（青岛市立医院药剂科 山东青岛 266071）
摘要:本文通过酶解法来提取藤茶中的二氢杨梅素，并通过紫外-可见分光光度法测其含量。对酶解法的各影响因素进行单因素试验，并通过正交试验对提取工艺进行了优化。结果表明酶解法提取的最佳工艺条件为：酶解温度为50℃，酶解时间为3个小时，酶用量为6mg，pH为4.5。此条件下二氢杨梅素的提取率为33.37%。该工艺稳定可行，为藤茶中二氢杨梅素的提取开辟了新途径。
关键词：藤茶;二氢杨梅素;提取工艺;正交试验
Abstract: Dihydromyricetin was extracted from ampelopsis by enzymatic hydrolysis extraction method and determined by ultraviolet spectrophotometric method. The influence factors of enzymatic hydrolysis single factor experiment was carried out and the extraction process was optimized by orthogonal test .The best extraction temperature,extraction time,enzyme dosage and pH value were 50℃，3h，6mg and 4.5，respectively.Under this condition,the extraction yield of dihydromyricetin was 33.37%.This method，which is stable and feasible, have open a new avenues of research for the extract of dihydromyricetin from ampelopsis grossedentata.
Keywords: Ampelopsis grossedentata; Dihydromyricetin; Extraction process; Orthogonal test
藤茶, 植物学名显齿蛇葡萄野生藤本植物[Ampelopsis grossedentata ( Hand - Mazz) W. T. Wang] , 主要分布于我国湖南、湖北、云南、贵州、广东、广西、福建等地,在湖南、湖北等省已有一定规模的人工栽培[ 1,2] 。藤茶为药食两用植物, 最初作为一剂草药应用于民间[ 3] 。因其外观和冲饮的口感特征, 而有“白猴”、“ 甘露茶”、“茅岩霉茶”、“野藤茶”、“龙须茶”等俗称[ 4, 5] 。全株药用, 味甘、淡、性凉, 具有清热解毒、祛风湿、强筋骨等功效。目前已对藤茶的化学成分进行了比较系统的研究，为藤茶的开发利用提供了理论基础。到目前为止已经分离出数十种化合物。目前对藤茶的化学成分研究主要集中在黄酮类化合物，黄酮类化合物为藤茶的主要成分，也是藤茶的主要活性成分，主要包括二氢杨梅素（dihydromyricetin）和杨梅素。二氢杨梅素的结构式如下图所示：
植物黄酮类化合物的提取, 以溶剂浸提法为主[ 13 ] 。在溶剂浸提的基础上, 辅以超声波、微波手段, 以强化提取效果。藤茶中的两种主要黄酮成分均属多羟基黄酮醇类化合物, 具极性, 易溶于热水、乙醇等, 迄今为止, 对藤茶黄酮, 尤其是二氢杨梅素的提取, 以热水提取、乙醇回流提取为主, 以超声波或微波加以辅助。传统的提取分离法存在着有效成分提取率低、杂质清除率低，能耗高、生产周期长等缺点，使天然药物提取工艺的发展受到制约。随着工业工程技术的迅猛发展，一些现代高新技术不断被应用到天然药物生产中，尤其是酶技术不断在天然药物行业得到应用，酶解技术在天然药物提取中能显著提高目标成分的浸出率，比传统提取方法具有明显的优势。
本文以纤维素酶酶解藤茶叶细胞壁，采用热水浸提法提取藤茶中总黄酮物质。藤茶中总黄酮以二氢杨梅素得率为指标单因素实验条件，并进一步研究了酶量、温度、时间、PH等因素四因素三水平正交实验，对提取工艺条件进行了优化，得出一条最佳的提取工艺。
1 实验部分
1.1 实验材料
1.1.1 实验仪器
DJ_200A型电子天平（亚太电子天平厂）；电子万用电炉 （北京中兴伟业仪器有限公 司）；SHZ-D(iii)型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂)；电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；超声清洗机（宁波市海曙达胜超声波仪器厂）；玻璃砂芯过滤过滤装置（上海新亚净化器件厂）；SPD-20A-230V型高效液相色谱仪（岛津制造所）。
1.1.2 实验原料与试剂
藤茶叶（贵阳省农科院提供）；二氢杨梅素标准品（纯度>98%）(上海佳和生物科技有限公司)。
无水乙醇（AR，重庆川江化学试剂厂）；丙酮（AR重庆川江化学试剂厂）；甲醇（DK，重庆川江化学试剂厂）；磷酸（AR，天津市登科化学试剂有限公司）；Alcl3 （AR 成都市科龙化工试剂厂）；冰醋酸（AR，天津恒兴化学试剂制造有限公司）；无水乙酸钠 （AR，天津恒兴化学试剂制造有限公司）；纤维素酶(北京东华强盛生物科技有限公司)；
水为蒸馏水。
2 实验方法
2.1 二氢杨梅素含量的测定
2.1.1 二氢杨梅素样品液制备
称取藤茶5g,加入一定量的纤维素酶在一定温度，一定PH浸泡一定时间，然后再沸水中热提取，趁热用100目的双层滤布过滤，收集滤液，95%乙醇100ml定容备用。
2.1.2 对照品的制备
精密称取二氢杨梅素标准品4.169mg,于100ml容量瓶中加95%乙醇充分震荡溶解得得41.69μg/ml二氢杨梅素标准液备用。
2.1.3测定波长的选择
精确量取0.3ml二氢杨梅素标准液加入10ml的容量瓶中，准确加入3mL 5%ALCL3，用95%乙醇定容至刻度，混合摇匀，室温放置40min，空白组以3mL5%ALCL3，用95%乙醇定容至刻度。在200—400nm范围内扫描,所得结果见图1。
2.1.4 标准曲线的制备
取洁净的10mL容量瓶，用移液枪准确量取按2.2.2制备的二氢杨梅素标准品对照液1mL,1.5mL,2 mL，2.5mL,3mL,准确量取3mL 5%ALCL3加入容量瓶，用95%乙醇定容至刻度，混合摇匀，室温下放置40分钟，按2.2.3测定的最大吸收波长，测吸光度，以二氢杨梅素对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，所得结果见图2。
2.1.5 重复性试验
按绘制标准曲线的测量方法，分别准确量取待测样品液4份，测定标准液的吸光度。所得结果见表1。
2.1.6 稳定性试验
准确量取待测样品液，按绘制标准曲线的测量方法，每隔半小时测定其吸光度，共测四次。所得结果见表2。
2.1.7样品中二氢杨梅素含量测定
准确量取1mL上述样品液注入100mL容量瓶中95%乙醇至刻度，然后从中量取1mL注入100mL容量瓶中95%乙醇至刻度，再从中量取0.4mL注入10mL容量瓶中，按上述测定吸光度方法在最大吸光度处测定其吸光度。
2酶解法提取二氢杨梅素正交实验
运用L9（34）正交表，进行酶解温度，时间，PH值，酶用量四个因素三个水平的正交实验，确定酶解法提取二氢杨梅素的最佳提取工艺。所得结果见表3、表4。
3 结果讨论
3.1 波长选择
最大吸收波长的选择由图可知样品和对照品的吸收图谱一致，都在311nm处有最大吸收，因此选择检测波长为311nm.
3.2标准曲线的绘制
经测得二氢杨梅素标品吸光度如图表2所示，以吸光度纵坐标Y,标品浓度为横坐标X进行作图，得回归方程 Y=0.0608X+0.0039,R2=0.9990,标准曲线见图2。结果表明二氢杨梅素在4.169-12.507μg/ml范围内与吸光度呈良好线性关系。
3.3二氢杨梅素重复性实验
从表中我们可以看到根据正交结果所确定的最佳提取工艺相对稳定，以最佳提取工艺提取得的藤茶中二氢杨梅素的平均得率为33.37%。因此确定二氢杨梅素的最佳提取工艺是：准确称取藤茶5g于烧杯中，加入纤维素酶6mg，调节pH为4.5，放入温度恒定为50℃的水浴锅中反应3个小时。用100目的双层虑布过滤，收集滤液，结晶、重结晶得到固体。
4 结论
本文用纤维素酶分解藤茶叶细胞壁，使藤茶叶中的二氢杨梅素溶解出来。通过对酶解温度，酶解时间，酶用量和pH几个因素进行了单因素试验和正交试验来探寻最佳工艺条件，得出的最佳参数为：酶解温度为50℃，酶解时间为3h，酶用量为6mg，pH为4.5。相比于之前研究的热水提取法而言，该方法高效且更加节约能源，藤茶中的二氢杨梅素提取率为33.37%，高于热水浸提法，该方法为藤茶中二氢杨梅素的提取提供了一条新思路。
参考文献
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论文作者:安丰田,王剑, 苏家茹
论文发表刊物:《中华急诊医学杂志》2016年6月
论文发表时间:2016/12/9
标签：光度论文; 乙醇论文; 正交论文; 工艺论文; 标准论文; 解法论文; 黄酮论文; 《中华急诊医学杂志》2016年6月论文;