韩利华[1]2004年在《脉冲电磁场防治骨质疏松症的体内外实验研究》文中研究指明骨质疏松症是严重威胁老年人特别是绝经后妇女健康的一种疾病。目前有关骨质疏松症的治疗主要局限于药物治疗，但由于昂贵的价格以及骨质疏松症相关药物治疗中过程产生的副作用往往使病人难以长期坚持，这也是临床医生所必须面对的一道难题。近年来，脉冲电磁场(Pulsing electromagnetic fields, PEMFs)逐渐被用于骨质疏松症的预防和治疗。与传统的治疗方法相比，PEMFs治疗具有副作用小、无身体不适和花费低廉等优点。 在所有活的生物体，如骨骼、神经、软骨、肌肉等都存在电现象，因此这些组织都会受到外加磁场或电磁场的影响。事实上，有越来越多的证据证实了的频率低于300Hz的电场或磁场可以影响器官和组织的功能。电场和电磁场被用于骨折和骨科相关疾病已有叁十余年。极低频PEMFs已成功地用于治疗各种骨科疾病：骨折不愈合和延迟愈合、骨坏死、假关节、促进神经再生和伤口愈合。目前全世界已有数以百万计的骨折病人接受PEMFs治疗，虽然有关PEMFs骨质疏松症治疗方面进行了大量的动物实验，但PEMFs用于骨质疏松症患者的治疗才刚刚开始。由于PEMFs存在场强、频率、脉冲时间及次数、波形等的“窗口”效应，目前研究者所使用的“窗口”各不相同，很多实验结果往往相互矛盾，对PEMFs在防治骨质疏松症中的作用仍存在争议。PEMFs对骨质疏松的作用机制目前仍不清楚。因此，探索PEMFs的作用机制，寻找最佳的治疗“窗口”，是摆在我们面前的重要工作。 为了证实PEMFs在防治骨质疏松症中的作用，我们用我校生物医学 第四军医大学博士学位论文工程系研制的频率分别为IHz和巧Hz，脉冲延时为sms，磁感应强度为0一8xl丫T的PEMFs骨质疏松治疗仪进行了一系列体内、外实验研究，以探讨PEMFs对绝经后骨质疏松症的预防作用以及其作用机制，寻找最佳的治疗“窗口”。 本研究主要包括两大部分内容。1.体内动物实验:用Sprague一Dawly雌性大鼠去势建立绝经后骨质疏松症动物模型，去势后开始用频率为15Hz、磁感应强度分别为Zx 104rr、4x 10一T、sxl04T的PEMFs进行6扮d，共12周的治疗。观察不同磁感应强度的PEMFs对去势大鼠骨钙素、骨密度、骨生物力学参数及骨形态计量学参数的影响，以探讨PEMFs对去势大鼠骨质疏松症的预防作用;用雌性大鼠去势建立绝经后骨质疏松症动物模型，去势后分别在白天(9:00一-15:00)和夜间(0:oo一6:00)开始用频率为15Hz、磁感应强度4xlo礴T的PEMFs进行6珑，共12周的治疗，观察昼夜节律对PEMFs预防去势大鼠骨质疏松症的作用的影响;用免疫组织化学方法观察PEMFs作用后松质骨中IL一1日和TNF-a蛋白表达的变化，探讨IL一1已和TNF一Q在PEMFs预防骨质疏松症机制中的作用。2.体外成骨细胞培养实验。用SD仔鼠颅骨建立原代大鼠成骨细胞培养模型，并进行鉴定;用频率为15Hz、磁感应强度4xlo4T的PEMFs作用于培养的大鼠成骨细胞，采用透射电镜、流式细胞仪、MTT实验、ALP活性测定以及四环素荧光标记等方法，观察PEMFs对大鼠成骨细胞的超微结构、细胞周期、增殖、分化以及体外骨形成的影响，观察PEMFs对大鼠成骨细胞的作用;用免疫组织化学染色的方法观察PEMFs作用于培养的大鼠成骨细胞后，成骨细胞中Cbfal、BMP一2表达的变化，探讨Cbfal、BMP一2在PEMFs治疗骨质疏松症中的作用机制;用流式细胞仪、TUNEL法、免疫组织化学等方法观察PEMFs作用于大鼠成骨细胞后成骨细胞凋亡率的变化和Fas蛋白表达的变化，探讨PEMFs对成骨细胞凋亡的影响;观察不同时间、磁感应强度、频率的PEMFs对成骨细胞增殖的影响，以寻找PEMFs对成骨细胞最佳的作用“窗口”。得到如下结论:1.频率1 SHz，脉冲延时为sms，磁感应强度分别为2 xlo礴T、4 x 10-4T和sxlo礴T的PEMFs可以降低去势大鼠BGP水平，增加BMD，提高股骨生物力学性能和改善骨形态计量学参数，这叁种强度的PEMFs均对雌 第四军医大学博士学位论文性大鼠去势导致的骨质疏松症有预防作用，其中4xlrT和sx1o礴T组的治疗效果优于2x10一T组。2.昼夜节律对PEMFs预防去势大鼠骨质疏松症的作用效果有影响，在白天对去势大鼠进行PEMFs的治疗效果优于夜间治疗。昼夜节律对PEMFs治疗作用的影响可能与生长激素、cAMP以及骨代谢的生化标志物的昼夜节律有关。3.PEMFs治疗则可降低去势后松质骨中增高的IL一lp和TNF一a的表达水平。PEMFs可能通过减少TNF一。、IL一lp等局部细胞因子的表达抑制破骨细胞形成，进而抑制骨吸收，提示PEMFs对骨质疏松症的治疗作用可能与其减少TNF一a、IL一lp等局部细胞因子的表达有关。4.我们用胎鼠颅骨建立成骨细胞培养模型，经倒置显微镜观察、ALP染色、钙结节染色、I型和m型胶原免疫组织化学染色等方法鉴定，得到纯度较高的成骨细胞。5.我们用频率为15Hz，磁感应强度为4x 10碑T的PEMFs作用于胎鼠颅骨成骨细胞，流式细胞仪测定发现成骨细胞S期比例升高，增殖指数增加。M竹实验显示成骨细胞增殖活跃，ALP活性增高。四环素荧光标记面积及荧光强度明显增加。说明PEMFs作用于成骨细胞，既可促进细
谢肇[2]2004年在《仿生脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的实验研究》文中研究表明目的：观察仿生脉冲电磁场(BEMF)对绝经后骨质疏松的治疗作用；探讨BEMF治疗绝经后骨质疏松的分子生物学机理。 方法：40只6月龄雌性未孕Wistar大鼠，随机30只去势、10只假手术。术后8W，30只去势大鼠按体质量随机分为雌激素治疗组(OVX+雌激素E)、仿生脉冲电磁场治疗组(OVX+BEMF EM)、骨质疏松对照组(OVX)，假手术对照组(Sham)。E组：苯甲酸雌二醇0.5mg／kg，1次／2周；EM组：BEMF照射，1次／日，1h／d；Sham组、OVX组不予以任何治疗，作为对照组。治疗10W后处死各组实验动物，进行一般情况(体质量、子宫质量、子宫腺体数量)及骨密度、股骨干重及骨钙含量、骨生物力学特性、骨形态计量学、血尿生化及骨形态学检查。通过透射电镜、TUNEL、骨形态计量学、免疫组化、原位杂交等技术观察BEMF对椎体成骨细胞、破骨细胞、骨细胞凋亡、凋亡调控基因Fas、bax、bcl-2的蛋白表达及骨局部因子TGFβ1、bFGF、IL-6蛋白及mRNA表达的影响。 结果：与OVX组相比，EM组大鼠腰椎、股骨骨密度均显着性升高(P＜0.05)；以椎体骨密度的增加更为明显(P＜0.01)。E组骨密度的变化与EM组相似，但E组、EM组骨密度仍低于Sham组骨密度。在椎体，EM组骨密度增加(24.3％)小于E组(27.9％)，EM组与Sham组存在显着性差异(P＜0.05)，E组骨密度与Sham组无显着性差异(P＞0.05)。在股骨，EM组骨密度增加(12.1％)大于E组骨密度增加(8.8％)，E组与Sham组存在显着性差异(P＜0.05)，EM组骨密度与Sham组无显着性差异(P＞0.05)。无论在椎体或股骨，EM组、E组骨密度均无显着性差异(P＞0.05)。 EM组股骨骨钙盐含量、骨干干重显着高于OVX组(P＜0.01)；EM组股骨骨钙盐含量、骨干干重增加大于E组，E组与Sham组存在显着性差异(P＜0.05)，EM组骨密度与Sham组无显着性差异(p＞0.05)。 EM组骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)较OVX组增高，有显着性差异(P＜0.01)，仍未达到Sham组水平(P＜0.01)，与E组无显着性差异(P＞0.05)。E组骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)与Sham组无显着性差异(P＞0.05)。EM组骨小梁分离度(Tb.Sp)较OVX组降低，有显着性差异(P＜0.01)，低于Sham组水平(P＜0.05)，与E组无显着性差异(P＞0.05)；E组骨小梁第二军医大学博士学位论文分离度(Th.SP)与sham组无显着性差异(P>0.05)。 股骨生物力学:与Ovx组相比，EM组股骨结构力学(最大位移、最大载荷、最大能量吸收)、材料力学(最大应力、最大应变、弹性模量)均显着性改变(P<0.05)。EM组大鼠股骨结构力学(最大挠度、最大载荷、最大能量吸收)、材料力学(最大应力、最大应变、弹性模量)仍未达到正常水平。结构力学的差别小于于材料力学(P<0.05，P<0.01)。EM组大鼠股骨结构力学(最大挠度、最大载荷、最大能量吸收)优于E组(P<0 .05)、材料力学(最大应力、最大应变、弹性模量)与E组无显着性差异(P>0.05)。EM组较ovx组最大载荷增加13.3%，E组较OVX组最大载荷增加8.3%。 椎体生物力学:EM组与ovx组相比，椎体结构力学:最大挠度(P<0.01)、最大载荷(p<0.02)、最大能量吸收(p<0.05)、材料力学:最大应力(p<0，05)、最大应变(P<0.05)、弹性模量(P<0.01)均有显着性改变。结构力学的差异大于材料力学。与sham组相比，EM组大鼠椎体结构力学(最大挠度、最大载荷、最大能量吸收)、材料力学(最大应力、最大应变、弹性模量)仍未达到正常水平(P<0.05)。结构力学的差别小于于材料力学。与E组相比，EM组大鼠椎体结构力学(最大挠度、最大载荷、最大能量吸收)、材料力学(最大应力、最大应变、弹性模量)无显着性差异(P>0.05)。EM组较 OVX组最大载荷增加22%，E组较OVX组最大载荷增加13.6%。 血、尿生化:OvX组的尿钙、尿磷、尿经脯氨酸高于假手术组，有非常显着差异(P<0.01);而血钙、血磷较假手术组稍有降低无显着差异(P>0.05)。E组、EM组大鼠尿钙、尿磷、尿轻脯氨酸较模型组非常显着下降(P<0.01);由于机体的稳态作用血钙、磷有所降低，但与假手术组未见显着差异(P>0.05)。与Sham组相比，ovx组血清ALP、BoP、T队P显着增高(P<0.01)。E组血清ALP、BGp较模型组非常显着降低(P<0.01)，仍高于Sham组(P<0.01);血清TRAP非常显着低于模型组(P<0.01)，但仍显着高于假手术组(p<0.05)。EM组血清ALp较oVX组、Sham组、E组增高，有非常显着差异(p<0.01);血清BGP升高，高于Sham组、E组，有非常显着差异(P<0.01)，与OVX组无显着性差异(P>0.05);血.清TRAP较OVX组有非常显着降低，但未达Sham组水平(P<0.01)。 骨组织形态学:光学显微镜、扫描电镜观察显示，OVx组骨小梁较正常组明显减少、排列稀疏，网状结构缺如，骨小梁间距增宽。EM组骨小梁变化与雌激素组相似，但连接增多，较为均匀。E组与模型组相比，骨小梁数目增多、排列较为密集、骨小梁宽度与模型组相似，骨小梁连接明显增多。Sham组骨小梁排列密集，并呈网状结构骨小梁间距小。说明BEMF对骨结构具有改善作用。 子宫质量、子宫腺体数量:EM组大鼠子宫质量、腺体数量与OVX组相当，无显着性差异(P>0.05)。E组大鼠子宫质量
付小卫[3]2014年在《基于破骨细胞和成骨细胞调控通路探讨左、右归丸对不同性别去势大鼠骨质疏松症的作用差异及其机制》文中进行了进一步梳理目的从OPG/RANKL破骨细胞调控通路和Wnt/LRP-5/β-catenin成骨细胞调控通路的角度,揭示具有滋补肾阴作用的左归丸和具有温补肾阳作用的右归丸对不同性别去势大鼠骨质疏松症的作用差异及其机制,以探讨“肾主骨”是否存在性别差异以及产生差异的机理,进一步阐明“肾主骨”的科学内涵,并为采用中医治疗骨质疏松症的临床用药提供实验依据。方法选用同周龄SD大鼠160只,SPF级,雌雄各半,先随机分为6组：雌、雄性空白对照组各12只,雌、雄性假手术组各12只,雌、雄性造模组各56只。于去势术前,先用Osteocore3Digital2D骨密度仪(双能x线)扫描所有大鼠腰椎4-6(L4-6) BMD,得到扫描图像待分析。之后分别对两组造模组大鼠行去势手术,即对雌性造模组大鼠切除卵巢,对雄性造模组大鼠切除睾丸(其中雄性假手术组1只、造模组雌、雄性大鼠各3只因手术麻醉死亡)。术后,再将两组造模组大鼠按体重随机分为8组：卵巢切除组(OVX组)13只、睾丸切除(ORX组)14只、戊酸雌二醇组(E2组)14只,甲睾酮组(T组)、雌、雄性左归丸组、雌、雄性右归丸组各13只。OVX大鼠OP模型制作：采用戊巴比妥钠腹腔注射全身麻醉雌性大鼠后,摘除双侧卵巢；雌性假手术组也施行开关腹腔手术,但未摘除卵巢,只摘除少量卵巢周围脂肪组织。ORX大鼠OP模型制作：用戊巴比妥钠腹腔注射全身麻醉雄性大鼠后,分离双侧睾丸和附睾并切除双侧睾丸；雄性假手术组也用同样的方法找到并剥离双侧睾丸,但不摘除。术后10天,对各给药组大鼠灌胃给药：雌、雄性左归丸组大鼠灌服左归丸水煎液,给药浓度为0.968g生药/ml；雌、雄性右归丸组大鼠灌服右归丸水煎液,给药浓度为1.024g生药/ml；戊酸雌二醇组大鼠灌服戊酸雌二醇水溶液,浓度为0.0092mg/ml;甲睾酮组大鼠灌服甲睾酮水溶液,浓度为0.092mg/ml。以上给药体积均为1ml/100g体重,每周称重一次,根据体重调整给药体积,每天固定时间(下午2点)给药,连续6天,休息1天后,再连续给药6天,如此给药3个月。雌、雄空白对照组,雌、雄假手术组,OVX组、ORX组大鼠按上法灌服等体积的纯净水(雌性右归丸组和雄性左归丸组各有1只大鼠因灌胃操作不慎死亡)。各组大鼠分别于处死前16天和前3天,腹腔注射盐酸四环素(剂量为30mg/kg体重),对骨组织进行荧光双标记。给药结束后,将大鼠用戊巴比妥钠腹腔注射进行全身麻醉,用骨密度仪扫描大鼠L4-6BMD,得到扫描图像待分析。然后,再将各组大鼠迅速处死,取右侧胫骨近端1/3,制作不脱钙骨切片,用于骨组织形态计量学指标的检测；取左侧胫骨近端1/3,制作脱钙骨冰冻切片,采用免疫组化法和原位杂交法分别检测OPG、RANKL、Wnt1、LRP-5、β-Catenin蛋白及其mRNA的检测。实验结果数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS20.0统计软件,若数据为正态分布时,采用单因素方差分析(ANOVA)进行数据处理,方差齐性时组间两两比较,采用LSD检验；方差不齐时采用Dunnett's T3(3)检验；若数据为非正态分布时,采用非参数检验Kruskal-Wallis单因素ANOVA(k样本)(W)；配对数据对比采用配对样本T检验。结果1左、右归丸对不同性别去势大鼠腰椎BMD及骨丢失率的影响除T组外,其余各组大鼠给药后腰椎BMD与去势前相比均有明显差异(P<0.05或P<0.01)。相同性别大鼠给药后腰椎BMD组间比较：模型组(OVX组、ORX组)较假手术组显着降低；E2组、雌性左归丸组、雌性右归丸组大鼠腰椎BMD均较OVX组显着增高,但仍低于假手术组；与ORX组相比,T组、雄性右归丸组大鼠腰椎BMD显着增高,雄性左归丸组则无显着差异,但均低于假手术组。其中,雌性左归丸组与雌性右归丸组、雄性左归丸组与雄性右归丸组之间均存在明显差异,且后者高于前者。相同性别大鼠给药后腰椎骨丢失率组间比较,结果显示：模型组(OVX组、ORX组)大鼠腰椎骨丢失较假手术组显着增加；E2组、雌性左归丸组、雌性右归丸组大鼠腰椎骨丢失均较OVX组显着减少,但仍明显多于假手术组；与ORX组相比,T组、雄性右归丸组大鼠腰椎骨丢失显着减少,雄性左归丸组则无显着差异,但均仍多于假手术组。其中,雌性左归丸组与雌性右归丸组、雄性左归丸组与雄性右归丸组之间骨丢失率均存在明显差异,且后者低于前者。不同性别大鼠给药后腰椎骨丢失率组间比较,结果显示：雌性与雄性假手术组、OVX组与ORX组、雌性与雄性左归丸组、雌性与雄性右归丸组之间骨丢失均有显着差异。其中OVX组骨丢失明显多于ORX组(P<0.01),雄性左归丸组则明显多于雌性左归丸组(P<0.05)、雄性右归丸组则明显多于雌性右归丸组(P<0.01),但雌性假手术组骨量增加明显低于雄性假手术组(P<0.05)。2左、右归丸对不同性别去势大鼠骨组织形态计量学指标的影响2.1左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨TBV%及骨丢失率的影响相同性别大鼠胫骨TBV%组间比较：模型组(OVX组、ORX组)较假手术组显着降低；雄性左归丸组与ORX组相比无统计学差异(P>0.05),其余各给药组均较同性别模型组显着升高,但仍明显低于同性别假手术组。其中,雌性右归丸组高于雌性左归丸组,雄性右归丸组高于雄性左归丸组,且之间差异有统计学意义。不同性别大鼠胫骨TBV%组间比较：雌性假手术组与雄性假手术组、OVX组与ORX组之间具有显着差异,且均为后者高于前者。相同性别大鼠胫骨骨丢失率组间比较,结果显示：模型组(OVX组、ORX组)骨量丢失明显多于假手术组；雄性左归丸组骨量丢失与ORX组相比无统计学差异(P>0.05),其余各给药组均较同性别模型组骨量丢失显着减少,但仍明显多于同性别假手术组。其中,雌性右归丸组骨量丢失明显少于雌性左归丸组(P<0.01),雄性右归丸组明显少于雄性左归丸组(P<0.05)。不同性别大鼠胫骨骨丢失率组间比较,结果显示：雌性与雄性假手术组、OVX组与ORX组、雌性与雄性左归丸组、雌性与雄性右归丸组之间骨量丢失均存在显着差异。其中OVX组骨量丢失明显多于ORX组(P<0.05),雄性左归丸组则明显多于雌性左归丸组(P<0.05)、雄性右归丸组则明显多于雌性右归丸组(P<0.05),但雌性假手术组骨量增加明显低于雄性假手术组(P<0.05)。2.2左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨TRS%、FS%及TRS/TFS比值的影响相同性别组间比较：模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨TRS%、TFS%及TRS/TFS匕值均较同性别假手术组明显升高。各给药组中,E2组、T组和雌性右归丸组上述参数均较同性别模型组显着降低,且均与同性别假手术组无统计学差异；雌性左归丸组大鼠胫骨上述参数也明显低于OVX组,但仍高于雌性假手术组,且二者存在统计学差异；雄性左归丸组大鼠胫骨上述参数与ORX组相比,无统计学差异；而雄性右归丸组大鼠胫骨上述参数较ORX组明显降低,但仍明显高于雄性假手术组。两种中药治疗组中,雌性右归丸组与雌性左归丸、雄性右归丸组与雄性左归丸组大鼠胫骨上述参数相比,均有统计学差异,且前者明显低于后者。不同性别大鼠胫骨TRS%、TFS%及TRS/TFS比值组间比较,结果显示：雌、雄性假手术组、模型组(OVX组和ORX组)、左归丸组和右归丸组之间上述参数均有统计学差异,其中,TFS%比较,雌性假手术组低于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸低于雄性左归丸,雌性右归丸低于雄性右归丸；与之对应,TRS%比较,雌性假手术组高于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸低于雄性左归丸,雌性右归丸低于雄性右归丸；TRS/TFS比值比较,雌性假手术组高于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组。2.3左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨OSW、MAR和mAR的影响相同性别组间比较：模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨OSW、MAR和mAR与同性别假手术组相比,显着增高。各给药组中,与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组上述参数均显着下降,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组大鼠胫骨上述参数明显降低,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组大鼠胫骨上述参数与之无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显下降,但仍明显高于雄性假手术组；与同性别左归丸组比较,雌性、雄性右归丸组MAR和mAR均明显降低,雄性右归丸组OSW较雄性左归丸组明显降低,雌性右归丸组OSW较雌性左归丸组有降低趋势(P=0.054)。不同性别大鼠组间比较,结果显示：模型组(OVX组和ORX组)、左归丸组和右归丸组两种性别之间上述参数均存在差异(P<0.05或P<0.01)。其中,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组。假手术组之间比较,OSW雌性较雄性无统计学差异(P>0.05),但有降低趋势；MAR和mAR则雌性显着低于雄性(P<0.05或P<0.01)。3左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓中OPG、RANKL蛋白和mRNA表达以及RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值的影响3.1左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓OPG蛋白和mRNA表达的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓OPG蛋白和mRNA表达阳性密度均显着降低；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显着增高,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显升高,但仍明显低于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左、右归丸组OPG蛋白和mRNA表达阳性密度与其均无统计学差异(P>0.05)。不同性别组间大鼠胫骨骨髓OPG蛋白和mRNA表达阳性密度进行比较,结果显示：雌性假手术组低于雄性假手术组,OVX组低于ORX组,雌性左归丸组高于雄性左归丸组,雌性右归丸组高于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。3.2左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓RANKL蛋白和mRNA表达的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓RANKL蛋白和mRNA表达阳性密度均显着升高；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显着减低,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显减低,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组阳性密度与其无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显减低,但仍明显高于雄性假手术组。不同性别组间大鼠胫骨骨髓RANKL蛋白和mRNA表达阳性密度进行比较,结果显示：雌性假手术组高于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。3.3左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值均显着升高；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显着减低,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显减低,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组阳性密度与其无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显减低,但仍明显高于雄性假手术组。不同性别组间大鼠胫骨骨髓RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值进行比较,结果显示：雌性假手术组高于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。4左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓中Wnt1、LRP-5及β-catenin蛋白和mRNA表达的影响4.1左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓Wnt1蛋白和mRNA表达的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓Wntl蛋白和mRNA表达阳性密度均显着增高；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显着降低,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显减低,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组阳性密度与其无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显减低,但仍明显高于雄性假手术组。不同性别组间大鼠胫骨骨髓Wnt1蛋白和mRNA表达阳性密度进行比较,结果显示：雌性假手术组低于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。4.2左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓LRP-5蛋白和mRNA表达的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓LRP-5蛋白和mRNA表达阳性密度均显着升高；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显着降低,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显降低,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组阳性密度与其无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显降低,但仍明显高于雄性假手术组。不同性别组间大鼠胫骨骨髓LRP-5蛋白和mRNA表达阳性密度进行比较,结果显示：雌性假手术组低于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。4.3左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓B-catenin蛋白和mRNA表达的影响相同性别组间进行比较,结果显示：与同性别假手术组相比,模型组(OVX组、ORX组)大鼠胫骨骨髓B-catenin蛋白和mRNA表达阳性密度均显着增高；与同性别模型组(OVX组、ORX组)相比,E2组、T组和雌性右归丸组阳性密度均显着减低,且与同性别假手术组无统计学差异；与OVX组相比,雌性左归丸组阳性密度明显减少,但仍明显高于雌性假手术组；与ORX组相比,雄性左归丸组阳性密度与其无统计学差异,而雄性右归丸组较之明显减少,但仍明显高于雄性假手术组。不同性别组间大鼠胫骨骨髓B-catenin蛋白和mRNA表达阳性密度进行比较,结果显示：雌性假手术组低于雄性假手术组,OVX组高于ORX组,雌性左归丸组低于雄性左归丸组,雌性右归丸组低于雄性右归丸组,且两者之间有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。结论1.去势均可导致同龄不同性别大鼠发生高转换型骨质疏松症,即骨吸收和骨形成均增加,但由于骨吸收大于骨形成,而使骨量丢失。所不同的是,OVX大鼠的骨转换率显着高于ORX大鼠,骨丢失率也明显高于后者。OVX大鼠和ORX大鼠骨髓中RANKL表达均显着上调,而OPG表达均显着下调,两者的比值(RANKL/OPG)也均明显增高,从而使破骨细胞的活性增强,骨吸收增加；同时,Wnt1、LRP-5和P-catenin表达均显着上调,从而使成骨细胞的活性增强,骨形成增加。但由于破骨细胞活性增强的幅度大于成骨细胞活性增强的幅度,而导致骨质疏松症的发生；去势所致的雌性大鼠的上述改变明显强于去势的雄性大鼠。这是去势均可导致雌、雄大鼠发生高转换型骨质疏松症,但雌性大鼠的骨转换以及骨丢失率明显高于雄性的机理之一。2.左归丸、右归丸对不同性别去势大鼠骨质疏松症的作用存在明显差异：左归丸对OVX大鼠骨质疏松症具有明显的疗效,而对ORX大鼠骨质疏松症没有疗效；右归丸对OVX大鼠和ORX大鼠骨质疏松症虽均有明显的疗效,但对OVX大鼠的疗效要明显优于ORX大鼠。3.左归丸、右归丸对不同性别去势大鼠骨质疏松症的作用产生差异的机制：(1)左归丸产生差异的机制是,左归丸能使OVX骨质疏松症大鼠骨髓中RANKL表达显着下调,而使OPG表达显着上调；同时,使Wnt1、LRP-5和β-catenin表达显着下调；通过此作用,导致骨吸收与骨形成均降低,抑制骨的高转换,使骨吸收与骨形成达到相对的平衡状态,从而防止骨量的丢失。而左归丸对ORX骨质疏松症大鼠骨髓中的以上关键因子无明显影响。(2)右归丸产生差异的机制是,右归丸对OVX骨质疏松症大鼠骨髓中OPG、RANKL以及Wnt1、LRP-5和β-catenin的作用与左归丸的相同,只是右归丸的作用强度要明显高于左归丸。右归丸能使ORX骨质疏松症大鼠骨髓中RANKL以及Wnt1、LRP-5和β-catenin表达均显着下调；但对OPG表达无明显影响,并且对RANKL、Wnt1、LRP-5和β-catenin的作用要明显弱于对OVX骨质疏松症大鼠的作用,从而造成右归丸对OVX骨质疏松症大鼠骨的高转换的抑制作用要明显强于对ORX骨质疏松症大鼠,进而导致其对前者骨质疏松症的疗效要明显优于后者。4.以上结果表明,“肾主骨”存在性别差异,OPG/RANKL破骨细胞调控通路和Wnt/LRP-5/β-catenin成骨细胞调控通路发生不同改变,是造成这种差异的机制之一。5.对于OVX大鼠骨质疏松症,右归丸的疗效明显优于左归丸；对于ORX大鼠骨质疏松症,右归丸有效而左归丸无效。提示：肾阳虚,命门火衰可能是去势所致骨质疏松症发生的主要原因。
李飞江[4]2016年在《低强度电磁场影响大鼠糖尿病肾病的体内外实验研究》文中认为糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)的发病率与日俱增,而其伴随的并发症对健康也产生了巨大威胁,例如骨质疏松、周围神经病变、糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)等,据统计全球大概有20%-40%的I型或II型糖尿病病人会发展成为DN。DN是慢性肾病死亡的首要原因,它大概占到全世界终末期肾病的50%。DN的典型特征是肾小球对蛋白质的通透性增加以及肾小球系膜细胞(Glomerular Mesangial Cell,GMC)的胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)沉积,上述病理改变最终造成肾小球硬化症以及严重的肾脏损伤。由于肾脏移植手术的高额费用,因而全世界与日俱增的DN发病率是一个非常敏感的普遍问题。高血糖及糖代谢紊乱在DN发生发展中起重要作用,如果导致肾损伤程度达到终末期,其可选择的治疗方法非常有限。目前在临床上,治疗DN主要是通过药物来控制血糖浓度,以及应用保护肾脏的药物,来达到联合治疗的目的。但是,上述药物对于部分DN患者往往副作用较大、耐药性差。因而,探求一种既安全又有效的非药物治疗DN的方法配合保护肾脏的药物来联合治疗DN显得非常必要。低强度电磁场(Low-intensity Electromagnetic Fields,LEMFs)作为一种非侵入式治疗手段,有促进术后创伤愈合、减轻组织水肿、消炎止痛等效果。糖尿病本身是一种慢性炎症的病变,能引起系膜区ECM中间产物的增加并减缓其降解速度,从而形成ECM沉积进而发展成为肾小球硬化症。Norton在1988年就已经发现LEMFs有助于降解体外培养的软骨细胞和皮肤纤维细胞ECM成份。因此,如果LEMFs的干预能有效减少系膜细胞的ECM合成并提高其降解,将有助于对DN患者肾脏的保护。有相关研究报道了波长为670 nm的低强度的光照(一种极高频的电磁波)可改善链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病大鼠的肾脏功能以及抗氧化的能力。俄罗斯学者曾采用低强度特高频(300-3000MHz)治疗设备,用于治疗小儿血糖代谢紊乱引起的肾损伤,并发现能缓解损伤程度以及阻止新的类脂聚积引起的渐进性坏死的发生。这些研究虽然能反映出电磁场对糖尿病肾病模型动物和患者都有一些积极的作用,但是缺乏系统的实验探讨其可能的机理,而且这两个的实验均采用高频电磁场,其产生的热效应也是不可忽视的。除此之外,近几十年内很少有相关实验研究能引起国内外学者的广泛关注。因此,本课题旨在研究LEMFs对于大鼠糖尿病肾病的影响,为防治糖尿病肾病提供新的思路和实验依据。全文主要探讨了以下叁个问题:(1)LEMFs的干预能否影响大鼠DN模型细胞ECM代谢;(2)叁种不同波形LEMFs中哪种波形对ECM合成降解及相关信号通路影响最大;(3)LEMFs的干预能否对DN模型大鼠的肾脏起一定保护作用。第一部分研制一种能输出任意波形的电磁发生平台目的:电磁生物效应研究中,最主要的环节就是搭建电磁发生平台。在长期的研究中,我们基本采用模拟电路搭建平台,如果需要改变电磁参数,就需要另外设计电磁发生装置,使研究周期大大加长,而且本研究中也涉及多种波形参数。因此,需要研制一款可以输出任意波形的低强度电磁发生平台。方法:采用虚拟仪器技术、模块化设计、可编程思路编写数字信号发生软件,实现了数字信号输出,通过D/A采集卡转换成模拟信号,再进行功率放大,最后线圈负载输出。结果:该平台只需要重新编写软件的“波形模块”部分,就能得到需要的参数,理论上能够输出任意波形的LEMFs。结论:该平台可方便输出不同波形并确保其一致性,使实验设计更加科学,有利于优化电磁参数。ECM代谢的影响第二部分研究不同波形LEMFs对高糖培养的肾小球系膜细胞株(HBZY-1)目的:LEMFs参数多样,无法一一进行研究,在初步的细胞实验中,我们选择叁种在电磁非热生物效应研究中较为常用的波形参数。如何解决ECM异常堆积,是目前研究和治疗肾小球硬化症的主要方向,本部分就是研究LEMFs对DN模型细胞ECM代谢产物的表达以及参与调节ECM的主要信号通路是否有积极的影响,并找到叁种波形中的最优参数。方法:实验采用1.6m T、15Hz的正弦、方波、脉冲群分别对高糖培养的HBZY-1细胞株进行干预(8 h/d),连续3d。完成后采用MTT法检测细胞活性,ELISA法检测上清液中TGFβ1、FN、MMP-2蛋白含量,荧光定量PCR检测TGFβ1、FN、MMP-2 m RNA含量,Western blot法检测p38MAPK、ERK、Smad3总蛋白及磷酸化蛋白的表达。结果:1、所有高糖组在1d后都表现出较强的细胞活性,与正常组比较具有显着差异;与高糖对照组进行比较,方波和脉冲群组在干预2d时开始抑制HBZY-1细胞株的增殖,正弦组始终没有显着差异;脉冲群组细胞活性显着低于方波组。2、所有高糖组的TGFβ1、FN蛋白表达显着高于正常组,MMP-2则相反;方波和脉冲群组TGFβ1、FN蛋白表达显着低于高糖对照组,而在MMP-2蛋白的表达上显着高于高糖对照组,正弦组在这些蛋白表达上与高糖对照组无显着差异;脉冲群组在TGFβ1蛋白表达上显着低于方波组,而在MMP-2蛋白表达上则相反,在FN蛋白表达上则无显着差异。3、所有高糖组的TGFβ1、FN m RNA表达显着高于正常组,MMP-2则相反;方波和脉冲群组TGFβ1、FN m RNA表达显着低于高糖对照组,而在MMP-2 m RNA的表达上显着高于高糖对照组,正弦组在这些m RNA表达上与高糖对照组无显着差异;脉冲群组在TGFβ1、FN m RNA表达上显着低于方波组,在MMP-2 m RNA表达上则相反。4、所有高糖组的磷酸化Smad3蛋白相对表达量显着高于正常组;脉冲群组磷酸化Smad3蛋白相对表达量显着低于高糖对照组,而方波和正弦组无显着差异。5、所有高糖组的磷酸化p38MAPK、磷酸化ERK蛋白相对表达量显着高于正常组;方波和脉冲群组磷酸化p38MAPK蛋白相对表达量显着低于高糖对照组,而正弦组无显着差异;与方波组相比,脉冲群组磷酸化p38MAPK蛋白相对表达量显着低于方波组;脉冲群组磷酸化ERK蛋白相对表达量显着低于高糖对照组,而方波和正弦组无显着差异。结论:方波和脉冲群能有效地抑制高糖诱导的HBZY-1细胞的增殖,一方面通过抑制系膜细胞TGFβ1、FN的合成减少ECM的沉积,另一方面通过促进MMP-2的合成加速ECM降解。此外,方波和脉冲群还通过抑制TGFβ1/Smad3、MAPK信号通路减少系膜细胞的损伤。脉冲群对系膜细胞的作用效果显着好于方波。第叁部分研究PEMFs对STZ诱导的糖尿病大鼠DN的影响。目的:用体外研究得到的最优参数(PEMFs)对I型糖尿病大鼠进行干预,研究在体环境下PEMFs对DN大鼠肾脏的保护效果,并验证其对ECM代谢产物以及参与调节ECM的通路的影响能否跟体外实验结果相印证。方法:将成年SD雄鼠随机按体重的匹配分为3组:正常组(非糖尿病大鼠)、模型组(糖尿病模型大鼠)以及脉冲群组(糖尿病模型+PEMFs照射,8 h/d)。干预6 wks后处死取样,通过光镜和电镜来检测肾脏的形态学结构,q RT-PCR检测肾皮质TGFβ1、FN、MMP-2 m RNA表达,Western blot法测肾皮质TGFβ1、FN、MMP-2、Smad3、p38MAPK、ERK、p-Smad3及p-MAPK蛋白表达。结果:1、经过6 wks的PEMFs照射,注射STZ患有DN大鼠的低体重和高血糖症状并无缓解。2、PEMFs对于糖尿病大鼠DN病程的发展,能够缓解模型大鼠肾脏结构的病理改变,其表现为与模型组相比光镜下较轻的肾小球、肾小管--间质损伤,以及电镜下较轻的肾小球基底膜与足细胞损伤。3、与对照组比较,模型组和脉冲群组肾皮质TGFβ1、FN m RNA的表达显着高于对照组,而MMP-2 m RNA的表达则相反;与模型组比较,脉冲群组能显着抑制肾皮质TGFβ1、FN m RNA的表达,但是显着促进MMP-2 m RNA表达。4、与对照组比较,模型组和脉冲群组肾皮质TGFβ1、FN蛋白的表达高于对照组,而MMP-2蛋白表达则相反;与模型组比较,脉冲群组能显着抑制肾皮质TGFβ1、FN蛋白的表达,但是显着促进MMP-2蛋白表达。5、模型组和脉冲群组的磷酸化Smad3、p38MAPK、磷酸化ERK蛋白相对表达量显着高于对照组;脉冲群组磷酸化Smad3、p38MAPK、磷酸化ERK蛋白相对表达量显着低于模型组。结论:通过体内实验研究,组织病理学结果证明PEMFs的干预能缓解DN大鼠肾损伤的病理改变过程,其分子机制可能是通过抑制TGFβ1/Smad3、MAPK信号通路的作用,从而影响相关蛋白(TGFβ1、FN、MMP-2)的表达,进而起到缓解DN肾损伤的病理改变的作用,与体外实验的结果一致,这也证明了TGFβ1/Smad3、MAPK信号通路是参与DN发生发展各种途径中的重要通路。总结通过对电磁场非热生物效应的研究积累,我们创新性地提出LEMFs可能通过调节ECM代谢缓解DN病程的理论,也是首次系统地通过体内外实验研究了LEMFs对大鼠DN的影响,初步证明了LEMFs中的方波和脉冲群能够缓解高糖诱导的HBZY-1细胞ECM代谢紊乱,抑制TGFβ1介导的Smad3、MAPK信号通路减轻系膜细胞损伤,再通过体内实验进一步验证了脉冲群通过调解ECM代谢并且抑制TGFβ1介导的Smad3、MAPK信号通路缓解DN肾损伤程度。我们的实验研究将LEMFs的修复损伤、消炎消肿的功效与糖尿病引起的肾损伤结合,发现了LEMFs能够缓解DN肾损伤程度,并在微观和宏观的层面共同揭示了其可能的分子机制,为防治糖尿病肾病提供新的思路和实验依据。
佚名[5]2002年在《作者索引》文中提出(按汉语拼音字母顺序排列,索引论文前3位作者)AAdrian W Gelb Development 0f anaesthesiology (15):1 345一1346艾玉峰应用带蒂皮瓣、肌皮瓣修复小腿骨外露、骨髓炎创面 (2):183 组织工程骨复合骨
张永晟[6]2014年在《不同浓度RANKL对破骨细胞中NFATcl,c-Src和RANK基因表达的影响》文中研究指明目的：体外实验观察不同浓度核因子KB受体活化因子配体(RANKL)对大鼠破骨细胞活化T细胞核因子1(NFATcl)、原癌基因c-Src、核因子KB受体活化因子(RANK)mRNA表达的影响；研究破骨细胞中活化T细胞核因子1、原癌基因c-src和核因子KB受体活化因子在骨质疏松中的发病过程中基因的表达是否与核因子KB受体活化因子配体的浓度存在相关性。方法：实验采用5周龄SD大鼠获取骨髓基质细胞(BMSC),加入集落刺激因子(M-CSF)及RANKL体外诱导培养破骨细胞,在实验过程中每组分别加入低、中、高(50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml)3种浓度的RANKL及均加入M-CSF (25ng/ml),实验对照组加入RANKL(0ng/ml)及M-CSF(25ng/ml);培养7天后,采用实时荧光定量PCR法检测NFATcl、c-Src、RANK mRNA的表达。结果：NFATcl、c-Src、RANK基因表达与RANKL的浓度呈依赖性,与实验对照组M-CSF (25ng/ml)+RANKL (0ng/ml)组相比,中、高浓度的RANKL均促进了NFATcl及c-Src mRNA (p<0.01,p<0.01)的表达；与M-CSF (25ng/ml)+RANKL (0ng/ml)组相比,低、中、高浓度的RANKL均促进了RANK mRNA (p<0.01,p<0.01和p<0.01)的表达；与M-CSF (25ng/ml)+RANKL (50ng/ml)组相比,中、高浓度的RANKL均促进了NFATcl mRNA(p=0.013,p<0.01)的表达；与M-CSF (25ng/ml)+RANKL (50ng/ml)组相比,中、高浓度的RANKL促进了c-Src mRNA (p<0.01, p<0.01)的表达；与M-CSF (25ng/ml)+RANKL (75ng/ml)组相比,高浓度的RANKL均促进了NFATcl,c-Src和RANK(p<0.01,p<0.01和p<0.01)的基因表达。结论：RANKL可通过促进了NFATc1,c-Src和RANK mRNA的表达并促进破骨细胞的分化、成熟,且表现出一定的浓度依赖性。RANKL作为OPG/RANK/RANKL信号传导通路中的因子,NFATc1,c-Src和RANK作为其下游及调控因子,调控了破骨细胞的分化、成熟,在骨质疏松的发病机制中发挥着重要的作用。
田发明[7]2011年在《辛伐他汀对大鼠骨质疏松性骨折及BMSCs成骨分化的影响》文中研究说明骨质疏松是一种以骨量减少,骨的微观结构退变,骨脆性增加而易于发生骨折的一种全身性代谢性骨骼疾病,随着社会人口的老龄化,骨质疏松症的发病率呈逐年上升趋势。骨质疏松性骨折是骨质疏松症最严重的并发症,因其组织学基础差、破骨细胞功能活跃、骨形成能力相对不足,治疗也更加困难,严重威胁着中老年人群的健康和生存质量。探索行之有效的药物干预措施可降低骨质疏松行性骨折发病率,提高治愈率,改善该类人群的生存质量。他汀类药物是竞争性3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂,能够降低肝内胆固醇生物合成,临床上主要用于治疗高脂血症。自1999年首次有研究报道他汀类药物的成骨潜能后,包括辛伐他汀在内的他汀类药物促进骨形成的作用逐渐成为诸多学者关注和研究的对象,研究结果因实验设计的不同而结论各异。临床试验和体内给药的动物实验中对辛伐他汀的促骨形成作用存在争议,有研究表明辛伐他汀可提高正常大鼠骨转换水平,另有研究发现辛伐他汀可部分阻止骨质疏松动物模型去卵巢大鼠骨量的丢失,但对骨质疏松性骨折的作用尚有待深入研究。相对于体内实验中的诸多争议,体外实验中,包括辛伐他汀促进骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)或前成骨细胞系的成骨分化的作用比较肯定,但具体作用机制尚不明确。本研究通过建立骨质疏松性骨折大鼠模型及体外培养BMSCs并给予辛伐他汀干预,从体内体外不同角度探讨辛伐他汀促骨形成作用及其作用机制。第一部分辛伐他汀对骨质疏松大鼠股骨骨折愈合的影响虽然有部分研究认为骨质疏松对骨折愈合无显着不良影响,但多数基础和临床试验都证实骨质疏松对骨折愈合有延迟作用。辛伐他汀虽表现出一定的促骨形成作用潜能,但在辛伐他汀对骨折愈合作用的报道中以正常(非骨质疏松性骨折)居多,通过口服给药干预骨质疏松性骨折(模型)的研究未见报道。双侧卵巢切除大鼠是公认的骨质疏松动物模型,本研究中也以此卵巢切除大鼠的骨折模型为干预对象。目的：本实验拟通过制作双侧卵巢切除大鼠股骨中段骨折建立骨质疏松性骨折模型,并给予辛伐他汀干预,探讨骨质疏松对骨折愈合影响及辛伐他汀对骨质疏松性骨折愈合的作用及机制。方法：12周龄雌性Sprague-Dawley大鼠40只随机分成5组,每组8只：假手术(Sham)组；卵巢切除(OVX)组；正常骨折对照组(N+Fx)；卵巢切除+骨折+生理盐水对照(OVX+Fx+V)组；卵巢切除+骨折+辛伐他汀(OVX+Fx+SIM)组。除Sham、N+Fx组外,其余各组大鼠行双侧卵巢切除术,N+Fx组、OVX+Fx+V组与OVX+Fx+SIM组于卵巢切除术4周后制作骨折模型,采用右股骨中段横行开放性骨折,克氏针固定；OVX+Fx+SIM组给予辛伐他汀灌胃干预(20mg/kg/d), N+Fx组OVX+Fx+V组给等量生理盐水。Sham组和OVX组于术后4周处死,取大鼠右侧股骨标本,行双能X线骨密度仪(DEXA)测量右股骨骨密度；其余叁组于骨折后6周处死,完整取出右侧股骨。标本进行CR摄片并评分、DEXA测量右股骨整体骨密度(total bone mineral density, tBMD)、中段骨密度(middle bone mineral density, mBMD)和远端骨密度(distal bone mineral density, dBMD),将组织于10%中性甲醛缓冲固定液中固定48 h,后经常规脱钙、石蜡包埋并制备5um切片,HE染色,镜下行组织学观察。结果：1骨质疏松模型建立：卵巢切除后4周,OVX组BMD显着低于Sham组(P<0.05),体重明显高于Sham组,差异均有统计学意义(P<0.05)。2各骨折组右股骨骨密度：OVX+Fx+V组、OVX+Fx+SIM组tBMD、mBMD和dBMD均显着低于N+Fx(P<0.05), OVX+Fx+SIM组各段BMD均高于OVX+Fx+V组,但差异无统计学意义(P>0.05)。3 CR摄片：骨折后6周,OVX+Fx+SIM组与OVX+Fx+V组整体愈合情况较N+Fx组差,多数标本骨折线清晰,X线评分均显着低于N+Fx组,OVX+Fx+SIM组高于OVX+Fx+V组,但差别无统计学意义。4组织学观察：N+Fx组大鼠骨痂组织更为成熟,可见板层骨形成,OVX+Fx+V组、OVX+Fx+SIM组软骨成分比例明显较高,均未见板层骨形成。结论：1大鼠双侧卵巢切除4周后骨量显着低于正常大鼠,适于制作骨质疏松性骨折模型。2骨质疏松大鼠骨折愈合较正常延迟,辛伐他汀可部分阻止去卵巢大鼠骨量丢失并表现出一定的促进骨折愈合的作用趋势,但效果并不显着。第二部分辛伐他汀促进大鼠BMSCs成骨分化BMSCs具有多向分化潜能,在特定条件下可以向多种细胞包括成骨细胞分化,因此在组织工程、细胞移植及基因治疗等领域倍受重视。在BMSCs向不同方向分化过程中会伴有特异性标志蛋的表达和功能活性的变化,碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)在成骨细胞分化过程中活性特异性增高,细胞外基质矿化小结形成等特异性生物学行为也是鉴定成骨细胞功能的重要参照。作为降脂药物之一,辛伐他汀治疗骨质疏松、骨折及骨缺损等的作用潜能已成为近来研究的热点。目的：本实验旨在通过采用全骨髓培养法体外诱导培养大鼠BMSCs并予以辛伐他汀干预,探讨该培养方法获取BMSCs的可行性以及辛伐他汀对BMSCs成骨分化及细胞外基质矿化能力的影响。方法：取6周龄雄性SD大鼠股骨、胫骨骨髓,进行细胞培养,并于第3天开始成骨诱导培养(维生素C50ug/ml,β-磷酸甘油钠10umol/ml),同时实验组(SIM)加入辛伐他汀(1×10-7mol/L),对照组(V)加入等量溶剂。细胞培养的第14天提取第2代细胞,采用流式细胞术检测细胞表面标志抗原CD45、CD11b的表达率对培养的大鼠BMSCs进行鉴定；对爬片细胞进行碱性磷酸酶(ALP)染色、及细胞裂解液上清ALP比活性观察细胞成骨分化能力；第21天行Von Kossa染色观察细胞外基质矿化能力。结果：1流式细胞术检测结果：第2代细胞表面标志抗原CD45阳性表达率6.75±1.26%,CDl1b阳性表达率为7.91±0.96%。2 ALP染色及比活性检测：细胞培养的第14天SIM组ALP阳性细胞比例、比活性显着高于V组(P<0.05)。3 von Kossa染色：第21天SIM细胞外基质矿化能力明显强于V组。结论：1大鼠全骨髓培养法可获得BMSCs,在一定诱导条件下可向成骨细胞分化,表现出成骨分化及细胞外基质矿化能力。2辛伐他汀可上调ALP的表达和活性,促进BMSCs的成骨分化,并表现出更强的细胞外基质矿化能力。第叁部分辛伐他汀干预下大鼠BMSCs基因表达谱先前研究证实辛伐他汀具有促进体外培养的BMSCs向成骨细胞分化的作用,但具体作用机制尤其是基因水平的分子机制尚不明确,目前对辛伐他汀干预BMSCs分化方向的作用机制的研究仅限于个别基因,如BMP-2、cbfal(成骨分化),LPL、PPARγ2(成脂分化)。基因芯片技术的发展使同时大批量观察基因表达水平成为可能,通过对敏感基因的筛查分析建立相关干预条件下基因表达谱,不仅可全面分析作用机制,更为下一步研究确定干预靶标提供了依据。目的：本实验旨在通过基因芯片筛选辛伐他汀作用下成骨定向诱导分化的BMSCs差异表达基因,建立相关基因表达谱,以期进一步明确辛伐他汀促进BMSCs成骨分化的作用机制,为后续研究及其早日应用于相关骨病的治疗提供理论依据和参考。方法：取6周龄雄性SD大鼠股骨、胫骨BMSCs进行培养,第3天改用成骨诱导培养基,同时实验组(SIM)加入辛伐他汀(1×10-7mol/L),对照组(V)加入等量溶剂。第21天提取RNA,测定OD260/280值并凝胶电泳检测RNA纯度质量；纯化后逆转录合成cDNA,荧光标记后与大鼠全基因组寡核苷酸芯片(G4130A)杂交、扫描后筛选出差异表达的基因,取同批次RNA行Real-time RT-PCR检测,验证部分差异表达基因mRNA的表达。结果：1 RNA纯度及质量：凝胶电泳示RNA18s、28s条带清晰,无杂带,OD260/280值分别为2.14(V)、2.15(SIM),提示RNA质量完好,可用于基因芯片检测。2在22575个基因中,共检测出502个差异表达基因,包括脂类代谢、炎性因子、转录因子、细胞信号传导等,其中ALP1、TGFβ1、OCN、DLX5、Axin2、BMP-2、IBSP、MMP13等多个因子与成骨分化相关。3 Real-time PCR验证：经验证多个基因表达所检测基因TGF-β1、BMP-2、MMP-13、OCN、ALP,两组间表达差异与芯片结果基本一致。结论：基因芯片分析提示辛伐他汀能够调控成骨分化过程中大鼠BMSCs包括脂类代谢、炎性因子、物质合成与转运以及与成骨分化相关基因的表达,其促进BMSCs向成骨细胞分化的作用机制可能与此有关。
蔡华安[8]2010年在《恒旋磁场治疗运动性损伤疼痛症临床研究》文中研究表明目的：电场、磁场和力场这叁种物理因子是临床物理康复治疗中最重要的生物医学工程技术。采用恒磁场治疗运动系损伤是近年来临床物理康复医学在这方面取得的突破性进展的课题。通过利用恒旋磁场对机体的生物学效用,以获得机体在不同暴磁定量负荷下生物学效应及其作用阈值,从而探讨恒旋磁场治疗运动性损伤引起疼痛症的临床疗效和作用机理,为临床运用提供一种安全、有效的并可循证的物理治疗方法。方法：60例运动损伤患者随机分为治疗组(30例,恒旋磁场治疗组)和口服药物组(30例,口服药物组),并将30例健康人群作为正常对照组。治疗组按旋转频率和暴磁治疗时间又随机分成280转／min(4D)、350转／min(5D)两组,各15例。以受伤部位为中心作为磁场中心点,平卧位,分别给予恒定磁场强度为0.4T(特斯拉),4D和5D的旋转频率,各暴磁30min和40min,1次／d,连续7次,7d为一个疗程；口服药物组口服美洛昔康片,7.5 mg,1次／d,7d为一个疗程,治疗7天,观察两组患者总疗效、疼痛相关情况,血浆B-内啡肽(β-EP),P物质(SP)水平以及不良反应发生率等情况。同时观察两组患者与正常对照组血浆B-内啡肽(β-EP),P物质(SP)的变化。结果：两组患者治疗总有效率治疗组为96.67%,对照组为90.0%,两组临床总疗效比较无显着性差异(P>0.05)。但在减轻疼痛强度、减少疼痛次数、缩短疼痛持续时间、延长止痛作用维持时间、提高血浆β-EP、降低SP水平及不良反应发生等方面,两组治疗前后自身比较以及与正常对照组比较均有显着性差异(P<0.05或／P<0.01)。治疗组组间4D组(280转／min)和5D组(350转／min)比较,两组在总疗效、镇痛时间、次数、持续时间以及血浆β-EP、SP方面没有显着性差异(P>0.05)。结论：1.恒旋磁场对急性运动损伤疗效确切。临床观察证实恒旋磁场作用下运动损伤疼痛强度、疼痛次数、疼痛持续时间、止痛起效时间及维持时间均得到明显改善。2.恒旋磁场治疗运动损伤疼痛症,其镇痛机制可能与提高血浆β-EP含量,降低SP水平有关。
参考文献：
[1]. 脉冲电磁场防治骨质疏松症的体内外实验研究[D]. 韩利华. 第四军医大学. 2004
[2]. 仿生脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的实验研究[D]. 谢肇. 第叁军医大学. 2004
[3]. 基于破骨细胞和成骨细胞调控通路探讨左、右归丸对不同性别去势大鼠骨质疏松症的作用差异及其机制[D]. 付小卫. 中国中医科学院. 2014
[4]. 低强度电磁场影响大鼠糖尿病肾病的体内外实验研究[D]. 李飞江. 第四军医大学. 2016
[5]. 作者索引[J]. 佚名. 第四军医大学学报. 2002
[6]. 不同浓度RANKL对破骨细胞中NFATcl,c-Src和RANK基因表达的影响[D]. 张永晟. 厦门大学. 2014
[7]. 辛伐他汀对大鼠骨质疏松性骨折及BMSCs成骨分化的影响[D]. 田发明. 河北医科大学. 2011
[8]. 恒旋磁场治疗运动性损伤疼痛症临床研究[D]. 蔡华安. 湖南师范大学. 2010
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