1.天津市人民医院普外科 天津市 300121;2.天津市人民医院肛肠外科 天津市 300121;
3.天津市人民医院病理科 天津市 300121
摘要：目地：探讨研究Delta样配体4（Delta like ligand-4，DLL4）在结直肠癌组织中的表达水平与结直肠癌患者预后关系。方法：收集2010 年1月至2010年9月间天津市人民医院外科已行手术治疗90例结直肠癌病理组织，采用免疫组化的方法检测标本中DLL4蛋白表达水平，结合临床随访分析DLL4蛋白表达水平与结直肠癌患者预后的关系。结果：通过免疫组化发现，所有患者中DLL4表达均有表达。DLL的表达水平与肿瘤侵润程度及淋巴结转移情况相关，随着DLL4的表达水平的升高，患者的生存期及无病生存期均明显减低。高表达组总生存时间及无病生存期时间均较低表达组明显减低（P<0.05）。DLL4在肿瘤组织中的表达强度及淋巴结转移是影响结直肠癌预后（总生存期）的独立危险因素。结论：在结直肠癌患者中，DLL4表达水平在结直肠癌组织中表达水平与患者预后密切相关，表达水平越高，患者预后越差。
关键词：DLL-4；结直肠癌；预后
结直肠癌系人类最常见的恶性肿瘤之一，近年来中国大肠癌的发病率和病死率迅速增长且发病年龄明显提前。在已经发现的肿瘤分子信号通路中，Notch信号通路可与促使肿瘤发生发展的其他通路相互作用，调节肿瘤细胞的增殖与进展。Notch途径的受体Notch1在结直肠癌中的高表达是其独立的预后影响因素[1]。Notch配体Delta样配体4（Delta like ligand-4，DLL4）是5个配体中唯一特异性存在于内皮细胞的配体，在正常机体及肿瘤血管形成的过程中发挥着重要功能。
目前已有多项研究检测DLL4在各种恶性肿瘤中的表达水平，并证实在消化系统恶性肿瘤如胃癌、胰腺癌、胆管细胞癌和胆囊癌以及肺癌、乳腺癌、卵巢癌等患者中DLL4的表达水平与预后明显相关[2-8]。然而DLL4在结直肠癌中的表达及与预后相关性却鲜见报道。本研究收集2010 年1月至2010年9月间我院手术治疗90例结直肠癌病理组织，采用免疫组化的方法检测标本中DLL4的表达水平，结合临床随访分析DLL4的表达水平与结直肠癌患者预后的关系。
1、材料与方法
1.1、肿瘤标本组织芯片制备
收集90例天津市人民医院2010年1~2010年9月经手术病理证实的结直肠癌的肿瘤组织蜡块。所有患者均未进行新辅助治疗。所有患者接受R0切除手术，检获淋巴结数目均大于15枚。根据HE切片对石蜡标本中有代表性的点进行标记，包括典型的肿瘤和邻近的正常组织。制备受体蜡块，在组织芯片制作机上用细针对受体蜡块打孔，同样在供体蜡块上标记的相应部位打孔采集组织芯。将组织芯转移到受体模块的孔中。将构建好的TMA芯片蜡块放在相宜的塑料盒子内，并严密固定防止移位。放入55℃温箱中约10分钟，在蜡将要完全溶解前，取出室温下冷却，使受体模块的蜡与新插入的小圆柱状组织溶为一体，取下蜡块，于4℃冰箱中保存备用。切片、烤片，-20℃保存备用。
1.2、DLL4免疫组化染色
将组织芯片进行逐步脱蜡和水化，并进行抗原修复：电炉加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。采用免疫组化染色SP法：滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体；滴加Ι抗50μl，室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时；PBS洗3次每次2分钟；滴加Ⅱ抗45-50μl，室温静置或37℃1小时；PBS洗3次各5分钟；DAB显色5-10分钟；PBS或自来水冲洗10分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗10-15分钟；脱水、透明、封片、镜检。
1.3、病理阅片及免疫组化结果判定
由两位病理科医师对免疫组化的结果进行独立评估。在高倍镜（×200）下，随机取5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，按阳性细胞数的平均百分数进行计分。0.0％～5.0％记0分，5.1％～25.0％记1分，25.1％～50.0％记2分，50.1％～75.0％记3分，>75.0％记4分。染色强度按多数阳性细胞呈现的染色特征计分。未着色记0分，染色呈淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。最后根据阳性细胞的百分比和染色强度计分之和进行结果判定。≤4分判定为低水平表达，≥5分判定为高水平表达。
1.4、临床随访
自手术当天起开始计算生存时间。通过门诊、信访、电话以及再入院等方式对病人进行随访，并收集患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、TNM分期肿瘤标记物CEA、CA199等信息。以患者死亡或失访定为随访结束点。
1.5、统计方法
采用SPSS19.0统计软件包（Chieago，IL，USA）进行统计学分析。组间比较采用LSD-T检验，两者相关性用非参数Spearman等级相关分析。Kaplan-Meier法计算病人的生存时间，Log-rank法比较不同分组病人的生存时间的差异，Cox比例风险回归分析来研究各种临床病理资料及DLL4的表达水平对病人生存率的影响程度。所有检验均为双侧检验，以P<0.05作为差异具有统计学显著性意义的界值。
2、结果
2.1、DLL4在结直肠癌肿瘤组织中的表达情况
所有患者中DLL4表达均有表达，阳性率为100%（90/90），低水平表达比例52.22%（47/90），高水平表达比例47.78%（43/90）。DLL4在结直肠癌标本中的细胞膜及胞浆均有表达。见图1。且DLL4在肿瘤组织中的表达水平（均值为4.91）较癌旁组织（均值为4.43）、正常组织（均值为3.14）均明显增高，DLL4在癌旁组织中的表达水平较正常组织也明显增高（见表1）。以上差异均有统计学意义。
2.2、DLL4在肿瘤组织中的表达水平与临床参数之间的相关性
DLL-4表达与病理分期相关，呈正相关，即病理分期T分期、N分期越高，DLL-4表达水平越高。其余表达水平均与临床参数并不相关。见表2。
2.3、DLL4表达水平与预后的关系
我们对DLL4表达水平与预后之间的关系进行分析，发现随着DLL4的表达水平的升高，患者的生存期及无病生存期均明显减低（P<0.05）。见图2。根据DLL4的表达强度分为两组，高表达组（n=43例）和低表达组（n=47例）。高表达组平均总生存时间（24.99月）较低表达组（49.36月）明显减低，高表达组无病生存期时间（23.69月）也较低表达组（48.69月）明显减低，两者均存在显著性差异（P<0.05）。见图3。
我们同时选取了DLL4在肿瘤组织中的表达强度、患者性别、年龄、肿瘤直径，侵润深度，淋巴结转移、肿瘤部位共7项因素进行多因素COX回归分析。结果显示，DLL4在肿瘤组织中的表达强度及淋巴结转移这2项成为影响结直肠癌预后（总生存期）的独立危险因素。见表3。
3、讨论
结直肠癌是我国目前最常见的恶性肿瘤之一，许多经过相同的根治性手术及放化疗患者的预后结果却不尽相同。有许多因素影响着结直肠癌患者的预后，Notch信号同路是结直肠癌信号传导同路中的一个重要通路，该通路在内皮细胞的发育分化、干细胞分化、血管形成及肿瘤发生发展过程中具有重要作用。Notch途径的受体Notch1在结直肠癌中的高表达是其独立的预后影响因素[1]。Notch配体DLL4是5个配体中唯一特异性存在于内皮细胞的配体，目前多项研究发现DLL4的表达与肿瘤血管生成密切相关。DLL4在体外实验中，不同研究者通过改变DLL4 的状态观察其对血管生成及肿瘤生长的作用，Noguera-Troise等[9]将阻断DLL4的表达的肿瘤细胞移植到小鼠体内，肿瘤血管内皮增生、血管密度增加，而肿瘤体积相对较小，且大部分血管是没有功能的。Ridgway 等[10]研究也显示抑制DLL4的表达可减少人类纤维肉瘤细胞系或白血病细胞系的小鼠肿瘤的生长。Stewart等[11]还发现，阻断DLL4的表达会导致血管周细胞/血管平滑肌细胞的数量减少、血管开放、管腔减少及血管功能下降，进而抑制肿瘤生长。目前已有多项研究检测DLL4在多种恶性肿瘤中的表达。DLL4在众多肿瘤中存在表达增高，且与预后明显相关。然而DLL4在华人结直肠癌中的表达及与预后相关性却未见报道。
我们对90例结直肠癌患者的DLL4表达水平进行了检测，发现所有患者中DLL4表达均有表达，阳性率为100%（90/90）。通过免疫组化我们可以发现DLL4在结直肠癌标本中的细胞膜及胞浆均有表达，DLL4在肿瘤组织中的表达水平均较癌旁组织、正常组织中明显增高，癌旁组织中的表达也较正常组织明显增高。然后我们又对DLL4的在结直肠癌肿瘤组织表达水平与临床参数之间的相关性进行了分析，发现DLL4的表达与病理分期相关，呈正相关，即病理分期T分期、N分期越高，DLL-4表达水平可能越高。这提示我们DLL4在结直肠癌肿瘤组织中的表达水平可能与肿瘤侵润程度及淋巴结转移相关，这可能是因为与DLL4的表达与肿瘤血管生成相关，并因此对患者的预后产生影响。
接下来我们对患者的5年随访做了随访分析。我们发现随着DLL4在肿瘤组织中的表达水平的增高，患者的总生存时间及无病生存时间均呈下降趋势，并进一步根据DLL4的表达强度分为高表达组和低表达组，发现高表达组总生存时间及无病生存期时间均较低表达组明显减低。为了排除其他临床因素造成的干扰，我们选取了DLL4蛋白表达强度、性别、年龄、肿瘤直径，侵润深度，淋巴结转移、肿瘤部位共7项因素进行多因素COX回归分析。结果显示，DLL4在肿瘤组织中的表达强度及淋巴结转移这2项对患者的预后情况产生影响，为独立影响因素。
综上，DLL4在结直肠癌肿瘤组织中的表达水平可能与肿瘤组织的侵润程度及淋巴结转移相关，并因此对患者预后产生影响。DLL4的表达水平越高，患者预后越差。
图1 DLL4在结直肠癌肿瘤组织、癌旁组织、正常组织中的表达情况
参考文献：
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[2]Oon，C.E. and A.L. Harris. New pathways and mechanisms regulating and responding to Delta-like ligand 4Notch signalling in tumour angiogenesis. Biochemical Society Transactions[J]，2011. 39（6）：p. 1612.
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[8]吕伟，陈凛，孙锁柱，应用组织芯片技术研究Delta-like 4在胃癌组织中的表达及意义. 世界华人消化杂志[J]，2008. 16（9）：p. 956.
[9]Noguera-Troise，I.，et al. Blockade of DLL4 inhibits tumour growth by promoting non-productive angiogenesis. Nature[J]，2006. 444（7122）：p. 1032-7.
[10]Ridgway，J，et al. Inhibition of DLL4 signalling inhibits tumour growth by deregulating angiogenesis. Nature[J]，2006. 444（7122）：p. 1083-7.
[11]Stewart，K.S，et al. Delta-like ligand 4-Notch signaling regulates bone marrow-derived pericyte/vascular smooth muscle cell formation. Blood[J]，2011. 117（2）：p. 719-26.
基金资助：本文受天津市卫计委重点项目（编号：2012KR13）项目资助
论文作者:王玉,王宏磊,赵永捷,高浩,唐涛,张明庆,吕宏程
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第23期
论文发表时间:2018/9/29
标签：肿瘤论文; 组织论文; 水平论文; 患者论文; 结直肠癌论文; 淋巴结论文; 天津市论文; 《中国误诊学杂志》2018年第23期论文;