李军[1]2002年在《PKC-α及PKC-ε在肾癌及其周围正常组织中表达的研究》文中研究表明前言 肾癌是一种发病率较高的肿瘤，在我国泌尿外科肿瘤中占第二位，仅次于膀胱肿瘤。其生物学行为极为多变，发病机制以及发生发展的分子生物学基础至今不明。PKC是一种存在于细胞浆内的蛋白激酶，广泛分布于机体各器官、组织和细胞，并发挥着十分重要的生理作用。PKC具有多种生理功能，介导细胞生长和增殖的信息传递，调节核基因表达和功能，影响细胞周期和凋亡等。目前已分离、纯化出至少12种不同的PKC亚型，它们是由不同基因编码的功能同功酶。在生化结构上互不相同，在功能作用上也表现出明显的组织细胞特异性。大量的研究表明，PKC与肿瘤关系密切。本文通过检测PKC亚型在不同分期、分级的肾癌及周围正常肾组织胞浆、胞膜中表达的差异，分析PKC亚型与肾癌的关系，为临床提高肾癌治疗疗效具有重要的理论和实际意义。 实验材料 本实验所用标本为2000年—2001年本院经手术切除的肾癌组织及其周围正常组织标本各30例。取新鲜肿瘤组织及距肿瘤3cm以上正常肾组织，1小时内送至-70℃冰箱冻存。本组病例男，21例；女，9例。年龄37岁～77岁，平均57.0岁。左侧肾癌16例，右侧肾癌14例。25例病例行经腹肾癌根治手术，4例行经腰肾癌根治手术，1例行经腰肾切除术。所有病例均为初发，术前未行放、化疗和免疫治疗。病理分期参照Robson分期法，组织学分级参照Cleveland Clinic分级标准。 实验方法 试剂与方法：组蛋白皿一S、鱼精蛋白＊KC亚型a仔 I抗、第二抗体羊抗兔 IgG为 Sigtna公司产品；＊－32P］ATP购自福瑞公司。提取各样品组织胞浆、胞膜蛋白，采用Folin一酚试剂法进行蛋白定量。采用 Western Blotting技术检测PKC亚型（PKC－－a、PKC吓）在肾癌肿瘤组织和临近正常组织胞浆、胞膜中的表达。 统计学处理：计量资料采取卡方检验，应用计算机SppS统计软件包进行分析。 实验结果 二．本试验所应用标本按病理分期分为 4组，sIJ为二期 7例，11期18例，皿期4例J期二例。按组织学分级分为4组，分别为1级6例，2级17例，3级5例，4级2例。 2．PKC亚型在肾癌和临近正常组织胞浆、胞膜含量的关系： PKC亚型在肾癌与临近正常组织胞浆、胞膜中的表达明显不同。与临近正常组织相比，肾癌组织中PKC——a在胞浆的表达显着降低，在胞膜的表达显着增高，P＜o．01，差异均有统计学意义。与临近正常组织相比，肾癌组织中PK0一在胞浆和胞膜的表达均显着增高，P＜o．01，差异有统计学意义。 3．PKC亚型与肾癌肿瘤组织拥及分级的关系： 将IV期肿瘤并人皿期肿瘤组分析，将4级肿瘤并人3级肿瘤组分析。PKC一。在肾癌肿瘤组织中胞浆、胞膜中的表达与肿瘤病理侧相关。在肿瘤胞浆中／KC一。表达随肿瘤分期的增高而降低，11期与二期，皿一W期与11期，皿一IV期与互期相比较，P＜o．01，均有统计学意义；在肿瘤胞膜中，＊＊C一。表达随肿瘤分期的增高而增高，11期与1期，皿一W期与11期，皿一NM与1期相比较，P＜o．01，均有统计学意义。PK＊一。在不同分级的肾癌 ·二·肿瘤组织胞浆、胞膜中的表达也不同。在肿瘤胞浆中，PKC一。表达随肿瘤分级的增高而降低，2级与二级，3－4级与二级，3－4级与二级相比较，P＜O．0乙均有统计学意义；在肿瘤胞膜中，PK＊一。表达随肿瘤分级的增高而增高，2级与二级，3－4级与2级，3－4级与1级相比较，P＜o．01，均有统计学意义。 ＊KC——S在肾癌肿瘤组织中胞浆、胞膜中的表达与肿瘤病理侧、细胞分级相关。随着肿瘤病理分期的增高PKC一在肾癌肿瘤组织中胞浆、胞膜中的表达均增高。D期与1期，皿一w期与D期，皿一w期与互期相比较，P＜o．0L均有统计学意义。随着肿瘤细胞分级的增高PKC一。在肾癌肿瘤组织中胞浆、胞膜中的表达均增高。2级与互级，3－4级与2级，3－4级与二级相比较，P叩0＊均有统计学意义。 讨 论 肾癌是临床上较常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于膀既肿瘤，在泌尿外科肿瘤中占第二位。因为肾癌的生物学行为极为多变，发病机制以及发生发展的分子生物学基础至今不明，因此对肾癌的诊断和治疗尚不能令人满意。 PKC是细胞内信号传递中的关键分子之一，对细胞的生长起调控作用。PKC既能介导多种癌基因信号，又能参与调控细胞周期，并对细胞生长与凋亡起调节作用，从而在多个环节与肿瘤的发生发展有关。PKC分为四大类：＊）传统型PKC卜PKCSX包括外plp I及 7；（2）新型 PKC（lPKCS），包括 8、。、qK）及 0；（3）日典型 PKC（aPKCS），包括ex及 L；（4）第四种 PKC。 不同的 PKC亚型在人体组织的分布有明显差异。不同 PKC亚型选择性器官分布提示它们在功能上的差别，多种亚型可在同一组织甚至同一细胞中存在，并介导不同的信号传递功能。不同 ·3·PKC亚型还在激活剂、人类染色体等方面不尽相同。
宋学东[2]2014年在《一、PLCε抗血清制备及在膀胱癌检测的初步临床应用 二、HepaCAM对前列腺癌细胞生物学功能影响及机制探讨》文中研究表明目的：1.构建PLCε原核表达系统。表达、分离纯化PLCε蛋白并鉴定。2.制备兔抗PLCε蛋白抗血清，进一步分离纯化验证其特异性，并初步在膀胱癌中应用。方法：1.应用RT-PCR从人膀胱癌细胞cDNA中克隆出氨基端PLCε基因，将此氨基端PLCε片段连接至pGEX-6P-1原核表达载体上，构建原核表达载体pGEX-6P-1/PLCε。2.将原核表达载体pGEX-6P-1/PLCε转化大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达GST-PLCε重组蛋白，通过GST亲和层析系统纯化重组蛋白，鉴定所纯化的重组蛋白。3．将纯化的GST-PLCε重组蛋白免疫家兔，制备家兔抗PLCε的抗血清，经蛋白A抗体纯化系统分离纯化抗血清，ELISA检测抗血清效价,Western blot测定其特异性。4.利用制备的PLCε抗血清包被ELISA板，制备快速PLCε蛋白血清检测ELISA试剂盒，检测30例膀胱癌患者与6例正常人血清中PLCε蛋白的表达情况，初步探索PLCε抗血清在膀胱癌中应用。结果：1．经RT-PCR、基因重组、酶切及测序验证原核表达载体pGEX-6P-1/PLCε构建成功，通过GST亲和层析系统分离纯化，得到GST-PLCε重组蛋白。2.将纯化后的GST-PLCε重组蛋白免疫家兔，经纯化获得抗血清；ELISA效价1:16000以上；Western blot结果显示，该抗血清与原核表达的GST-PLCε重组蛋白和人膀胱癌T24细胞株表达的PLCε蛋白特异性结合。3.制备的抗血清包被的ELISA可以检测到血清中PLCε蛋白的表达，膀胱癌患者血清中PLCε为5.62±2.79ng/ml高于正常对照组2.53±0.42ng/ml（P＜0.05）,差异具有统计学意义。结论：成功构建PGEX-6P-1/PLCε原核表达系统，纯化获得了较高纯度的GST-PLCε重组蛋白，并以重组蛋白为免疫原，制备了兔抗PLCε的抗血清，初步用于膀胱癌的血清学检测。PLCε的抗血清的获得为进一步研究PLCε蛋白功能和作用机制奠定了基础，同时也为开发快速检测膀胱癌诊断试剂盒提供了实验数据。目的：1.探讨HepaCAM基因在前列腺组织及细胞株中的表达，分析其表达与各临床病理参数的相关性。2.利用腺病毒载体，过表达HepaCAM基因，检测其对人前列腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移等生物学功能的影响及机制探讨。方法：1.应用RT-PCR和Western blot等技术，检测前列腺细胞株RWPE-1,LNCap, DU145及PC3中HepaCAM基因的表达。应用IHC技术检测75例前列腺组织中HepaCAM蛋白的表达情况，统计学分析其表达与各临床病理参数的相关性。2.应用WST-8试验、FCM、划痕试验及Transwell等实验技术检测HepaCAM对前列癌LNCap, DU145和PC3细胞株增殖、凋亡、侵袭和转移的影响。应用Western blot检测HepaCAM、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9和GAPDH等相关蛋白水平的表达。3.应用细胞免疫荧光、RT-PCR和Western blot等技术，检测过表达HepaCAM后前列腺癌LNCap细胞中AR的mRNA和蛋白水平的影响。应用Western blot和ELISA技术检测HepaCAM对其胞质及分泌型PSA的影响。应用EGF处理细胞后，Western blot检测HepaCAM对癌细胞P-ERK及t-ERK等蛋白表达的影响。结果：1. HepaCAM基因在LNCap, DU145和PC3细胞中表达缺失，在前列腺癌组织中的表达与BPH及正常前列腺组织相比显着降低，且与前列腺癌各临床参数间均无相关性。2. HepaCAM基因能够抑制前列腺癌LNCap, DU145和PC3细胞的增殖，诱导细胞凋亡，降低癌细胞侵袭及转移。体外过表达HepaCAM后能够降低Bcl-2、MMP2和MMP9的表达，增加Bax的表达水平。3.细胞免疫荧光及Western blot结果显示，HepaCAM可以抑制前列腺癌LNCap的AR核转移，降低AR的表达。Western blot和ELISA检测PSA表达明显下降。HepaCAM可以阻滞ERK的磷酸化表达水平。结论:在前列腺癌中HepaCAM低表达，过表达HepaCAM可以抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭与转移，诱导细胞凋亡。相关分子机制可能是HepaCAM抑制前列腺癌AR的核转位和ERK磷酸化来实现的。因此，HepaCAM基因缺失对临床判断前列腺癌的发生发展有指导意义，为肿瘤的生物治疗提供新的分子靶点。
参考文献：
[1]. PKC-α及PKC-ε在肾癌及其周围正常组织中表达的研究[D]. 李军. 中国医科大学. 2002
[2]. 一、PLCε抗血清制备及在膀胱癌检测的初步临床应用 二、HepaCAM对前列腺癌细胞生物学功能影响及机制探讨[D]. 宋学东. 重庆医科大学. 2014
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