杨爱军[1]2016年在《NO/cGMP通路在小鼠囊胚孵化中的调控作用》文中指出第一部分:NO浓度对囊胚发育和孵化的影响目的:研究不同浓度的NO对囊胚发育和孵化率的影响。方法:(1)将获得的桑葚胚随机分为5组并在各组培养液中添加了不同浓度(0μM、125μM、250μM、500μM、5 m M)NOS的抑制剂(L-NAME),观察并统计各组囊胚发育及孵出率。(2)分别收集这5组的囊胚,用免疫荧光染色在蛋白水平上检测eNOS的表达及强度;并添加了不同浓度(0 n M、10 n M、100 n M、500 n M和2μM)SNP继续培养。收集囊胚并统计不同组囊胚的发育率和孵化率。(4)将获得的桑葚胚随机分为3组,在各组培养液中均添加5 m M L-NAME,另外在各组的培养液中添加不同浓度(10 n M、500 n M和2 u M)的SNP。结果:(1)125μM L-NAME对囊胚的发育和孵化率没有显着影响(P>0.05),但是随着L-NAME浓度的继续升高,囊胚的发育和孵化率显着减少(P<0.05),当L-NAME的浓度达到5 m M时则完全抑制了囊胚的孵化。(2)eNOS在囊胚细胞的细胞质中表达,随着L-NAME的浓度提高(0μM 125μM、250μM、500μM、5 m M),eNOS的表达逐渐降低,eNOS mRNA表达水平也随着L-NAME浓度的增加而呈现剂量依赖性降低。(3)10 n M SNP对囊胚的孵化率没有显着影响(P>0.05),100 n M、500 n M和2μM SNP显着降低了囊胚的孵化率,且随着培养液中SNP浓度的增加,囊胚的孵化率呈剂量依赖性地减少,SNP提升至2μM时则完全抑制了囊胚孵化。(4)适量NO底物SNP(10 n M)的添加可以逆转5 m M L-NAME对囊胚发育和孵化的抑制作用(P<0.05),但添加的SNP浓度过高则会降低囊胚的发育和孵化率(P<0.05)。结论:适量的NO浓度是保证囊胚孵出的必要条件,过低或者过高浓度的NO均会降低囊胚的孵化率。第二部分:NO/cGMP通路在囊胚孵化中的作用目的:研究NO是否通过cGMP信号转导途径调控囊胚孵化。方法:(1)对获得的桑葚胚随机分组,并在培养液中添加了不同浓度(0 n M、10 n M、100 n M、500 n M和2μM)的NO敏感的鸟苷酸环化酶的抑制剂(8-Br-cGMP),观察并统计各组囊胚发育及孵出率。(2)在囊胚的体外培养液中联合添加不同浓度(0 n M、10 n M、100 n M、500 n M和2μM)的8-Br-cGMP与5 m M L-NAME,观察并统计各组囊胚发育及孵出率。(3)收集各组的囊胚,用实时荧光定量PCR(SYBR Green法)在mRNA水平上检测各组组织蛋白酶cathepsin L和cathepsin P的表达情况。结果:(1)与对照组相比,10 n M、100 n M、500 n M和2μM 8-Br-cGMP显着降低囊胚孵化率(P<0.05),且随着8-Br-cGMP剂量浓度的增加,囊胚的孵化率显着减少,2μM 8-Br-cGMP完全抑制了囊胚的孵化。(2)10 n M和500 n M 8-Br-cGMP的添加显着促进了囊胚的孵化,部分逆转了5 m M L-NAME对囊胚孵化的抑制作用(P<0.05),但在2μM 8-Br-cGMP与5 m M L-NAME的联合添加组没有发现囊胚孵化现象。(3)L-NAME降低cathepsin L和cathepsin P mRNA的表达水平,最终导致囊胚孵化率的降低。结论:(1)NO是通过NO/cGMP信号转导途径来调控囊胚孵化的。(2)L-NAME降低cathepsin L和cathepsin P mRNA的表达水平,最终导致囊胚孵化率的降低。第叁部分:NO对囊胚细胞凋亡的影响目的:研究NO对囊胚细胞凋亡的影响。方法:(1)本实验将5 m M L-NAME、2μM 8-Br-cGMP、10 nm SNP、500 nm SNP、2μM SNP单独添加并应用免疫荧光技术检测不同组囊胚细胞中活性caspase 3的表达水平,分析不同添加物对囊胚细胞凋亡的影响。(2)为进一步研究NO产生量对D5囊胚细胞凋亡的影响,本实验将5 m M L-NAME、2μM 8-Br-cGMP、10 nm SNP、500 nm SNP、2μM SNP单独添加并应用5μg/ml的碘化丙啶(PI)染坏死囊胚细胞,统计囊胚细胞活力并应用流式细胞术检测分析不同添加物对囊胚细胞凋亡的影响。结果:与对照组比较,5 m M L-NAME、2μM 8-Br-cGMP和10 nm SNP对囊胚细胞中caspase 3水平没有显着影响,而500 nm SNP和2μM SNP显着提高了囊胚细胞中caspase 3的水平(P<0.05),且呈剂量依赖性,随着SNP浓度的增加,caspase 3表达显着增强,促进了囊胚细胞的凋亡。(2)流式细胞仪结果显示,对照组细胞分布与5m M L-NAME,2u M cGMP,和10n M SNP组没有显着区别,但是500n M SNP和2u M SNP组,明显出现坏死细胞群。低浓度SNP的对囊胚孵化率的作用依赖于cGMP分子;(4)L-NAME,低浓度的SNP和8-Br-cGMP对囊胚细胞中活化型caspase 3的表达没有显着影响,而高浓度的SNP显着提高了囊胚细胞中活化型caspase 3的表达,促进了囊胚细胞凋亡。结论:过量NO引起的囊胚细胞凋亡不是通过cGMP途径实现,存在着其他NO参与调控Caspase 3的细胞凋亡途径。
昂盛骏[2]2016年在《PM_(2.5)对肺部iNOS释放和NO合成的影响及其机制探究》文中认为[目的]探讨南京市大厂区大气细颗粒物(PM2.5)对肺部合成一氧化氮(nitricoxide, NO)、诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase, iNOS)活性的影响及其机制。[方法]采用空气总悬浮颗粒物采样器采集南京市大厂区PM2.5,用去离子水超声法提取并制成0、10、25、50、100、200、400μg/ml的悬液,用电感耦合等离子色谱质谱法(ICP-MS)测重金属元素含量,用透射电镜测定样品的粒径分布,利用气相色谱质谱仪(GC-MS)测样品中有机成分,体内实验选择C57BL/6小鼠,采用气管滴注急性染毒,用硝酸还原酶法测一氧化氮,用一氧化氮合酶测定试剂盒测一氧化氮合酶,用逆转录PCR(Real-time-PCR)法检测iNOSmRNA表达水平的改变。体外实验选A549细胞,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法测定细胞毒性,一氧化氮、一氧化氮合酶和iNOSmRNA表达水平的的测定同体内实验。用蛋白质免疫印迹(WesternBlotting)法测iNOS、核转录因子kappaB (NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)蛋白表达水平的改变,NF-κB和p38-MAPK两条通路的抑制剂分别采用PDTC和SB203580。数据以均数±标准差(χ士s)表示,用SPSS 19.0软件包进行统计学分析,采用最小极差法(LSD)比较数据,P<0.05表示差异有显着性。[结果]在南京市大厂区收集的PM2.5中,Al、Pb、Mn和As占所测金属元素的93.4%,有机物中占比重较高的元素多与工业相关,粒径分析表明PM2.5的粒径大多集中在1μm以内。PM2.5染毒小鼠后,其肺部NO和iNOS的生成量随染毒剂量的增加而逐渐增多,同时iNOSmRNA表达量上调,高剂量组的NO含量为6.53±0.77μmol/gprot,约为对照组的4倍,高剂量组的iNOS含量为0.58±0.073,约为对照组的3倍。PM2.5对A549细胞的MTT实验呈剂量-反应关系(r=0.971,P<0.05),且NO和iNOS释放量随剂量增加而升高,染毒剂量为100μg/ml时,NO释放量高达97.4±11.11μmol/L,是对照组的7倍；iNOS释放量为16.16±0.75M/ml,与对照组相比增加了约30%。经SB203580和PDTC两种抑制剂预处理后,iNOS释放量下降,抑制剂SB203580浓度为25μg/ml时,iNOS释放量为3.149±0.139M/ml,抑制剂PDTC浓度为25μg/ml时,iNOS释放量为4.361±0.182M/ml,约占对照组1/4；同时iNOSmRNA表达量下调,与阴性对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。SB203580可抑制p38蛋白表达,PDTC可抑制p65蛋白表达,两种抑制剂能够抑制PM2.5诱导的A549细胞iNOS蛋白表达。[结论]南京市大厂区PM2.s符合重工业区细颗粒物特点；PM2.5引起小鼠肺部NO和iNOS释放量升高,iNOS基因表达量上调；同时PM2.5导致A549细胞存活率降低,具有剂量-反应关系,且剂量≥25μg/ml的PM2.s可刺激A549细胞NO和iNOS的合成；SB203580和PDTC两种抑制剂可以抑制PM2.5诱导A549细胞合成NO和iNOS; PM2.5可能通过NF-κB和MAPK两条通路调控iNOS的合成。
姜辉[3]2005年在《一氧化氮供体对肿瘤生长转移调控的研究》文中研究说明研究发现,小分子一氧化氮(NO)在生物体内具有广泛的生理活性,参与诸多生理功能和病理生理过程。其兼有信号分子和自由基的双重性质。NO与肿瘤生长侵袭的关系也是近年来研究的热点,由于NO的双重特性决定其对于肿瘤的调控具有“两面性”一既存在抑制作用又存在促进作用。本课题通过细胞培养、动物模型等途径应用L精氨酸(L-Arg)、硝酸甘油(GTN)、氨基胍(AG)等叁种调控NO生成的药物,观察对肿瘤细胞生长增殖的影响;应用GTN干预观察肿瘤细胞转移以及相关基因和表达蛋白质谱的改变。进一步探讨了NO调控肿瘤转移的机制,以及一氧化氮供体药物潜在的抗肿瘤转移功效。 一、不同一氧化氮调控药物对肿瘤细胞增殖抑制 在LLC肿瘤细胞培养体系中加入不同浓度L-Arg、GTN、AG后观察到,叁种药物高浓度均抑制细胞增殖,随浓度降低抑制作用减弱,L-Arg和GTN在低浓度均产生对肿瘤增殖的促进作用。加入L-Arg和AG的细胞培养液中随药物浓度下降NO_2~-水平逐步升高,加入GTN的细胞培养液中NO_2~-水平与药物浓度正相关;观察不同药物组合对细胞增殖影响,L-Arg和AG在一定浓度出现拮抗作用,而硝酸甘油和氨基胍基本为协同作用; 二、GTN对肿瘤细胞转移相关基因和表达蛋白质谱的调控作用 根据前部试验在Hela细胞培养体系中加入较高浓度(40μg/ml)的GTN,形态学观察细胞生长受到抑制,通过基因芯片检测发现血管生成基因和转移相关基因的表达发生明显改变,而且变化趋势以下调较多;应用双向电泳技术观察到多个蛋白质点表达量有不同程度的改变,并出现新的差异表达蛋白点,运用RT-PCR和ELISA方法对基因芯片结果进一步确定,发现GTN干预后MMP-9基因表达和细胞外液蛋白表达水平均有下降,对TIMP-1无明显影响或轻微促进作用,二者比值明显改变; 叁、高浓度GTN对肿瘤转移具有抑制作用并与调控MMP-9/TIMP-1表达有关通过小鼠LLC肿瘤转移模型观察到1.6g/L硝酸甘油溶液灌胃
苏晓明[4]2010年在《一氧化氮对肿瘤细胞敏感性的化学性修饰》文中研究指明作为一种泛素化分子,一氧化氮可诱导许多生物学效应,并且在肿瘤的演化和进展中也起到非常重要的作用。一氧化氮可参与多个导致蛋白发生变化的信号转导机制。并且这些蛋白的变化是浓度依赖性的。不断产生的持续剂量的一氧化氮通过激活Caspase诱导凋亡;而生理浓度或者低剂量的一氧化氮则抑制细胞凋亡。我们以往的研究也表明细胞辐射损伤抑制的产生和染色体畸变的降低可以用p53和一氧化氮的相互作用这一信号通路模式来阐述。然而一氧化氮对细胞敏感性诱导的具体机制尚不十分清楚。本课题的目的是阐明不同浓度的一氧化氮对肿瘤细胞敏感性的影响以及与其相关的可能性机制。本课题第一部分研究以人肺癌细胞为研究对象,来阐述一氧化氮在携带不同p53基因状态的细胞中对辐射诱导的细胞死亡和染色体畸变的影响以及与p53相关的可能性分子机制。p53缺如的人肺癌H1299细胞通过稳定转染wtp53和mp53基因,得到本实验使用的野生型或突变型p53细胞。X线照射前,细胞作用于不同浓度的硝酸异山梨酯(ISDN,一种一氧化氮供体)和/或羧基-2-苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(c-PTIO,一种一氧化氮清除剂)。细胞内质粒载体的稳定表达由RT-PCR和限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)法检测。细胞敏感性、凋亡、染色体畸变和γH2AX分别由克隆形成实验、Hoechst33342染色法、TUNEL染色法、染色体显带技术和流式细胞术测定。凋亡相关蛋白的表达由Western blot检测。实验结果如下:在H1299/wtp53和H1299/mp53细胞中,p53基因7号外显子RT-PCR的产物可以观察到清晰的110 bp条带。并且7号外显子用MspI或BsrI限制性内切酶特异性消化后,分别在H1299/wtp53或H1299/mp53细胞中,可以观察到清晰的70 bp条带。这表明本实验模型是成功的和有效的。在wtp53细胞中,X线辐射前作用于低浓度的ISDN(5μM),可观察到明显的辐射抑制现象以及凋亡、DNA双链断裂和双着丝粒体染色体畸变的显着降低。然而,如果c-PTIO和ISDN照射前6小时共同存在于细胞培养液中,以上这些效应几乎被彻底地抑制。然而,X线辐射前,wtp53细胞作用于高浓度的ISDN(500μM),可观察到明显的辐射增敏现象以及凋亡、DNA双链断裂和双着丝粒体染色体畸变的显着升高。此外,H1299/wtp53细胞中辐射后凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的表达数据表明,当p53功能正常时,一氧化氮可双向性影响X线照射诱导的通过Caspase-3和Bax介导的凋亡。这可能是一氧化氮影响野生型p53人肺癌细胞辐射敏感性的一个重要原因。但是,在上述ISDN的任何浓度,所有这些现象并没有在H1299/mp53细胞中观察到。基于以上研究,在第二部分研究中,我们只选择携带野生型p53基因的人肺癌细胞做为研究对象。本研究目的是从细胞所处周期位置不同对一氧化氮敏感性影响不同的角度,去探讨不同剂量的一氧化氮对辐射诱导的H1299/wtp53细胞杀伤和染色体畸变的双向性影响。急性X线照射前6小时,细胞作用于不同浓度的ISDN或0.02 Gy小剂量预照射。细胞同步化由血清饥饿法获得。离心收集悬浮在培养液中的有丝分裂细胞,重新接种于新鲜培养液中。细胞敏感性、细胞周期分布和染色体畸变分别由克隆形成实验、流式细胞术和染色体显带技术检测。实验结果如下:主要在细胞有丝分裂后17.5小时,在急性大剂量辐射前给予低浓度的ISDN(5μM)或者小剂量的预照射(0.02 Gy)处理,可以观察到明显的辐射适应性反应,具体表现为产生辐射抑制和抑制染色体畸变的发生。这种由低浓度的ISDN(5μM)或者小剂量的预照射(0.02 Gy)诱导的辐射适应性反应伴随着G2/M期的显着性缩短(P<0.01 vs对照组)和S期的轻微延长(P<0.05 vs对照组)。另一方面,与之相反的是,也是在细胞有丝分裂后17.5小时,在急性大剂量辐射前给予高浓度的ISDN(500μM)处理,可以观察到明显的辐射增敏性效应,具体表现为产生辐射增敏和增加染色体畸变的发生。这种由高浓度的ISDN(500μM)诱导的辐射增敏效应伴随着G2/M期的显着性延长(P<0.001 vs对照组)和S期的缩短轻微(P<0.05 vs对照组)。由此可知,G2/M细胞对ISDN诱导的细胞死亡和染色体畸变是最敏感的,ISDN对细胞生存率和染色体畸变的影响依赖于细胞周期位置。由于一氧化氮在肿瘤细胞中的增敏效应受p53基因状态的影响,因此,下一步研究的目的寻找一条新的靶向型途径,通过增加一氧化氮诱导的DNA双链断裂(DSBs)来提高一氧化氮的增敏治疗效果。本研究使用的细胞:胎鼠成纤维细胞(MEF)携带野生型或缺失型DNA双链断裂同源性重组修复(HR)基因—X线修复交叉互补基因2(XRCC2)和放射敏感突变54(Rad54);非同源末端连接修复基因(NHEJ)—DNA连接酶4(Lig4)和Ku80;DNA碱基切除修复基因DNA聚合酶β(Polβ);中国仓鼠卵巢细胞(CHO)携带野生型、突变型或回复型DNA双链断裂同源性修复(HR)基因—乳腺癌易感基因2(BRCA2)。ISDN处理后,细胞敏感性和γH2AX分别由克隆形成实验和流式细胞术测定。BRCA2基因的下调通过小干扰RNA技术来获得。实验结果如下:细胞生存率相对D50值(反映细胞对一氧化氮敏感性的高低)按增长顺序排列为:BRCA2mt细胞<<< polβ-/-细胞< XRCC2-/-细胞< Lig4-/-细胞< Rad54-/-细胞< Ku80-/-细胞。这表明本实验中,BRCA2是影响一氧化氮细胞敏感性的最有效分子靶向。此外,相对γH2AX强度在一氧化氮作用后8、12、24和48小时,BRCA2突变型(BRCA2mt)细胞要明显高于BRCA2野生型和回复型(BRCA2wt和BRCA2 rev)细胞。一氧化氮作用24小时后修复24小时的相对γH2AX强度,BRCA2突变型(BRCA2mt)细胞与BRCA2野生型和回复型(BRCA2wt和BRCA2rev)细胞也存在着显着差异。流式细胞术检测γH2AX(组蛋白H2AX在丝氨酸139位点磷酸化)的结果表明BRCA2可通过修复一氧化氮诱导的DNA双链断裂来抑制细胞对一氧化氮的敏感性。而且,小干扰RNA下调BRCA2的表达可增强人肺癌H1299细胞对一氧化氮的敏感性。总之,上述结果表明,在人肺癌细胞中,低和高浓度的一氧化氮可分别诱导截然不同的辐射敏感性,Bax和Caspase-3介导的凋亡,DNA双链断裂以及双着丝粒体染色体畸变的变化,并且一氧化氮可通过p53基因表达调控来影响细胞的生存与死亡。一氧化氮对携带野生型p53基因的人肺癌细胞的这些双向性影响依赖于细胞周期位置,是G2/M期依赖性的。此外,同源性修复基因BRCA2在一氧化氮诱导的DNA双链断裂修复中起到极为关键的作用,下调BRCA2表达可能成为提高一氧化氮对一些肿瘤病人(如p53缺失)化学增敏疗效的有效措施。
乔伟丽, 闫长栋[5]2000年在《一氧化氮在小肠推进运动中的作用》文中研究说明目的 观察一氧化氮 (NO)对小鼠小肠推进运动的影响。方法 采用胃内灌注技术 (含 12 %活性炭和4%黄芪胶的炭末胶液灌胃 ) ,计算炭末胶液在小肠内推进距离占小肠全长的百分比 ,以此作为小肠推进速度的指标。观察尾静脉给予NO合成前体L -精氨酸和NO合酶抑制剂L -NAME在小肠推进运动中的作用。结果 正常对照组小肠推进速度为 (70 .6 5± 9.2 2 ) %。尾静脉注射NO合成前体L -精氨酸 (L -Arg)推进速度为 (5 7.33±7.2 5 ) % ,与对照组相比显着减慢 (P <0 .0 1) ;尾静脉注射NO合酶抑制剂L -NG -硝基精氨酸甲酯 (L -NAME)可阻断L -Arg对小肠推进运动的减弱作用 (P <0 .0 1) ,但单独静脉注射L -NAME 12mg kg后 ,小鼠小肠推进运动也明显减慢 ,与对照组相比亦有极其显着性差异 (P <0 .0 1)。结论 NO参与小鼠小肠推进运动的抑制作用 ,小肠推进运动速度除与小肠本身功能有关外 ,尚与胃排空活动有关
郑国静[6]2005年在《消痰散结方调控诱导型一氧化氮合酶表达抗胃癌血管生成的实验研究》文中研究指明目的:观察消痰散结方通过调控诱导型一氧化氮合酶的表达抗胃癌血管生成的作用。方法:动物随机分为生理盐水组、5-Fu组、中药组和联合组,建立裸鼠人胃癌SGC-7901原位种植模型,造模后第二周开始给药,生理盐水组给予生理盐水0.2ml灌胃,每日一次:5-Fu组给予5-Fu稀释液0.2ml腹腔注射,60mg.kg~_(-1).w~(-1),每周1次:中药组给予消痰散结方0.2ml灌胃,每日一次;联合组给予消痰散结方0.2ml灌胃,每日一次,5-Fu稀释液0.2ml腹腔注射,60mg.kg~(-1).W~(-1),每周1次,给药时间4周。第11周实验结束时,对动物行超声探查,观察肿瘤血供情况,叁维重建计算肿瘤血管体积,免疫组化染色CD_(34),计数MVD,定量观察肿瘤血管生成情况,同时瘤组织行免疫组化和RT-PCR,检测iNOS蛋白和mRNA的表达。结果:消痰散结方可以明显抑制裸鼠人胃癌SGC-7901原位种植瘤的生长,能减少其血供,并显着降低肿瘤组织的MVD,下调iNOS蛋白和mRNA的表达。结论:消痰散结方可以下调iNOS蛋白和mRNA的表达,可能是其抗胃癌血管生成的机制之一。
孙欹阳[7]2004年在《镉致心肌细胞损伤的NOS基因表达及NOS-NO系统活性变化及机制研究》文中认为本文通过原代培养新生乳鼠心肌细胞模型，运用激光共聚焦显微镜、细胞培养和RT-PCR等生物学技术，系统研究镉负荷诱发损伤以及L-Arg、SNP和L-NMMA预处理的镉损伤心肌细胞eNOS mRNA和iNOS mRNA表达，细胞培养上清液总NOS、eNOS和iNOS活性，细胞培养上清液NO含量变化，初步观察了镉损伤心肌细胞内Ca~(2+)的变化及其可能的作用机制。较为深入地探讨了L-Arg、SNP和L-NMMA以及心肌细胞内Ca~(2+)稳态在镉损伤的心肌细胞NOS-NO系统活性变化中的作用机制。结果如下： 1 新生乳鼠心肌细胞原代培养方法的建立 无菌分离新生乳鼠心脏组织，采用胰蛋白酶消化法分离和培养心肌细胞，通过形态学及台盼蓝染色法鉴定，分离的心肌细胞细胞完整，呈杆状，存活率在90％以上。说明该方法是比较理想的心肌细胞培养法，为科学研究提供了细胞模型平台。 2 镉诱导心肌细胞NOS mRNA表达及NOS-NO系统活性变化研究 原代培养乳鼠心肌细胞，分为镉负荷低剂量组(L-Cd组)、镉负荷中剂量组(M-Cd组)、镉负荷高剂量组(H-Cd组)和对照组，向培养液中加入CdCl_2诱发心肌细胞损伤。结果显示：L-Cd组、M-Cd组和H-Cd组心肌细胞eNOS mRNA表达除在镉负荷后12h明显低于对照组外，其它时间差异不显着；而镉负荷心肌细胞iNOS mRNA表达在24h内与对照组比较均显着增加。镉负荷心肌细胞培养液中总NOS和eNOS活性在6h后均持续明显降低直至第7d，iNOS活性在6h高于对照组后呈时间依赖性降低，实验第3d后显着低于对照组；不同镉负荷剂量心肌细胞培养液NO含量在24h内均低于对照组，在镉负荷7d内，低于或明显低于对照组。提示：镉负荷引起心肌细胞损伤，影响eNOS mRNA表达，诱导iNOS mRNA表达明显增多，但导致NOS-NO系统活性下降。 3 L-Arg、SNP和L-NMMA对镉致心肌细胞损伤的NOS mRNA表达及NOS-NO系统活性的影响 原代培养乳鼠心肌细胞，分为L-Arg组、L-Arg+CdCl_2组、L-Arg+CdCl_2+SNP组、L-Arg+CdCl_2+L-NMMA组，同时设对照组，收集心肌细胞提取总RNA进行RT-PCR，并采集细胞培养上清液检测NOS活性和NO含量。结果显示：在镉负荷24h内，L-Arg组和L-Arg+CdCl_2+SNP组心肌细胞eNOS mRNA高于或显着高于对照组，而L-Arg+CdCl_2组和L-Arg+CdCl_2+L-NMMA组从 摘要212h起低于或显着低于对照组和L一赶g组，各组心肌细胞eNOS mRNA表达均呈现下降趋势;而iNOS n1RNA表达，L一Arg组与对照组总体水平接近，其余各组均显着高于对照组和L一七g组，且L一赶g+CdC12+SNP组iN0s mRNA表达水平呈上升趋势并为各组最高。在实验7d内，L一赶g+CdCI:组、L一沁g+CdC12十SNP组和L一沁g+CdC12+L一NMMA组心肌细胞培养液中总NOS和iNOS活性均高于或明显高于对照组和L一打g组，而eNOS活性明显低于L一Axg组仍高于对照组，其中L一Arg+CdC12+sNP组与L一Arg组水平接近直至第3d时明显降低。整个实验期内，L一打g组心肌细胞培养上清液NO含量均高于或显着高于对照组，L一打g+CdCI:组和L一Axg+CdC12+L一MMA组则持续低于或明显低于对照组和L一Arg组，L一七g+CdC12+SNP组从12h起高于L一Arg组且为各组最高。提示:L一Axg可以促使心肌细胞eNOS的mRNA表达和活性增加，并大量合成NO;在外源性L一赶g大量存在的情况下，CdCI:致心肌细胞损伤的iNOS mRNA表达和活性增加但并不能导致NO合成增多，L一MMA的掺入可以维持这一现象;而SNP能促进细胞大量合成NO的同时却不能维持延长NOS活性水平升高。4锡致心肌细胞损伤的胞内Ca2+变化及其机制探讨 原代培养新生鼠心肌细胞，分为对照组和锡负荷组，向培养液中加入CdC12诱发心肌细胞损伤，于第1、3、5、7天分别对各组心肌细胞内C扩十的变化进行观察。结果显示:镐负荷心肌细胞较对照组增殖缓慢，贴壁不牢，存活率降低，其[C扩勺i荧光强度显着低于对照组，且与负荷时间长短呈正相关;cdcl:降低心肌细胞[C扩+]i浓度，且明显抑制氯化钾预处理引起的心肌细胞外钙内流。激光共聚焦荧光影像清楚显示，加入cdcl:后，细胞膜向外突起小泡，[C扩+]i外流，小泡逐渐膨胀变大，〔c扩+li荧光强度持续下降。提示:福导致心肌细胞[C aZ勺I外泄，使得[C a2+]i浓度降低可能是锡致心肌细胞毒性损伤重要机制之一。
李宗锴[8]1998年在《衰老过程中一氧化氮等信号传导因子的改变及免疫调节药物的研究》文中提出自本世纪五十年代以来，随着全球人口老龄化趋势的日益突出，老年学和老年医学的发展逐渐得到人们的重视，有关衰老的研究正在成为热门研究课题。为了研究衰老的机制，防治老年性疾病，开发抗衰老药物，我们进行了以下几方面的研究： 衰老过程中一氧化氮等信号传导因子的改变 1．建立了测定NO及NOS活性的HPLC法。 HPLC法测定NO的回归方程： C(umol·L~(-1)，umol·mg~(-1))=196.9A-3.224(r=0.9982)。 HPLC法测定NOS活性的回归方程： C(Arg)=1.9715(h_(Arg)／h_(Nleu))+0.078278(r=0.9993)。 HPLC法测定了大鼠大脑皮层细胞NO含量及NOS活性。 青年鼠脑皮层NO(亚硝酸盐)含量为1.5439±0.1489umol·L~(-1)。老年鼠脑皮层(亚硝酸盐)含量为2.6112±0.1001umol·L~(-1)，与青年鼠相比增加非常显着(P＜0.01)。可以看出，随着年龄的增大，大鼠脑皮层NO(亚硝酸盐)含量有增加趋势实验表明，老年鼠(30月龄)脑皮层NO含量明显高于青年鼠(5月龄)(P＜0.01)。青年鼠脑皮层NOS活性为234.38±16.24fmol·mg~(-1)·min~(-1)。老年鼠脑皮层NOS活性为398.22±21.62fmol·mg~(-1)·min~(-1)，比青年鼠明显增高(P＜0.01)。 Fura-2检测突触体内游离钙浓度，青年鼠(5月龄)皮层突触体内游离钙浓度为372.99±19.20nM。老年鼠(30月龄)皮层突触体内游离钙浓度为485.26±28.48nM，比青年鼠(P＜0.01)显着增高。 原位杂交法检测青年鼠、老年鼠脑组织中cNOS，bcl-2 mRNA的转录水平，结果发现，青年鼠脑组织中海马处有bcl-2的基因表达，而老年鼠脑组织中几乎没有bcl-2基因表达。青年鼠脑组织中cNOS很少表达，老年鼠脑组织中cNOS基因表达比青年鼠多。 末端转移酶标记法检测衰老大鼠脑神经细胞中的凋亡，结果发现：青年大鼠的脑切片未见阳性棕色颗粒，衰老大鼠的脑切片有少量散在的阳性棕色颗粒，说明衰老大鼠开始产生细胞凋亡。
张平祖[9]2010年在《青蒿素增敏复方抗肿瘤的体内外评价及青蒿素靶向杀伤肿瘤细胞的机理研究》文中研究指明恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一。青蒿素不仅是最有效的抗疟药,而且具有抗肿瘤作用。可是,青蒿素中在杀伤肿瘤细胞中起关键作用的过氧桥结构易被体内的抗氧化剂和抗氧化酶破坏,因而显着影响青蒿素抗肿瘤的疗效。同时,青蒿素针对肿瘤细胞的攻击靶点及杀伤机理尚未明确,也阻碍了青蒿素在临床肿瘤治疗中的应用。为此,本研究利用青蒿琥酯与抗氧化剂还原型谷胱甘肽(GSH)耗竭剂马来酸二乙酯、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)抑制剂巯基琥珀酸和过氧化氢酶(CAT)抑制剂氨基叁唑组成青蒿琥酯增敏复方,采用体内外评价方法比较了青蒿琥酯单、复方抑制肝癌HepG2细胞增殖及延缓荷瘤裸鼠移植肿瘤生长的效率,并初步揭示了促氧化剂(抗氧化抑制剂)对青蒿琥酯的增敏作用机理。结果发现,青蒿琥酯复方对肿瘤细胞生长的抑制率比相同浓度的青蒿琥酯单方高21.29%,对荷瘤裸鼠的抑瘤率则比青蒿琥酯单独处理提高16.75%-22.91%。经青蒿琥酯复方处理后,HepG2细胞中GSH含量及GSH-PX、CAT活性均比单方有所降低,其中GSH-PX在药物作用24h后的活性与对照比较差异显着(P<0.05),而CAT在药物作用24h及48h后的活性与对照比较差异极显着(P<0.01)。本研究首次发现,青蒿琥酯攻击肿瘤细胞的分子靶点是含血红素辅基的酶类如一氧化氮合酶(NOS)与过氧化氢酶(CAT),其证据是青蒿琥酯作用后可直接检测到血红素的光吸收峰(A415)向青蒿琥酯-血红素的光吸收峰(A476)转变。同时,青蒿琥酯可显着影响NO的合成,并与HepG2细胞生长抑制率相关,其中低浓度(50μM)青蒿琥酯可诱导NO产生,减少H2O2含量,具有保护肿瘤细胞和降低生长抑制率的作用,而高浓度(100-200μM)青蒿琥酯则抑制NO产生,增加H2O2含量,促进肿瘤细胞凋亡。我们进一步发现,肿瘤化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)对青蒿琥酯表现明显的协同作用,使HepG2细胞生长抑制率从25%提高到40%,其机理可能是解除过多的NO对肿瘤细胞的保护作用,提示5-FU或其他化疗药也可能作为青蒿琥酯的增效剂。本研究利用HepG2肿瘤细胞模型及HepG2移植生长荷瘤裸鼠实验动物模型肯定了青蒿琥酯增敏复方的抗肿瘤效果优于青蒿琥酯单独处理,初步阐明了促氧化剂对青蒿琥酯的增敏作用机理在于抑制细胞的抗氧化作用,改变细胞的氧化还原状态,营造有利于青蒿琥酯更好地发挥肿瘤细胞杀伤作用的细胞环境。我们首次发现NOS是青蒿琥酯结合的分子靶点之一,并提出将常规化疗药作为青蒿琥酯增效剂的可能性,从而为青蒿素类药物尽快用于抗肿瘤临床试验奠定了基础。
彭圣明[10]2009年在《白杨素偶联一氧化氮供体衍生物的合成及α-葡萄糖苷酶抑制和促血管生成活性研究》文中研究表明NO作为一种重要的信使物质和生物活性物质,参与调节机体的一系列生理活动以及新生血管生成等病理生理过程,调节血管内皮生长,触发血管活性物质,促进血管生长与再生。而NO供体则是在体内经酶或非酶作用能释放NO。近来人们为了增加药物的活性,已经开始趋向于把NO供体结构引入到已知药物分子中去。白杨素,化学名为5,7-二羟基黄酮,是以C6-C3-C6结构为基本母核的天然有机化合物。具有一些重要的特性,如:高度的化学反应性,易进行结构修饰;很多重要的药理作用,具有抗氧化、抗焦虑、抗菌、抗癌﹑抗高血压﹑抗病毒等作用。近年来,为获得疗效更好的新型药物,开始了对白杨素进行结构修饰和化学合成。但对白杨素衍生物抗糖尿病及其并发症药物的设计开发处于起步阶段。因此,在本文中我们将设计合成几类白杨素偶联不同一氧化氮供体衍生物新型化合物,期望能同时具有α-葡萄糖苷酶抑制活性和促血管生成作用,为开发糖尿病及其血管并发症药物提供候选化合物。合成路线是以白杨素为母核,将不同类型的NO供体通过不同结构的中间链与白杨素7位活性羟基偶联,或同时在把5位羟基乙酰化。最后得到3种不同类型5个系列共16个未见文献报道的新化合物,其中包括有机硝酸酯类2个系列共9个,呋咱氮氧化物类2个系列共6个、N-羟基胍类1个系列共1个,所有目标化合物均由核磁共振氢谱、质谱等表征确认其结构。对所合成的硝酸酯偶联白杨素衍生物9个和呋咱氮氧化物偶联白杨素衍生物6个共15个,分别进行了体外α-葡萄糖苷酶抑制活性实验, MTT细胞毒性和CAM血管生成实验。发现所有15个化合物都具有α-葡萄糖酶抑制活性,其中6个化合物(7b、17、18、15b、15a、16b)的IC50值都在20μmol/L以下,酶抑制活性大大超过阳性对照药阿卡波糖;在MTT体外实验中,10μmol/L浓度下,所有目标化合物均未表现出细胞毒性,其中7a、7b、7c、5a、5b、5c、17目标化合物对HUVECs-12具有一定的促细胞增殖作用;在CAM体内实验中,目标化合物7a、7b、7c、5a、5b、5c、17、15b、15a、16b、16a促血管生成活性作用明显。根据药理实验,所合成的目标化合物中有5个(7b、17、15b、15a、16b)既有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,又有较强促血管生成能力,这5个目标化合物在开发糖尿病及其血管并发症药物方面具有很好的潜力,值得深入研究。
参考文献：
[1]. NO/cGMP通路在小鼠囊胚孵化中的调控作用[D]. 杨爱军. 青岛大学. 2016
[2]. PM_(2.5)对肺部iNOS释放和NO合成的影响及其机制探究[D]. 昂盛骏. 东南大学. 2016
[3]. 一氧化氮供体对肿瘤生长转移调控的研究[D]. 姜辉. 中国人民解放军军医进修学院. 2005
[4]. 一氧化氮对肿瘤细胞敏感性的化学性修饰[D]. 苏晓明. 第四军医大学. 2010
[5]. 一氧化氮在小肠推进运动中的作用[J]. 乔伟丽, 闫长栋. 徐州医学院学报. 2000
[6]. 消痰散结方调控诱导型一氧化氮合酶表达抗胃癌血管生成的实验研究[D]. 郑国静. 第二军医大学. 2005
[7]. 镉致心肌细胞损伤的NOS基因表达及NOS-NO系统活性变化及机制研究[D]. 孙欹阳. 南京师范大学. 2004
[8]. 衰老过程中一氧化氮等信号传导因子的改变及免疫调节药物的研究[D]. 李宗锴. 中国协和医科大学. 1998
[9]. 青蒿素增敏复方抗肿瘤的体内外评价及青蒿素靶向杀伤肿瘤细胞的机理研究[D]. 张平祖. 广州中医药大学. 2010
[10]. 白杨素偶联一氧化氮供体衍生物的合成及α-葡萄糖苷酶抑制和促血管生成活性研究[D]. 彭圣明. 湘潭大学. 2009
标签：肿瘤学论文; 一氧化氮论文; 对照组论文; 心肌细胞论文; 肺癌论文; 肿瘤细胞论文; 青蒿琥酯论文; 囊胚论文; snp论文;