李茵[1]2014年在《MYVYNV和MYVV两种双生病毒病害复合体的检测及伴随卫星DNA的分子变异》文中研究指明赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein virus, MYVV)和云南赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein Yunnan virus, MYVYNV)是在我国云南、四川地区广泛发生的双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒,伴随卫星称之为赛葵黄脉病毒伴随卫星DNAβ (Malvastrum yellow vein betasatellite, MYVB)和云南赛葵黄脉病毒伴随卫星DNAβ (Malvastrum yellow vein Yunnan betasatellite, MYVYNB),已在多个科属寄主上发现其侵染报道。研究表明,MYVV/MYVB和MYVYNV/MYVYNB是两种完全不同的病害复合体。卫星MYVB为辅助病毒MYVV引起典型症状必需的致病决定因子：与之不同的是,MYVYNB能够加重MYVYNV致病引起的症状但并非是必需的致病决定因子,且田间仅有部分MYVYNV分离物伴随卫星MYVYNB。为了进一步调查这两种双生病毒/卫星DNAβ病害复合体在四川地区的发生发展情况及研究其变异进化规律,本研究利用双生病毒及其伴随卫星通用引物和MYVV、MYVYNV和MYVB、 MYVYNB特异性引物对采自我国四川地区的表现双生病毒典型症状的胜红蓟、赛葵和锦葵等3种田间杂草共计255份样品进行PCR检测和鉴定,分析部分分离物DNA-A和卫星DNAβ全基因组结构和遗传多样性,并对这两种病毒伴随卫星种群遗传结构和变异进行研究。PCR检测结果表明,利用双生病毒通用引物PA/PB,在255份样品中共有195份能扩增到预期约500bp的特异条带,阳性检出率为76.5%。其中有11份样品受MYVV侵染,162份样品受MYVYNV侵染,MYVV和MYVYNV的检出率分别为4.3%和63.5%,这两种病毒复合侵染的检出率为3.5%,在赛葵杂草寄主上MYVV和MYVYNV普遍发生。利用双生病毒卫星DNAP的通用引物β01/β02,在255份样品中共有159份能扩增到约1,300bp的特异条带,阳性检出率为62.4%。MYVB和MYVYNB检出率分别为20.0%和37.3%。分别选取来自于不同寄主及伴随不同卫星的5个代表性分离物进行全基因组测序,并对这两种病毒及伴随卫星进行基因组结构和遗传多样性分析。结果表明,MYVV和MYVYNV分离物均具有典型双生病毒DNA-A基因组结构特征,共编码6个开放阅读框(open reading frames, ORFs),即AV1、AV2和AC1、AC2、AC3、 AC4, AV2和AC1被IR区隔开,IR区包含双生病毒保守的各种顺式组件,如茎环结构(含有9个核苷酸TAATATT/AC). TATA box以及重复序列等。分析总核苷酸的相似性、各个编码框的核苷酸序列相似性及相应地各个ORFs所推导的氨基酸序列相似性,结果表明,IR区变异最大,核苷酸相似性最低；AC4区相对保守,核苷酸相似性较高；ACl区主要发生同义突变；AC3区和AC4区主要发生非同义突变。MYVB和MYVYNB分离物基因组具有双生病毒卫星DNAβ的典型结构,互补链上编码一个ORFs,含一个保守的卫星共同区(Satellite conserved region, SCR),具有保守的九核苷酸TAATATT/AC茎环结构和富含腺嘌呤A的区域(A-rich region)。MYVB和MYVYNB为两种不同类型的卫星,具有不同的致病机理。本文以MYVB和MYVYNB为研究对象,研究MYVB种群在自然寄主和实验寄主中和MYVYNB种群在不同自然寄主中的遗传结构和变异水平。结果表明,自然感染MYVB的寄主YN57中种群突变克隆百分率为55.6%,突变频率为1.4x10-3；在本氏烟中MYVB种群突变克隆百分率为100%,突变频率为2.4x10-3;在心叶烟中MYVB种群突变克隆百分率为100%,突变频率为1.8×10-3,表明MYVB自然种群突变水平略低于实验种群。对MYVB种群变异类型及分布特点分析表明,自然寄主中不仅检测到碱基的突变而且检测到碱基的缺失和增加,在实验寄主中只检测碱基的突变和碱基的增加,且多为碱基A的增加和突变；自然种群突变主要发生在SCR区,而实验种群突变主要发生在A-rich区。在寄主辣椒YN65中MYVYNB种群突变克隆百分率为84.2%,突变频率为1.5×10-3；在锦葵MY382中种群突变克隆百分率为35.0%,突变频率为2.6x10-4；在赛葵SC95中种群突变克隆百分率为76.2%,突变频率为9.9x10-4,表明不同寄主中变异水平存在一定差异。对MYVYNB种群变异类型及分布特点分析表明,在寄主辣椒中碱基转换次数高于碱基颠换次数,占优势地位,在寄主赛葵和锦葵中碱基转换次数低于碱基颠换次数,突变类型占优势地位的是碱基之间的颠换,在寄主辣椒中共发生2种碱基类型的增加,在寄主锦葵中未发生碱基的增加仅有1种碱基的缺失,在寄主赛葵中未发生碱基的缺失和增加；在寄主辣椒中突变位点多集中在SCR区,在寄主赛葵中突变位点多分布在A-rich区,在寄主锦葵中突变位点集中在βC1区,表明在不同科属的寄主之间种群的突变频率、碱基的突变类型和突变分布均存在一定差异。这些结果表明,来自寄主的选择压力对卫星的进化具有一定的作用。
张弦[2]2004年在《赛葵黄脉病毒致病机制研究》文中研究说明双生病毒是植物病毒中唯一的一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒(single-stranded DNA，ssDNA)，双生病毒科病毒可侵染双子叶和单子叶植物，并在多种重要经济作物上造成严重的减产，在我国云南、广西、海南省的番茄、烟草、南瓜、胜红蓟和赛葵等植物上也相继发现了多种双生病毒。 对云南表现黄脉症状的赛葵杂草上的双生病毒分离物Y200进行了基因组结构研究。对其DNA-A基因组部分序列测定分析表明，该序列与赛葵黄脉病毒(MYVV)相应序列的同源性为96.1％。利用DNAβ的特异性引物，从Y200中扩增到卫星DNA分子。序列分析表明，该DNAβ全长1348个核苷酸，全序列与MYVV DNAβ的同源性最高，为96.1％。DNA-A部分序列和DNAβ全长序列分析表明，该病毒分离物为MYVV。 为了研究MYVV DNA-A和DNAβ在致病中的作用，我们构建了MYVV分离物Y47 DNA-A和DNAβ的侵染性克隆，侵染性测定表明MYVV-Y47 DNA-A单独可以侵染本氏烟、心叶烟和矮牵牛，但不能产生任何症状，只有与MYVV-Y47 DNAβ共同侵染时才能诱导产生黄脉、叶片卷曲的典型的病害症状。MYVV-Y47 DNAβ单独接种不能侵染植株。Southern印迹检测表明，MYVV-Y47 DNAβ依赖于辅助病毒进行复制，反过来DNAβ可以增强DNA-A在植物中的积累水平。因此，DNA-A与DNAβ之间是一种互作关系。
任江平[3]2017年在《赛葵黄脉病毒和云南赛葵黄脉病毒的群体遗传变异研究》文中研究表明赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein virus,MaYVV)和云南赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein Yunnan virus,MaYVYV)是双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的单组份病毒,并伴随β卫星分子(MaYVB和MaYVYB),属不同致病类型。这两种病毒主要侵染锦葵科和菊科中的杂草,且常常与其它双生病毒发生复合侵染,但鲜有在作物上引起危害的报道。本实验室前期对危害作物的双生病毒的遗传变异机制进行了系统的研究,为了进一步了解双生病毒在作物和杂草上的遗传变异机制及进化轨迹,本研究以主要侵染杂草的MaYVV和MaYVYV为研究对象,对两种病毒的寄主范围、发生分布以及遗传变异规律进行了研究。从四川、福建、广西、广东和云南等地区采集了赛葵、胜红蓟、番茄、辣椒和甘薯等杂草和作物共计181份田间样品,利用检测双生病毒及其伴随β卫星的通用引物分别对样品进行PCR检测。结果表明,在赛葵和胜红蓟等杂草上检测到双生病毒及其伴随β卫星,检出率分别为69.06%和40.33%,在作物上没有检测到双生病毒。进一步利用检测MaYVV/MaYVB和MaYVYV/MaYVYB的特异性引物对样品进行特异性检测,结果表明,在双生病毒及β卫星检测呈阳性的样品中,MaYVV和MaYVB的检出率分别为31.20%和53.42%;MaYVYV和MaYVYB的检出率分别为41.60%和61.64%;这两种病毒复合侵染的检出率为32.26%。MaYVV和MaYVYV在赛葵和胜红蓟等杂草上发生普遍,且在赛葵上这两种病毒的复合侵染检出率高达31.18%,但在作物上未检测到。相比MaYVV,MaYVYV的地理分布更广泛。选取采自不同地区不同寄主的代表性样品,通过PCR扩增、克隆和测序获得四川赛葵SC933、广西赛葵GX125和GX175共3条MaYVV分离物全序列,以及四川赛葵SC933和SC939、广西赛葵GX125和GX199共4条MaYVYV分离物全序列。从GenBank数据库下载已登录的MaYVV和MaYVYV不同分离物的全基因组序列,对其群体遗传变异进行分析。结果表明,采自不同地区、不同寄主及不同年份的MaYVV遗传变异水平之间具有明显的遗传差异,这说明MaYVV群体的遗传变异受到地理因素、寄主因素及时间变迁的强烈影响,而MaYVYV群体的遗传变异则主要受到地理因素影响。对病毒群体进行中性分析,发现MaYVV群体的中性检测参数D值为0.87616~1.13887,均为正值,而MaYVYV群体的中性检测参数D值为-2.48095~-2.05184,均为负值且差异显着,表明,MaYVV群体呈现出平衡或稳定的态势,而MaYVYV群体则呈现正在扩张的明显趋势。这两种病毒在种内均未检测到重组现象。遗传多样性分析发现,MaYVV群体的单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为0.944±0.070和0.02433±0.00315,相应的MaYVYV群体的Hd和Pi值分别为0.971±0.033和0.00414±0.00046,表明MaYVV和MaYVYV群体均具有丰富的遗传多样性。其IR区的Pi值分别为0.06467±0.00912和0.00567±0.00177,大于编码区AC1、AC4及AV1的Pi值。说明,MaYVV和MaYVYV群体的IR区的遗传变异最大,受到选择压力较弱;编码区AC1、AC4及AV1区较为保守,所受到的选择压力较强。以接种MaYVV Y47A分离物(Y47A)及其伴随β卫星(Y47β)的本氏烟为材料分别构建MaYVV的实验种群B60(60dpi)和B120(120dpi),同时以四川赛葵样品为材料构建MaYVV的自然种群SC906和SC915,以四川赛葵、广西赛葵及广西胜红蓟为材料构建MaYVYV的自然种群SC933、GX149和GX161,对MaYVV和MaYVYV实验种群及自然种群的遗传结构及变异进行分析。结果表明,两种病毒的种群遗传结构均符合病毒“准种”特征。MaYVV实验种群B60的突变克隆百分率和突变频率分别为22.72%和2.03×10~(-4),种群B120的突变克隆百分率和突变频率分别为51.52%和5.18×10~(-4),表明MaYVV的实验种群遗传变异水平随着时间的推移呈升高趋势。MaYVV自然种群SC906和SC915的突变频率分别为2.54×10~(-4)和8.55×10~(-4),略高于实验种群,而MaYVYV的自然种群SC933、GX149和GX199的突变频率分别为9.26×10~(-4)、1.52×10~(-3)和9.59×10~(-4),均高于MaYVV自然种群的突变频率。进一步分析发现,各种群在IR区的突变较集中,该区域变异最强,突变频率在10~(-3)数量级水平。在MaYVV实验种群中,IR区突变位点主要集中在IR区3′端的2635位(主要是碱基G突变为碱基A);在MaYVYV自然种群中,除种群GX161外,其余种群的IR区突变位点主要集中在IR区3′端的2669位(主要是碱基C突变为碱基T)。推测这两个位点可能是突变热点。AC1和AC4重迭区比AC1非重迭区的变异水平低,表明MaYVV和MaYVYV种群在编码区的突变分布不均衡。两种病毒的变异类型以碱基C突变为碱基T为主,有少量碱基插入和缺失突变类型。
胡燕[4]2016年在《赛葵黄脉病毒（MYVV）和烟草曲茎病毒（TbCSV）及伴随β卫星之间的互作研究》文中指出已有研究发现,中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)和烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)伴随的β卫星均可被异源辅助病毒复制。但是,两者伴随同源或异源β卫星时诱导的症状明显不同,且病毒的积累量与症状严重程度不直接相关。用TYLCCNV和TbCSV伴随其β卫星同时侵染本氏烟及心叶烟,在整个侵染过程中两种病毒及卫星在本氏烟中始终存在,而TYLCCNV及其同源β卫星在心叶烟中仅侵染前期能检测到,后期均丢失。赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein virus,MYVV)与TYLCCNV属同一致病类型,其β卫星是引起典型症状所必需的;而TbCSV单独侵染即可引起典型症状,但伴随β卫星时症状加重。为了弄清不同致病类型的双生病毒/β卫星病害复合体之间的互作关系,本研究以MYVV的Y47分离物(Y47A)和TbCSV的Y35分离物(Y35A)及其伴随β卫星MYVB(Y47β)和TbCSB(Y35β)为研究对象,以本氏烟为寄主材料,开展了这两类双生病毒/β卫星病害复合体各组分之间的互作研究。根据MYVV和TbCSV及其伴随β卫星全基因组的保守序列,设计病毒及β卫星的特异性引物,以发病叶片DNA为模板,优化反应条件,建立了扩增病毒及β卫星的实时荧光定量PCR(qPCR)检测体系,并对其进行了灵敏性和重复性检验。以102-108copies/μL这7个浓度梯度的标准品DNA为模板建立标准曲线,结果表明,该标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率在90-110%之间,在qPCR扩增效率范围内;标准曲线的相关系数在0.998-1.000之间,说明该体系有较好的检测效能。该qPCR方法最低检测限为10 copies/μL,其灵敏度是常规PCR的100倍。将Y47A、Y47A+Y47β、Y47A+Y35β的侵染性克隆分别接种本氏烟,观察症状发现,单独接种Y47A的本氏烟不表现症状,接种Y47A+Y47β的本氏烟表现严重的向下叶卷,皱缩,黄脉,脉增厚等症状,接种Y47A+Y35β则表现植株矮化,茎严重扭曲,脉增厚,没有观察到黄脉和叶皱缩现象,Y47A侵染率为54.5%,Y47A+Y47β在本氏烟上的侵染率为100%,而Y47A+Y35β的侵染率则为72.7%,且显症时间(4d)也早于Y47A+Y35β(7d)。qPCR分析结果显示,接种Y47A+Y47β、Y47A+Y35β的本氏烟中Y47A的积累量均要高于单独接种Y47A的本氏烟,说明β卫星的存在提高了其辅助病毒Y47A的积累量。异源卫星Y35β伴随Y47A接种本氏烟时,Y35β可以稳定复制,但其复制水平低于接种Y47A+Y47β的本氏烟中Y47β的复制水平,表明伴随同一辅助病毒时异源β卫星的复制水平低于同源β卫星的复制水平。将Y47A+Y47β+Y35A+Y35β的侵染性克隆接种本氏烟,观察症状发现,本氏烟在侵染早期症状较严重,表现出皱缩、向下卷叶、黄脉、曲茎、矮化、脉突等症状,但在侵染后期与Y35A+Y35β引起的症状相似,黄脉症状消失。特异性检测表明,在整个侵染过程中,在接种本氏烟中均可扩增到Y35A和Y35β的特异性条带,积累量总体呈上升趋势,并在接种后90d达到最高值。而Y47A和Y47β的积累量在侵染过程中呈下降趋势,接种120d后检测不到Y47β,接种180d后Y47A也丢失,说明Y47A/Y47β病害复合体和Y35A/Y35β病害复合体在同一寄主内复制时存在竞争。在不同组合接种本氏烟中,接种60d后Y47A的积累量从高到低依次为:Y47A+Y47β、Y47A+Y47β+Y35A+Y35β、Y47A+Y35β和Y47A,再次证明β卫星与同源辅助病毒之间的互作特异性比与异源辅助病毒之间特异性更强,辅助病毒将优先支持其同源β卫星的复制。
刘培[5]2008年在《云南赛葵上双生病毒的分子鉴定》文中研究说明双生病毒在云南烟草、番茄以及赛葵、稀硷等多种作物和杂草上广泛发生,并已造成严重危害。杂草是双生病毒重要的中间寄主和初侵染源,为此我们对云南赛葵上的双生病毒开展了研究。Y278分离自云南保山的赛葵,全序列测定表明,它与赛葵黄脉病毒(MYVV)的同源性最高,仅为87.0%,因此它是双生病毒新种,命名为赛葵保山黄脉病毒(Malvastrum yellow vein Baoshan virus,MYVBSV)。序列比较发现MYVBSV可能是由MYVV和类似于黄花捻曲叶病毒(SiLCV)的病毒重组产生的。从云南赛葵样品Y277、Y278和Y281中分离到中国番茄黄曲叶病毒TYLCCNV的DNA-A序列及其伴随的DNAβ序列。对Y278 DNA-A分子和Y277、Y278、Y281的DNAβ分子进行了全序列测定。Y278 DNA-A序列和TYLCCNV-[Y264]同源性达100%;叁个DNAβ序列也和TYLCCNV伴随的DNAβ同源性最高,达97.0～99.7%。因此,赛葵是TYLCCNV的寄主。来自云南保山的赛葵样品Y277,全序列测定表明,它与云南赛葵黄脉病毒(MYVYNV)的同源性最高,为99.6%。构建了Y277 DNA-A的侵染性克隆。DNA-A单独接种以及DNA-A和MYVYNV DNAβ混合接种均可系统侵染本氏烟,DNAβ对于Y277 DNA-A的侵染不是必需的。DNAβ虽然不是症状的诱导因子,但伴随其辅助病毒DNA-A共同侵染时能加重病害症状,而且DNAβ可以显著增强DNA-A在植物中的积累。对来自云南不同地区表现黄脉症状的22个赛葵样品进行了复合侵染分析。检测结果显示,大部分样品受到两种以上病毒的侵染,而且大部分是以begomoviruses/DNAβ病害复合体的形式存在的。从云南不同地区的赛葵的多个样品分离到了赛葵保山黄脉病毒和中国番茄黄曲叶病毒的特异性片段,说明这两类病毒在赛葵上是普遍存在的。
胡浅浅[6]2016年在《宏基因组测序研究介体烟粉虱中的双生病毒多样性》文中进行了进一步梳理粉虱传双生病毒(whitefly transmitted geminiviruses, WTGs)属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属,由烟粉虱传播,危害多种重要经济作物。了解WTGs种类及生物学特性对病毒的防治具有积极的意义。本研究从传毒介体烟粉虱入手,结合宏基因组测序和分子生物学手段研究粉虱传双生病毒的种类和变异进化,以期了解我国粉虱传双生病毒的种群多样性,为粉虱传双生病毒的防治奠定基础。2011-2015年,我们从云南、广西、广东、海南、浙江和山东的多个地区共采集23批烟粉虱样品。从烟粉虱中提取病毒DNA并分为9个建库样品,利用Illumina Miseq测序平台进行病毒宏基因组测序。经contigs拼接和比对,9个建库样品都检测到多种粉虱传双生病毒。我们对检测结果进行PCR验证,共检测到18种病毒,8种betasatellites,2种alphasatellites,10种来源于病毒DNAA的缺陷型小分子和1种来源于betasatellite的缺陷型小分子。18种病毒中,一个为双生病毒新种,暂名为粉虱传双生病毒A(Whitefly Transmitted Geminiviruse A, WTGA),并在中国首次发现越南丁香黄脉病毒(Ludwigia yellow vein Vietnam virus, LuYVVNV)。云南省检测到11种病毒,分别为云南赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein Yunnan virus, MYVYnV)、中国番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl China virus, PaLCuCNV)、甘薯曲叶病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)、LuYVVNV、丁香黄脉病毒(Ludwigia yellow vein virus, LuYVV)、云南烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl Yunnan virus, TbLCYnV)、中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)、中国胜红蓟黄脉病毒(Ageratum yellow vein China virus, AYVCNV)、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curlvirus, TYLCV)、中国辣椒黄化曲叶病毒(Pepper yellow leaf curl China virus, PepYLCCNV)及病毒新种WTGA;广西检测到9种病毒,分别为PaLCuCNV、 AYVCNV、WTGA、MYVYnV、SPLCV、中国南瓜曲叶病毒(Squash leaf curl China virus, SLCCNV)、中国番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl China virus, ToLCCNV)、广西番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Guangxi virus, ToLCGxV)和雾水葛金色花叶病毒(Pouzolzia golden mosaic virus, PGMV);海南省检测到4种病毒,依次为SPLCV、SLCCNV、LuYVVNV和黄花稔曲叶病毒(Sida leaf curl virus, SiLCV);浙江省检测4种双生病毒,分别为TYLCV、SPLCV、乔治亚甘薯曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Georgia virus, SPLCGV)和河南甘薯曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Henan4 virus, SPLCHn4V);山东省检测到TYLCV。广东省的样品未检测到病毒。对其中13种病毒进行变异进化分析,结果发现,与植物中分离的同种双生病毒相比,来源于烟粉虱样品中的病毒分离物的同源性相对较高；其病毒序列的变异程度相对较低,并且两者的变异位点存在明显差异；系统关系树分析发现,分离自烟粉虱和植物的病毒都依据地域不同而形成不同的分支。从云南和广西的烟粉虱样品中分离到一个双生病毒新种,全长为2744 bp,与印度分离的巴豆黄脉花叶病毒(Croton yellow vein mosaic virus, CYVMV)同源性最高(87%),根据双生病毒分类命名原则,将其暂名为WTGA。WTGA是一个不含有卫星的单组份双生病毒,推测其可能是由CYVMV、云南南瓜曲叶病毒(Squash leaf curl Yunnan virus, SLCYnV)、假马鞭曲叶病毒(Synedrella leaf curl virus, SyLCV)、烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus, TbCSV)和泰国烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl Thailand virus, TbLCTHV)重组形成的。构建了WTGA的侵染性克隆,致病性测定发现,WTGA单独接种及与卫星TYLCCNB或AYVCNB共同接种本氏烟都能产生叶片上卷、皱缩、脉突、褪绿以及植株矮化等病毒症状,但与卫星共同接种,本氏烟提早3-4天显症,且症状较重。Southern印迹显示,WTGA单独或与卫星共同接种的植株中都能明显检测到WTGA的积累。从云南和海南的样品中分离到LuYVVNV,全长2762 bp,与越南分离物的同源性达到94.2%,这是LuYVVNV在我国的首次报道。LuYVVNV是一个不含有卫星的单组份病毒,具有典型的菜豆金色花叶病毒属病毒的基因组结构。构建了LuYVVNV的侵染性克隆,致病性测定发现,LuYVVNV单独接种及与卫星TYLCCNB或AYVCNB共同接种本氏烟,都能产生叶片下卷,皱缩、黄化以及植株矮化等症状,但与卫星共同接种时,本氏烟的病毒症状更为严重。Southern印迹显示,LuYVVNV单独或与卫星共同接种的植株中都能明显检测到LuYVVNV的积累。
张洁[7]2012年在《双生病毒卫星启动子的鉴定及病毒卫星症状决定因子分析》文中研究表明双生病毒是一类世界范围内广泛发生的植物单链DNA病毒,已在多个国家和地区的经济作物上造成严重危害。越来越多的双生病毒被报道伴随有betasatellite和alphasatellite,所有的betasatellite在其互补链上都编码一个保守的βC1ORF,而所有的alphasatellite在其病毒链上都编码一个复制相关蛋白Rep。本文通过农杆菌介导的瞬时和转基因表达的方法,对赛葵黄脉病毒伴随betasatellite (Malvastrum yellow vein betasatellite, MYVB)、中国番茄黄曲叶病毒伴随betasatellite (Tomato yellow leaf curl China betasatellite, TYLCCNB)以及烟草曲茎病毒伴随alphasatellite (Tobacco curly shoot alphasatellite, TbCSA)的启动子相继进行了鉴定,并初步研究了卫星启动子对病毒复制和致病性的影响。通过荧光光度法对MYVB βC1基因上游全长非编码区(991nt)进行了分析,瞬时表达结果表明991nt的片段具有启动子活性,是花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus, CaMV)35S启动子活性的29%。利用缺失突变的方法在MYVB PCI基因上游390nt到418nt的位置鉴定了一个对启动子活性具有重要调控作用的5UTR Py-rich stretch元件,该元件的缺失使得βC1基因的启动子活性下降到CaMV35S启动子活性的11%。进一步构建了缺失5UTR Py-rich stretch的MYVB病毒侵染性克隆,以赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein virus, MYVV)为辅助病毒,将突变体和野生型卫星分子分别先后侵染本氏烟叶盘和接种植株,Southern blot结果表明5UTR Py-rich stretch的缺失使得卫星分子的积累量有明显下降,分别下降为野生型的61%和62%,但是对病毒诱导的症状表型没有显着影响。通过荧光光度法和组织化学法对TYLCCNB-Y25βC1基因上游全长非编码区(982nt)进行了分析,结果表明982nt的片段表现CaMV35S启动子活性的44%,并且驱动GUS基因在转基因普通烟草中组成型表达。将982nt的片段串联后,瞬时表达结果表明GUS荧光活性提高到CaMV35S启动子的59%左右。鉴于之前的报道显示TYLCCNB-βC1启动子为韧皮部特异性表达,我们的结果证实双生病毒伴随的同一个卫星分子的不同分离物的βC1启动子在表达活性和表达模式上可能存在差异。侵染性分析实验显示,以中国番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)为辅助病毒时,TYLCCNB-Y25在本氏烟、叁生烟、心叶烟以及番茄等寄主上能够引起曲叶症状,而TYLCCNB-Y10除引起曲叶外还能引起耳突、黄脉及茎秆扭曲等症状。为了明确βC1启动子的表达模式是否与症状相关,通过overlap extension PCR的方法对上述两个卫星分子βC1基因上游的全长非编码区(即启动子区)及βC1基因上游约200nt的片段(简称为片段PP, part promoter)进行了互换,构建嵌合体卫星的侵染性克隆,与辅助病毒TYLCCNV共同接种本氏烟。结果表明,嵌合有TYLCCNB-Y25启动子的TYLCCNB-Y10重组卫星分子跟野生型TYLCCNB-Y10类似,在寄主上诱导产生耳突和茎秆扭曲的症状；而嵌合有TYLCCNB-Y10启动子的TYLCCNB-Y25重组卫星分子在寄主上却仅诱导曲叶的症状,与野生型TYLCCNB-Y25类似。同样,互换PP区段的嵌合体卫星几乎未对病毒诱导症状表型产生影响。以上结果说明TYLCCNV伴随不同卫星分子编码的pC1蛋白对症状诱导起决定性作用,启动子对症状差异影响较小。为了明确症状差异的较小决定因子,进一步利用overlap extension PCR的方法构建了βC1叁个区段(C末端,M部分,N末端)的嵌合体卫星分子,分别构建嵌合体卫星侵染性克隆,以TYLCCNV为辅助病毒接种本氏烟,结果发现,嵌合有TYLCCNB-Y10βCl的C末端部分的TYLCCNB-Y25分子获得了诱导耳突和茎秆扭曲的能力,但耳突的数量和大小都有所减少或变小,说明TYLCCNB-Y10αCl的C末端部分是诱导耳突和茎秆扭曲等表型所必需,而pcl的其他区段也能影响症状诱导。利用GUS报告基因对TbCS A Rep基因翻译起始位点上游420nt的片段进行了瞬时和转基因表达分析,结果表明,420nt片段的平均相对GUS活性是CaMV35S启动子的18%,并且在转基因烟草中组成型表达。通过缺失突变的方法发现,5’端缺失的系列启动子表达载体表现高低不同的活性,其中215nt的片段具有基础启动子活性,227nt片段表现与420nt片段相一致的活性；而3’端缺失56nt的片段基本丧失了启动子活性。
李静[8]2010年在《我国六种双生病毒的分子鉴定及两种病毒的致病性研究》文中研究表明双生病毒是植物病毒中唯一一类具有孪生颗粒形态的单链DNA病毒,已在多个国家和地区的多种重要经济作物上造成毁灭性危害。自20世纪90年代起,我国的云南、广东、广西、海南和台湾等地的作物及杂草上已相继发现了多种双生病毒。为进一步了解双生病毒在我国的种类、分布及危害,本论文对我国江苏、浙江和云南地区发生的双生病毒进行了分子鉴定并对部分病毒进行了致病性研究。从江苏宜兴采集了2份表现黄花叶症状的苎麻样品(J4和J5),从浙江余杭采集了1份表现黄花叶症状的苎麻样品(Z1),利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500 bp的DNA-A部分片段,其核苷酸序列相似性为91.6-99.2%。选择代表性分离物J4和Z1进行全序列测定,结果显示J4和Z1 DNA-A全长分别为2736和2737 nts(登录号FN396969和FN396971)。利用PCR检测到DNA-B组份,J4和Z1 DNA-B全长分别为2717和2719 nts(登录号FN396970和FN396972)。核苷酸序列比较表明,J4和Z1 DNA-A相似性为94.7%,DNA-B相似性为88.6%。J4和Z1的两个组份都与苎麻花叶病毒(Ramie mosaic virus, RamMV)不同分离物的相似性最高,DNA-A之间的相似性为93.6-94.7%, DNA-B之间的相似性为90.6-91.2%。因此,认为J4和Z1是RamMV的两个不同分离物。这是首次在江苏和浙江地区报道双组份双生病毒。从江苏宜兴采集的表现黄花叶症状的大青样品(YX1,YX2和YX3)中分离出两种双生病毒。利用双生病毒特异性引物PA/PB对3个分离物扩增的约500 bp片段的核苷酸序列相似性为59.8-99.4%,确定3个大青样品中都存在两种双生病毒复合侵染。随机选择YX2分离物扩增两种病毒全长基因组DNA-A,序列测定表明‘YX2-Ⅰ和YX2-Ⅱ全长分别为2753和2775 nts(登录号FN396966和FN396962),它们之间的核苷酸序列相似性仅为68.2%。与其它已报道的双生病毒进行比较发现,YX2-Ⅰ与软枝黄婵曲叶病毒(Allamanda leaf curl virus, AILCV)的分离物A1LCV-[CN:G10:06]的相似性最高,为79.7%；YX2-Ⅱ与中国大青金色花叶病毒(Clerodendrum golden mosaic China virus, C1GMCNV)的分离物C1GMCNV-[CN:Fz7:08]的相似性最高,为93.0%。根据双生病毒“种”的分类标准,YX2-Ⅰ是一个双生病毒新种,将其命名为江苏大青金色花叶病毒(Clerodendrum golden mosaic Jiangsu virus, CIGMJSV);而YX2-Ⅱ为C1GMCNV的一个分离物。利用RCA-RFLP鉴定出与YX2-Ⅱ伴随的DNA-B组份,基因组全长为2728 nts(登录号FN396963),证实YX2-Ⅱ是一个双组份双生病毒。利用PCR检测方法,未能在3个样品中发现卫星分子DNAβ的存在。为进一步验证C1GMJSV和C1GMCNV的致病性,分别构建了两种病毒的侵染性克隆,发现CIGMJSV单独接种即可在本氏烟、心叶烟、叁生烟、矮牵牛和番茄上诱导典型的病害症状,并能和异源病毒的卫星分子(Tobacco curly shoot betasatellite, TbCSB)在本氏烟中致病；对C1GMCNV的致病性测定表明,C1GMCNV DNA-A单独可以系统侵染本氏烟、心叶烟和叁生烟等寄主植物,但是其不足以诱导典型的病害症状,而C1GMCNV DNA-A+DNA-B混合接种时能在本氏烟、心叶烟和叁生烟中诱导产生双生病毒侵染的典型症状。此外,双组份双生病毒C1GMCNV DNA-A能够与TbCSB在本氏烟和心叶烟中进行功能互作。从云南宝山采集了2份表现为黄脉症状的黄花稔样品(Y340和Y341),利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500 bp片段。对这些片段进行克隆和测序发现,Y340中存在两种双生病毒复合侵染(Y340-Ⅰ和Y340-Ⅱ)；而Y341感染了一种双生病毒,并且与Y340-Ⅰ属于同一类型。Y340-Ⅰ和Y341DNA-A全长均为2750nts(登录号FN806777和FN806778),与洋麻曲叶病毒(Kenaf leaf curl virus, KeLCuV)不同分离物具有最高的核苷酸序列相似性,为90.5-91.0%,根据双生病毒分类原则,Y340-Ⅰ和Y341为KeLCuV的两个不同分离物；Y340-ⅡDNA-A全长为2745 nts(登录号FN806779),其与赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein virus, MaYVV)不同分离物和宝山赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein Baoshan virus, MaYVBsV)不同分离物的核苷酸序列相似性均较高,分别为87.2-89.7%和88.5-89.2%,但系统关系分析表明Y340-Ⅱ与MaYVBsV的亲缘关系更近,因此,将Y340-Ⅱ暂定为MaYVBsV的一个分离物。这也是首次报道KeLCuV和MaYVBsV侵染黄花稔寄主。重组分析发现,Y340-Ⅰ和Y340-Ⅱ可能是由重组产生的。进一步利用PCR检测发现,Y340和Y341样品中都含有卫星分子DNAβ,全长分别为1342和1341 nts(登录号FN806780和FN806781),核苷酸序列比对后发现均与云南赛葵黄脉病毒卫星分子DNAβ(Malvastrum yellow vein Yunnan betasatellite, MaYVYnB)不同分离物的相似性最高,达81.7-83.4%。根据双生病毒DNAβ种的划分标准,Y340β和Y341β属于MaYVYnB的两个不同分离物。在Y340样品中还分离到了DNA1分子,Y340 DNA1全长为1370 nts(登录号FN806782),与其它已报道的DNA1分子的核苷酸序列相似性相对较高,为61.4-82.2%，而与矮缩病毒属病毒(nanoviruses)的相似性仅为28.4-30.0%。从采自云南瑞丽地区表现黄脉症状的锐叶牵牛样品(Y335-338)中分离到了双生病毒。利用双生病毒简并引物BegoAForl/BegoARevl对4个分离物扩增的约1.2 kb片段的相似性为97.9-99.5%。随机选择Y338分离物进行全序列测定(登录号FN806776)及检测分析,发现样品中只含有单组份双生病毒,并且与云南地区报道的甘薯卷叶病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)分离物SPLCV-[CN:RL31:07]的相似性最高,为97.8%，因此认为Y335-338属于SPLCV的不同分离物。该类病毒在亲缘关系上与旧世界双生病毒更为接近,但是它们在进化树上形成相对独立的分支。
郭维[9]2008年在《叁种双生病毒及其伴随卫星DNA的致病性研究》文中研究表明双生病毒是一类世界范围内广泛发生的植物单链DNA病毒,已在多个国家和地区的作物上造成毁灭性灾害。近年来的研究发现,很多单组份双生病毒伴随有诱导典型症状所必需的卫星DNAβ分子。这类卫星DNAβ分子与其辅助病毒形成了一种新型的病害复合体,给亚洲和非洲地区的农作物生产造成了巨大损失。为了更好的了解双生病毒的致病机理,本论文围绕叁种双生病毒及其卫星DNAβ的致病性进行了研究:1.与赛葵黄脉病毒相伴随的卫星DNAβ的分子变异及致病性研究目前对双生病毒伴随的卫星DNAβ的变异研究主要集中在来自不同寄主的卫星DNAβ之间,本论文则对来自我国云南省不同地区赛葵上的20个与赛葵黄脉病毒(MYVV)相伴随的卫星DNAβ进行了克隆、测序和遗传变异分析,发现这些卫星DNAβ之间虽然变异较小,但是仍然具有按地理分布聚类的特征。侵染性测定表明卫星DNAβ对于MYVV在本氏烟、心叶烟、矮牵牛和赛葵上引起典型的病害症状是必需的。进一步将MYVV与泰国番茄黄化曲叶病毒(TYLCTHV)DNAβ或中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)DNAβ共同接种本氏烟,发现MYVV可以支持异源双生病毒的卫星DNAβ在本氏烟中进行转录复制和系统移动,且病毒DNA在组织中的积累量与产生症状的严重程度呈正相关。2.中国番茄曲叶病毒及其卫星DNAβ的分子鉴定和致病性研究利用菜豆金色花叶病毒属病毒的简并引物,对从广西省采集的表现出叶片下卷等症状的番茄样品(G16、G17和G18)进行了PCR检测,经过克隆、测序发现这些样品均感染了双生病毒。对所得到的部分病毒基因组序列进行联配比较后发现它们具有96.6%到98.5%的序列同源性,表明它们感染了同一个双生病毒。因此对其中的G16和G18分离物进行了病毒全基因组序列测定,发现G16和G18的全长分别为2729个核苷酸(AJ704602)和2733个核苷酸(AJ558119),它们之间的序列同源性达到98.7%。与其它已报道的双生病毒进行比较发现,G16和G18与越南番茄曲叶病毒的相似性最高,分别为83.6%和82.8%。根据双生病毒“种”的分类标准,G16和G18代表同一个双生病毒新种的不同分离物,因此我们将这个双生病毒新种命名为中国番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Chinavirus,ToLCCNV)。系统进化及重组分析发现ToLCCNV可能是一个由重组产生的新病毒。进一步通过PCR的方法发现这些分离物中都含有卫星DNAβ,并对其全序列也进行了测定。序列测定表明与G16、G17和G18叁个分离物伴随的DNAβ的全长分别为1346个核苷酸、1341个核苷酸和1342个核苷酸(AJ704610-AJ704612)。与其它已报道的卫星DNAβ的序列比较发现这三个DNAβ分子都与中国番茄黄化曲叶病毒Y8分离物的DNAβ具有最高的同源性,分别达到49.1%、49.1%和49.8%。同时,为了研究卫星DNAβ的致病性及生物学功能,构建了ToLCCNV-G18及其伴随的卫星DNAβ的侵染性克隆,致病性测定发现卫星DNAβ是ToLCCNV诱导产生典型的病害症状所必需的,同时其还能提高ToLCCNV在寄主植物中的积累量。利用农杆菌共浸润等方法发现ToLCCNV DNAβ编码的βC1蛋白为RNA沉默抑制子。同时为了明确βC1蛋白中维持RNA沉默抑制子功能的关键氨基酸基序,根据生物信息学预测的结果构建了7个不同区段缺失的βC1突变体。农杆菌共浸润试验、Northern及Western印迹杂交结果表明βC1蛋白的44-74位氨基酸构成的中心结构域(central domain)对于维持βC1抑制子活性是至关重要的。由于目前已报道的大多数RNA沉默抑制子也是致病因子,所以又构建了7个βC1不同区段缺失的DNAβ的突变体的侵染性克隆。侵染性测定发现所有的突变体都可以在ToLCCNV的辅助下系统侵染本氏烟,但是均不能诱导产生明显的症状,表明βC1蛋白的任何一段氨基酸序列都是其诱导产生典型病害症状所必需的。Southern印迹杂交分析发现虽然所有的突变体都能够在本氏烟中复制并且各个突变体之间的复制水平以及对辅助病毒的影响不尽相同,但是总体来说它们的复制水平远远低于野生型DNAβ的复制水平。以上实验结果表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性并不是其诱导产生病害症状的决定因素。为了确定βC1蛋白及其突变体的亚细胞定位,利用激光共聚焦显微镜对βC1及其突变体与GFP的融合蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位进行了研究。结果发现不具备RNA沉默抑制子活性的突变体βC1~(dm44-60)和βC1~(dm61-74)也不能在细胞核中定位,而野生型及其它突变体βC1则均能在细胞核和细胞质中定位,表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性与其能否在细胞核中定位有关,其44-74位氨基酸构成的中心结构域对于维持βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性和在细胞核中的定位都是必需的。从ToLCCNV单独接种或与其卫星DNAβ共同接种的本氏烟中克隆到了11个病毒或卫星DNAβ来源的小RNA。进一步的分析发现这些来源于病毒的小RNA主要集中在CP的转录区和βC1的转录区,表明病毒可能具有产生小RNA的热点区。3.泰国番茄黄化曲叶病毒是一个伴随有卫星DNAβ的单组份双生病毒泰国番茄黄化曲叶病毒(TYLCTHV)引起的番茄黄化曲叶病是影响泰国番茄生产最重要的病害之一,为了明确该病毒到底是单组份双生病毒还是双组份双生病毒,构建了TYLCTHV-Y72分离物及其伴随的卫星DNAβ的侵染性克隆。致病性测定表明TYLCTHV可以单独侵染本氏烟、心叶烟和番茄并诱导产生典型的症状,但是当与其卫星DNAβ共同接种时则能够加重病害症状,并且可以提高病毒在植物组织中的积累量。根据以上实验结果以及之前的相关报道,我们认为TYLCTHV是一个伴随有卫星DNAβ的单组份双生病毒。4.广西番茄曲叶病是由两种双生病毒及卫星DNA复合侵染引起的通过PCR、Southern印迹、RCA-PCR以及测序等方法对采自广西省表现出曲叶症状的31个番茄样品进行了复合侵染检测,发现双生病毒的复合侵染是导致广西省番茄曲叶病的重要原因。所有检测的样品中均含有ToLCCNV和中国番木瓜曲叶病毒(PaLCCNV)两种病毒,同时还伴随有ToLCCNV DNAβ或者TYLCCNV DNAβ。
阮涛[10]2012年在《我国叁种寄主上双生病毒的分子鉴定及序列分析》文中认为双生病毒是—类单链环状DNA病毒,已在世界范围内的多种作物上造成严重危害。自20世纪90年代起,双生病毒已在我国的云南、广西、海南和台湾等多个地区的作物和杂草上发生。为进一步明确我国双生病毒的种类分布及危害,本研究对我国云南巧家辣椒和赛葵,以及陕西番茄和四川赛葵上的双生病毒进行了分子鉴定。从云南巧家地区表现为黄化曲叶症状的辣椒上分离到病毒分离物YN57和YN65, DNA-A全序列分析表明,YN57和YN65 DNA-A全长均为2748 nts,具有典型的双生病毒科(Geminiviridae)基因组DNA-A结构特征,共编码6个ORFs,其中病毒链编码AVI (CP)和AV2共2个ORFs,互补链编码AC1、AC2、AC3和AC4共4个ORFs;利用BLAST程序对DNA-A进行分析表明,YN57 DNA-A和YN65 DNA-A均与云南赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein Yunnan virus, MYVYNV) Y160分离物(AJ786711.1)的相似性最高,分别为82.5%和82.4%,与中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV) Y194分离物(AJ971265.1)次之,分别为79.7%和79.8%,而与其它双生病毒的相似性在79.7%以下,表明YN57和YN65是双生病毒的一个新种,暂命名为中国辣椒黄化曲叶病毒(Pepper yellow leaf curl China virus, PYLCCNV); RDP序列重组分析表明YN65 DNA-A是由MYVYNV-160和TYLCCNV-Y194重组产生；利用双生病毒卫星DNAβ的通用引物beta01/beta02,从YN57和YN65中均能扩增到DNAβ分子；序列分析表明,YN57 DNAP和YN65 DNAβ均与卫星MYVYNB (MYVYNV伴随的]ONAβ)相似性最高,在97.0%～99.1%之间,表明巧家辣椒上分离到的PYLCCNV伴随异源卫星分子MYVYNB.从陕西泾阳地区的番茄上采集到73份表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄黄化曲叶病(Tomato yellow leaf curl disease, TYLCD)样品,利用双生病毒简并引物PA/PB和番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)的通用引物TYT-F/TYT-R进行PCR扩增,共有70个样品检测呈阳性；利用双生病毒DNA-B及卫星DNA的通用引物,未扩增到相应目标条带；随机选取样品SX8,利用滚环扩增PCRCRCA-PCR)、克隆及测序等技术获得病毒DNA-A的全基因组序列,该DNA-A分子全长2781 nts(JN412854.1),与来自山东番茄的TYLCV-SD2(GU199587.1)的核苷酸序列相似性最高,为99.9%；系统进化分析发现,该病毒分离物与我国已报道的TYLCV各分离物亲缘关系较近。这些结果表明,陕西番茄黄化曲叶病是由TYLCV侵染引起,该病毒可能来源于我国山东番茄上的TYLCV。为了明确云南巧家及四川米易赛葵上的双生病毒种类及复合侵染情况,基于RCA-PCR技术,利用双生病毒DNA-A、DNA-B及卫星DNA的通用引物对31个表现黄脉症状的赛葵样品进行了针对WTG的检测,从中分离到MYVYNV、TYLCCNV、MYVV等3种病毒,其中得到的4个MYVYNV分离物均与MYVYNV-Y160相似性最高,在99.3%-99.7%之间,得到的2个TYLCCNV分离物均与TYLCCNV-Y194相似性最高,分别为99.2%和99.7%,得到的1个MYVV分离物与MYVV-Y206相似性最高,为99.2%。DNAβ检测结果显示,除YN86外,25个对WTG检测呈阳性的样品均伴随有DNAβ分子,序列分析表明这些DNAβ分子可分为两类,分别与MYVYNB-Y160 (98.4%～98.7%)和MYVB-Y197 (98.5%～98.7%)的序列相似性最高；未扩增到DNA-B组分及DNAα分子。复合侵染检测结果表明,巧家及米易地区赛葵上的复合侵染率分别为78.57%和72.72%。这些结果表明赛葵样品中双生病毒复合侵染严重,病毒DNA-A与卫星DNAβ以病害复合体形式存在,且卫星DNAβ可伴随异源辅助病毒。
参考文献：
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[4]. 赛葵黄脉病毒（MYVV）和烟草曲茎病毒（TbCSV）及伴随β卫星之间的互作研究[D]. 胡燕. 西南大学. 2016
[5]. 云南赛葵上双生病毒的分子鉴定[D]. 刘培. 浙江大学. 2008
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[7]. 双生病毒卫星启动子的鉴定及病毒卫星症状决定因子分析[D]. 张洁. 浙江大学. 2012
[8]. 我国六种双生病毒的分子鉴定及两种病毒的致病性研究[D]. 李静. 浙江大学. 2010
[9]. 叁种双生病毒及其伴随卫星DNA的致病性研究[D]. 郭维. 浙江大学. 2008
[10]. 我国叁种寄主上双生病毒的分子鉴定及序列分析[D]. 阮涛. 西南大学. 2012