瘤座霉属和茎点菌属等5个属；筛选出5株代谢产物丙酮相有较好活性的菌株，经初步鉴定为腐霉属、链格孢属和镰孢霉属等3个属。通过对无花果内生真菌的活性筛选，初步筛选出6株乙酸乙酯相有较好活性的菌株，经初步鉴定为拟粉孢霉属、链格孢属、赤座梭孢属、鲜壳孢属、拟青霉属和聚端孢霉属等6个属；筛选出6株丙酮相有较好活性的菌株，经初步鉴定为链格孢属、拟粉孢霉属、聚端孢霉属和拟青霉属等4个属。 从杜仲根部选一株活性较强的菌株进行液体发酵培养，从其发酵代谢产物中分离得到1个化合物，结构未鉴定。
易晓华[6]2008年在《除虫菊内生真菌分离、鉴定及其代谢产物抑菌活性研究》文中提出近年来,内生真菌已成为寻找具有生物活性成分的另一重要来源。内生真菌以其丰富的生物多样性和次生代谢物多样性以及在宿主植物-食草动物-环境生态系统中扮演的重要角色而引起众多研究者的兴趣,并已成为当今农业和医药卫生领域新的研究热点。除虫菊(Pyrethrum cinerariifolium Trev.)是世界上着名的杀虫植物,其中主要杀虫活性物质除虫菊素还具有一定的杀菌作用,特别是对真菌的效果明显。植物内生真菌对植物某些药效成分的形成有重要影响。研究表明,内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物,且真菌易于培养,可通过育种手段和控制发酵条件等措施来大幅提高其药用成分的含量。因此,利用植物内生真菌发酵生产生物源农药是突破某些植物资源生长周期长、不可再生等限制因素的一条新途径。而到目前为止,有关除虫菊内生真菌的研究还鲜有报道。本研究以除虫菊植物为材料,从其根、茎、叶和花四部分组织中共分离得到128株内生真菌,并对所分离的内生真菌进行了形态学鉴定和抑菌活性筛选,对其中活性较高的Y1和Y2菌株从其生物学特性、代谢产物的抑菌活性、抑菌活性成分的分离与鉴定等方面进行了较为系统的研究,得出以下主要研究结果及结论:1.较为系统地研究了除虫菊内生真菌的分布特点。发现除虫菊内生真菌具有较丰富的物种多样性,从除虫菊根、茎、叶、花等组织中共获得内生真菌128株,经形态观察,鉴定出其中的117株,分属于2个亚门、3个纲、7个目、7个科、12个属,分别为镰孢菌属Fusarium、链格孢属Alternaria、腐殖霉属Humicola、内多隔孢属Endophragmiella、黑孢霉属Nigrospora、色串孢属Torula、阜孢霉属Papularia、丝核菌属Rhizoctonia、茎点霉属Phoma、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis、毛集座霉属Setodochium和毛壳菌属Chaetomium。117株内生真菌从纲的分类水平上以丝孢纲(Hyphomycetes)为优势类群,占60.9 %,腔孢纲(Coelomycetes)次之,占21.1 %;从目的分类水平上以从梗孢目(Hyphomycetales)和瘤座孢目(Tuberculariales)为优势类群,分别总菌株数的26.6 %和20.3 %;在属的分类水平上以镰孢菌属、腐殖霉属和链格孢属为优势属,分别占总菌株数的20.3 %,13.3 %和13.3 %。这些真菌除了毛壳菌属于子囊菌纲以外,多数属于半知菌亚门真菌。除虫菊内生真菌主要存在于植株的叶和根中,茎部组织中分离到的内生真菌相对较少。镰孢菌属(Fusarium)和腐殖霉属(Humicola)分别是根部和叶部的优势类群。2.采用抑制菌丝生长速率法测定了128株内生真菌发酵滤液对番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、苹果炭疽病菌等6种植物病原真菌的抑制作用,结果表明,在离体条件下,活性菌株(对至少一种供试病原真菌菌丝生长抑制率达到75 %以上的菌株)有56株;其中Y1、Y2菌株发酵液的抑菌活性较好,其稀释10倍的发酵液对6种病原菌菌丝生长的抑制率均较高。上述56株内生真菌菌丝丙酮提取物对6种病原真菌的离体生测结果表明, Y1、Y2、H2叁株菌株的菌丝丙酮提取物对6种病原菌均有较好的抑制作用。Y1、Y2菌株发酵滤液5倍稀释液对番茄灰霉病菌和苹果炭疽病菌孢子萌发的抑制作用均在80 %以上;盆栽试验结果表明,Y1、Y2、Y7、H2四株菌株对番茄灰霉病、辣椒疫霉病、黄瓜霜霉病的室内防效在50 %以上,值得进一步深入研究。3.根据真菌的形态学鉴定方法,对比相关分类系统,并结合分子生物学方法将Y1菌株鉴定为小孢拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis microspora),将Y2菌株鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),其5.8s rDNA序列在Gene Bank上的登录号分别为EU638329和EU152473。4.初步明确了Y1和Y2菌株的生物学特性。试验结果表明,内生真菌Y1、Y2菌株的培养特性不同,环境和营养因子对该菌的生长繁殖和抑菌活性影响较大。对于Y1菌株:(1)在10～35℃时,菌丝能生长并形成孢子,较适生长繁殖温度为30℃,孢子的致死温度为65℃;(2)在pH 6.5～8.0时,菌丝生长、孢子形成和萌发均良好,较适培养pH值为7.5;(3)能直接利用玉米粉和糊精;(4)氮源以有机态氮为佳,硝态氮对其生长繁殖有抑制作用;(5) Y1菌株以黑暗培养为佳。Y2菌株菌丝生长在20～30℃时较为适宜,最适温度为25℃;分生孢子在4℃～40℃之间均能萌发,且30℃时萌发率最高; 30℃时产孢量最高;60℃处理10 min能完全杀死菌丝体和孢子。Y2菌株对pH值的适应范围很宽,其菌丝在pH 4.0～9.5时均能生长;pH5.5时相对产孢量达到最大;其孢子萌发率在pH5.0最大。之后,随着pH的增加,孢子萌发率逐渐下降。Y2菌株以光照/黑暗交替培养为佳。Y2菌株可以利用多种碳源和氮源生长并产孢,营养来源广泛。但就其产孢情况而言,有机氮源要优于无机氮源,由于供试无机氮源种类较少,此现象是否具有普遍性还要更深入研究。5.初步研究了Y1、Y2菌株的发酵条件,明确了较佳培养基组成及培养条件。响应面分析方法试验结果表明,Y1菌株较佳培养条件为:以每升培养基中含有D-木糖19.86 g,蛋白胨2.91 g,MgSO4·7H2O 0.305 g,FeSO4 0.0061 g, K2HPO4 1.219 g,KCl 0.610 g为宜,摇瓶发酵较佳条件为:初始pH 7.64,装液量68.81 mL·250 mL~(-1),摇床转速220 r·min~(-1),培养温度26.7℃,接种量9.95 %。优化条件下菌丝体生长量和对番茄灰霉病菌菌丝生长抑菌作用分别达到446.5 mg·100mL~(-1)和95.8 %,较原始培养条件分别增加了约6.99 %和2.46%。Y2菌株较佳培养条件为:以每升培养基中含有麦芽糖10 g、蛋白胨6 g、K2HPO4 2 g、KCl 1 g、FeSO4 0.02 g、MgSO4?7H2O 1 g为宜;摇瓶发酵较佳条件为:初始pH 7.0,装液量100 mL·250 mL~(-1),摇床转速180 r·min~(-1),培养温度28.0℃,接种量21 %。与初始条件相比,优化条件下菌丝生长量和对番茄灰霉病菌菌丝生长抑制作用分别提高了8.5 %和4.7 %。本研究结果为两株内生真菌的进一步研究提供了有意义的基础参数。6.以番茄灰霉病菌为示踪生物,对Y1和Y2菌株的次生代谢产物进行了抑菌活性成分的分离,共分离得到13个化合物,其中P2为新化合物。从Y1菌株中新分离出6个化合物,其中2个化合物结构已确定,为3-亚甲基O-β-D-吡喃葡萄糖基-1,2-二酚(P2)和半乳糖醇(dulcitol,P3),1个化合物结构初步确定,为4,4'-N,N-二苯甲酸丙二醇酯(P1),其余3个化合物的结构待鉴定。生测结果表明,在0.25 mg·mL~(-1)供试浓度下,P1和P3对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制率在50 %以上;从Y2菌株中新分离出7个化合物,其中2个结构已确定,分别二十二烷(docosane,F1)和半乳糖醇(dulcitol,F5),2个化合物结构初步确定,分别为4-甲基苯腈(4-methoxybenzonitrile,F3),正十叁烷酸乙二醇单酯(2-hydroxyethyl tridecanoate,F2);其余3个化合物结构待鉴定。生测结果表明,在1 mg·mL~(-1)供试浓度下,F2、F3、F4对番茄灰霉病均具有一定的保护作用,7 d室内药效分别达到60 %以上。对Y1、Y2菌株代谢产物中抑菌活性成分的分离与鉴定尚待进一步完成。
朱红薇[7]2005年在《杜仲内生真菌活性物质的研究》文中研究指明杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)单科、单属、单种,是我国特有的经济树种。杜仲作为国家二类保护植物,在现有资源被充分利用的基础上,也需要得到应有的保护。本研究小组成员从内生真菌的角度出发,希望在既不破坏现有的杜仲资源的基础上,还能开发出有益于医药事业的天然活性物质,对杜仲进行内生真菌的分离、鉴定,活性筛选,活性成分提取分离,活性化合物抑菌活性测定。结果如下: 1、首次采用组织分离法从杜仲的根、茎、叶中分离到80 株内生真菌。根据菌株形态及显微结构特征鉴定其中72 株,分属13 个属。其中链格孢属(Alternaria sp.)、镰孢霉属(Fusarium sp.)、茎点菌属(Phoma sp.)共38 株,为杜仲内生真菌的优势种群,共占已鉴定总株数的52.78%。根部分离得到菌株33 株最多,占已鉴定总株数的45.83%。分属9 个属。 2、以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)为测试菌种,对初选的20 株杜仲内生真菌进行活菌及代谢产物活性筛选。确定DL04(链格孢属)、DR0(1茎点霉属)和DR0(2拟青霉属(Paecilomyces sp.))为活性筛选实验的目的菌种。3、对具活性的菌株DL04 进行液体发酵。提取其代谢产物粗品(25.0g)。运用硅胶柱层析、C18 柱层析、sephdexLH-20 柱层析、薄层制备层析及重结晶等各种分离纯化手段,得到四个化合物,通过波谱分析、化学分析手段鉴定为3β-羟基-5α,8α-表二氧-6,22-二烯麦角甾烷(Ⅰ)、一个甾体类化合物(Ⅱ)、一个脂肪族化合物(Ⅲ)和糖苷(Ⅳ)类化合物。其中化合物Ⅰ为首次在杜仲内生菌DL04 中分离得到。4、定性、定量测出化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌的最小抑菌浓度,以及抑菌率。证明叁种化合物对测试菌均有不同程度的抑制作用,具有进一步研究的价值。
龙健[8]2015年在《利用杜仲内生真菌防治小麦病害的研究》文中进行了进一步梳理本研究以农作物的重要病害为靶标,通过对药用植物杜仲拮抗内生真菌资源的筛选、鉴定和系统发育分析,阐明药用植物杜仲中拮抗内生真菌的种群组成特征;通过分析拮抗真菌在小麦根际的生长对小麦根际及体内微生物菌群的影响;研究拮抗真菌对小麦病害防治效果及小麦植株抗病性的影响,为提高生防菌的植株定殖能力、稳定和提高防效奠定基础。本项研究将拓展人们对生防微生物功能多样性及其应用的新视角,对植物病害的生物防治意义重大。主要研究结果如下:1.较为系统地研究了杜仲内生真菌的分布特点。我们采取组织分离得方法从植物杜仲的叶、茎、果实、皮和根等5个部位中总共获得52株内生真菌,并以形态学和分子生物学为依据对所分离的52株内生真菌进行鉴定,最后鉴定出这52株内生真菌为8个属,分别为:黑孢菌属(Nigrospora)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、炭疽菌属(Colletotrichum)、肉座菌属(Hypocreales)、拟茎点霉属(Phomopsis)、梭孢壳属(Thielavia)、链格孢属(Alternaria)和漆斑菌属(Myrothecium)。且内生真菌在杜仲组织中的分布呈现出一定的组织专一性,其中,漆斑菌属(Myrothecium)在果实和根中存在,肉座菌属(Hypocreales)和链格孢属(Alternaria)只在果实中分离得到,而黑孢菌属(Nigrospora)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、拟茎点霉属(Phomopsis)、炭疽菌属(Colletotrichum)存在于杜仲的叶、茎、果实叁个部位中。2.根据平板对峙法和次生代谢生长速率法测定了52株内生真菌对这3种病原菌的抑制效果,这3种病原菌分别为:玉米茎基腐病菌(Fusarium graminearum)、小麦全蚀病菌(Gibberella zeae)和小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)。结果表明,在离体条件下,杜仲内生真菌对3种植物病原菌有不同程度的抑制作用。其中,DZJ14分别对小麦全蚀病菌和小麦纹枯病菌的抑菌效果较好。随后的活体试验结果显示,经接种至小麦根际土壤中的DZJ14处理的小麦样品,其苗期小麦纹枯病的发病率为16.88%,小麦全蚀病的发病率为8.7%,分别明显低于未经DZJ14处理的小麦纹枯病(69.81%)以及小麦全蚀病的发病率(50%),且对苗期小麦的生长具有明显的促生作用。3.利用稀释平板法检测了经拮抗菌株DZJ14处理的小麦植株根际土壤及其体内微生物(真菌、细菌)的变化情况,结果表明经拮抗菌株DZJ14处理的小麦植株根际土壤中真菌数量显着升高,细菌数量降低,小麦植株体内的真菌数量和对照相比数量显着升高,细菌数量降低。此外,通过对拮抗菌株DZJ14根际处理,调查了小麦不同生长时期的麦植株中所含的PPO、POD和PAL叁种防御酶活性进行了测定,结果表明,经菌株DZJ14定殖处理的盆栽小麦和大田小麦植株中所含的PPO、POD和PAL叁种防御酶的活性与对照组相比均显着升高。由此可知,外来菌株DZJ14接种至小麦根际土壤中,能明显提高小麦植株的诱导防御酶活性,在一定程度上增强了小麦对纹枯病和全蚀病的抗性。
姚振[9]2013年在《仙鹤草内生真菌活性菌株的分离筛选及其与宿主相互作用的研究》文中研究指明1.利用传统的分离方法从内蒙古产野生仙鹤草植株中分离获得17株内生真菌,从江西产仙鹤草中分离得到20株内生真菌,采用形态学鉴定,其主要归属于曲霉属、木霉属、毛霉属、镰孢霉属、酵母属。内蒙古及江西产仙鹤草内生菌株均以曲霉属为主,将其与本课题组前期从浙江产仙鹤草中分得的30株内生真菌进行比较,发现浙江产仙鹤草内生真菌以镰孢霉属主。浙江产仙鹤草生物多样性最显着。2.本文对内蒙古产及江西产仙鹤草内生真菌菌株进行了活性筛选,结果显示,其中6株内生真菌菌株发酵产物具有较强的抗氧化活性,25株内生真菌菌株发酵产物能抑制胃癌细胞SGC的增殖,10株内生真菌菌株发酵产物对结肠癌细胞LOVO的增殖有一定的抑制作用。将内生菌株接种至含仙鹤草多酚粗提物的培养基中,测定其对仙鹤草粗提物中多酚类物质的转化作用。结果表明,21株内生真菌菌株能提高培养基中多酚类物质的含量,其中菌株R3-1提高幅度最大。采用分子生物学技术,鉴定R3-1菌株为黄曲霉(Aspergillus flavus)。3.选取14株能提高多酚类物质含量的内生真菌菌株,采用人工接种的方法与仙鹤草组培苗进行共培养实验,筛选出1株能与组培苗共生且对组培苗的生长有促进作用的内生菌株(R2-2)。对该菌株进行分子生物学鉴定,确定为棘孢木霉Trichoderma spp.。将菌株R2-2接种至组培苗,在不同生长阶段测定组培苗次级代谢产物的含量。培养7周后,该菌株能使宿主多酚含量提高13.4%,黄酮类的含量提高1.9倍,其中芦丁含量提高67.7%,木犀草素含量提高71.3%。而其对宿主多糖类物质积累具有一定的抑制作用,对皂苷类物质积累影响不显着。4.选取4株能降低多酚类物质的内生菌株R2-2,R3,R3-2,S8,分别对宿主黄酮类成分芦丁、木犀草素、槲皮素进行体外生物转化,对转化后的产物采用HPLC测定,培养四周后,4株菌株对叁种黄酮类物质均有一定的转化作用。其中菌株S8对芦丁与槲皮素的转化率最高,分别为4.95%、16.4%。菌株R3对木犀草素的转化率最高为27.4%,菌株R2-2的生物转化作用不明显。
李爱华[10]2007年在《产PDG杜仲内生菌的分离、筛选及优化培养》文中研究表明杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.),单科、单属、单种,是我国特有的经济树种。杜仲作为国家二类保护植物,在现有资源被充分利用的基础上,也需要得到应有的保护。本论文从内生真菌的角度出发,希望在既不破坏现有的杜仲资源的基础上,还能开发出有益于医药事业的天然活性物质,对杜仲进行了内生菌的分离、鉴定,产松脂醇二葡萄糖苷菌株的筛选以及相关培养基的优化,结果如下:第一,对7年以上杜仲皮中的内生菌进行分离,得到122株内生菌;其中75株真菌,47株细菌;经摇瓶培养后分析各菌株产松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的能力,结果发现有8株菌能产生PDG,8株均为真菌;最高产量可达13.387mg/L。经初步鉴定,这8株菌分属于5属,即茎点菌属(Phloma.)、腐霉属(Pythium)、卵形孢霉属(Oospora)、球黑粉霉属(Tolyposporium)、砖红镰孢霉属(Lateritium)。第二,对已经筛选出的产PDG的8株菌进行了初步研究,获得了高产PDG的菌株,并对其培养基进行了优化,明确了该菌株的生长条件和PDG产生的优化培养基。第叁,采用Plackett-Burman设计(Plackett-Burman Design,PB)法,对影响供试菌株产松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的14个因素进行了筛选。结果表明:影响该菌发酵产生松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的主要培养基成分为麦芽糖、可溶性淀粉、NH_4Cl、NaNO_3、FeSO_4、KH_2PO_4。在此基础上,再采用响应曲面法(Response Surface Methodology,RSM)对其6个显着因子的最佳水平范围进行研究。通过对二次多项回归方程求解得知,在上述自变量分别为麦芽糖、可溶性淀粉、NH_4Cl、NaNO_3、FeSO_4、KH_2PO_4时,松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的产量从13.387mg/L提高到了29.386mg/L。
参考文献：
[1]. 杜仲内生真菌资源和活性菌株生物学的初步研究[D]. 霍娟. 南京师范大学. 2004
[2]. 两种药用植物内生真菌次生代谢产物及其生物活性的研究[D]. 张弘弛. 陕西科技大学. 2012
[3]. 杜仲内生真菌的分离及其代谢产物抑菌性质研究[D]. 姜交龙. 江南大学. 2013
[4]. 濒危药用植物杜仲产活性成分内生真菌的研究[D]. 沈书庆. 西北大学. 2008
[5]. 杜仲和无花果内生真菌的初步研究[D]. 孙奎. 西北农林科技大学. 2004
[6]. 除虫菊内生真菌分离、鉴定及其代谢产物抑菌活性研究[D]. 易晓华. 西北农林科技大学. 2008
[7]. 杜仲内生真菌活性物质的研究[D]. 朱红薇. 西北农林科技大学. 2005
[8]. 利用杜仲内生真菌防治小麦病害的研究[D]. 龙健. 安徽农业大学. 2015
[9]. 仙鹤草内生真菌活性菌株的分离筛选及其与宿主相互作用的研究[D]. 姚振. 浙江工业大学. 2013
[10]. 产PDG杜仲内生菌的分离、筛选及优化培养[D]. 李爱华. 西北农林科技大学. 2007