一、禽类圆环病毒病——PMWS研究的先导（论文文献综述）
姚舜禹[1]（2020）在《表达NDV蛋白的重组酵母构建及免疫效力评价》文中研究表明新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）是1927年在英国纽卡斯尔首次出现的一种禽类病毒,主要伤害病禽的消化系统和呼吸系统,甚至导致死亡,是严重威胁全球家禽养殖业的病原之一。应用疫苗是防控新城疫病毒感染的有效手段,现有NDV疫苗所用毒株大多为上世纪50年代开发的毒株所构建,与目前导致新城疫疫情的毒株间已有较大的遗传差距,因此需要开发新的新城疫疫苗。本研究构建了锚定型表达包含NDV融合蛋白（fusion glycoprotein,F）与血凝素-神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase,HN）截短体蛋白的重组酿酒酵母菌株,研究了其表达特性,并通过对动物免疫初步评价了重组酵母菌株作为候选疫苗的免疫效力。主要结果如下:1.NDV F和HN基因的扩增与转录单位构建:根据抗原表位分析,并结合他人的研究成果,选择新城疫F基因第241位碱基至888位碱基以及HN基因的第25位碱基至528位碱基序列,应用生物信息学技术分析这部分片段的一,二,三级结构组成和特点,确定其氨基酸序列,等电点和亲疏水性等理化性质,构建系统进化树,并连接到酿酒酵母表达载体（POT）中,构建带有抗原表位的转录单位。2.NDV F与HN蛋白在酿酒酵母表面的表达及鉴定:采用Yeast Fab Assembly的技术,通过II型内切酶的识别位点与其切割位点不同的特点将转录单位与同源臂和Leu营养筛选标记串联,利用Li Ac转化法将其整合到ST1814-G酵母基因组。经营养缺陷型筛选、PCR基因型验证、Western Blot分析,免疫荧光鉴定,证实成功构建了NDV F与HN蛋白串联展示于酵母细胞表面的菌株,通过生长曲线检测,结合Western Blot灰度分析结果,证实重组蛋白在36小时表达量最高。与阴性对照组相比,外源蛋白F与HN的表达对宿主菌的酵母菌生长影响不大。3.重组酵母菌的免疫效果评价:构建HN蛋白的原核表达载体,并表达纯化HN原核蛋白,以其来检测动物实验鸡血清的Ig G含量,ELISA实验结果证明重组酵母免疫后的鸡血清中的Ig G含量明显高于喂食原始酵母菌（ST1814G）的阴性对照组,表明重组酵母有一定的免疫原性。综上所述,本研究构建的串联表达新城疫病毒F和HN蛋白的重组酿酒酵母菌株,动物免疫结果证实该菌株可诱导产生特异性抗体,表明重组菌具有免疫保护性,可作为NDV预防的潜在候选疫苗进行工业开发。
郝俊芳[2]（2020）在《猪圆环病毒2型Cap蛋白亲和肽配基的理性设计、鉴定及应用》文中指出猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus-associated disease,PCVAD）的主要病原体,给全球的养猪业带来了巨大的经济损失。疫苗接种是预防和控制PCVAD的主要手段,目前PCV2疫苗主要包括灭活疫苗和亚单位疫苗,而PCV2 Cap作为这两类疫苗的主要有效成分,可自组装成病毒样颗粒（VLP）,诱导机体产生中和抗体,具有良好的抗原性。灭活疫苗由PK15细胞生产制备,但病毒滴度低、生产成本高;亚单位疫苗是用大肠杆菌或杆状病毒—昆虫细胞系统表达制备,因安全性高,受到越来越多的重视。在实际生产过程中,抗原的含量和纯度决定了疫苗的品质。PCV2亚单位疫苗面临的主要问题是抗原蛋白纯化工艺复杂且处于初级纯化水平。针对这一问题,目前急需一种快速高效的纯化方法,本研究关于PCV2 Cap蛋白的亲和肽配基展开系列实验研究,主要分为以下四个部分:1.猪圆环病毒2型Cap蛋白亲和肽配基的理性设计高分辨率的结构使基于靶标蛋白三维模型的计算机辅助设计成为可能。本研究借助分子对接虚拟筛选技术,构建了长度为2-9个氨基酸残基的虚拟肽库。将库中的多肽与PCV2 Cap蛋白上的特定位点实施分子对接,并通过SYBYL/MOLCAD模块分析复合物的相互作用力,然后利用一致性评分函数Cscore值对分子模拟结果进行综合评定与分析。最后,设计出67条具有特异性识别PCV2 Cap的多肽序列,为后续的PCV2 Cap蛋白纯化和新型疫苗的设计提供帮助。2.猪圆环病毒2型Cap蛋白亲和肽配基的筛选与鉴定本研究在大肠杆菌中成功表达可溶性的重组PCV2 Cap蛋白,经Ni磁珠纯化可得到高纯度且具有生物活性的PCV2 Cap蛋白,为亲和肽配基的筛选和鉴定提供了材料基础。通过ELISA定性初筛和复筛,从67条多肽序列中鉴定出13条（命名L1-L13）与PCV2 Cap蛋白反应较好的多肽,并对其进行下一步亲和性和特异性的表征。结果显示5条候选肽:L4、L7、L9、L11、L13对PCV2 Cap蛋白具有高亲和性和特异性。LSPR定量检测5条候选肽的亲和力常数KD值,结果显示L4、L7、L9、L11和L13多肽序列的KD值分别为1.23μM、1.03μM、6.71μM、103 n M和9.97μM,表明这5条候选肽与PCV2 Cap蛋白存在不同程度的亲和性结合。该研究表明基于分子对接虚拟筛选技术和体外实验验证相结合的方法,可以提高筛选多肽序列的正确率,为后续亲和吸附剂的制备提供了高亲和力多肽配基。3.亲和肽配基吸附剂的制备及纯化条件优化为了解决实际生产中PCV2 Cap纯化的难题,本章节将上一章通过体外实验筛选到的5条候选肽进行PCV2 Cap蛋白纯化的初步鉴定,并将性能较好的L11-DYWWQSWE作为最佳肽配基与NHS琼脂糖磁珠（Na MB）偶联,制备Na MB-L11亲和吸附剂。在纯化过程中,重点研究亲和吸附剂的液相条件（p H和盐离子浓度）和固相性质（配体密度）对纯化PCV2 Cap蛋白的影响,也对洗脱条件进行了优化。实验结果表明Na MB-L11亲和吸附剂的最佳纯化条件为p H 9.0、Na Cl250 mmol/L和配基密度1.25 mmol/L,其在一步纯化中得到的PCV2 Cap蛋白纯度为98%和回收率为90%。4.构建纯化自组装的PLGA-PCV2 Cap纳米颗粒新型纳米颗粒疫苗近年来取得了很大研究进展,其中高分子材料聚合物PLGA作为疫苗递送载体的研究最为关注。本实验将L11亲和肽与羧基PLGA共价偶联（PLGA-L11）,然后,加入重组PCV2 Cap蛋白上清液与其孵育结合,通过简单的重复离心,可以纯化富集到自组装的PLGA-PCV2 Cap纳米颗粒。体外研究结果表明PLGA分别在浓度为200μg/m L和100μg/m L时,对DC2.4和RAW264.7细胞无毒性,同时可以有效促进APCs对PCV2 Cap蛋白的摄取。在小鼠实验中,与溶液状态的PCV2 Cap相比,PLGA-PCV2 Cap能有效刺激机体产生更高的抗体水平,中和抗体的滴度也显着提高。这项研究提出了一种基于亲和肽的新疫苗构建策略,利用PLGA纳米颗粒可以高密度展示纯化富集到的PCV2 Cap抗原阵列,可以有效提高机体的抗体水平。
牟笛,许静斯,冯佳昊,陈安,李雪娇[3]（2020）在《我国猪肉供应风险及对策研究》文中认为文章采用智库DIIS理论方法,全面调研我国生猪产业发展现状和最近的猪肉价格上涨情况,广泛收集准确可靠的生猪产业数据,进行统计和分析,揭示我国生猪产业发展的问题。此后,走访调研相关部门,综合专家研讨结果,得出应对我国猪肉供应风险的政策建议。研究结果显示,我国猪肉产量下降、价格上涨的社会影响较大,与我国生猪养殖生产效率低、非洲猪瘟疫病横行、养殖业环保压力大、从业体系不完善等问题关系密切。为缓解我国猪肉供需不平衡带来的价格上涨问题,相关部门应加强宏观调控和指导,完善顶层设计,从提升生物安全防护水平、优化地方生猪养殖布局、调整食品消费结构等方面开展工作。
刘畅[4]（2019）在《截短钙网蛋白融合FMDV VP1及PCV2 Cap蛋白表达形成多聚体的免疫原性分析》文中提出口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是一种高度接触性的偶蹄动物的传染病;其病原体为口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）,结构蛋白VP1为最重要的抗原性蛋白。猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease,PCVD）是猪的重要传染病之一,引发该病的病原体为猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）,Cap蛋白是病毒的核衣壳蛋白。钙网蛋白（Calreticulin,CRT）是一种长度为46 kDa的内质网Ca2+结合蛋白,全长或截短的CRT具有有效促进蛋白折叠和聚合的作用。CRT融合外源蛋白也能维持聚合物的结构和良好的免疫原性。目前,接种疫苗仍旧是预防FMDV以及PCV2感染的最有效途径。为了制备安全有效的O型FMDV和PCV2的亚单位疫苗,分别利用O型FMDV的VP1蛋白以及PCV2的Cap蛋白融合不同长度的截短CRT原核表达形成高分子的多聚体,并分别以小鼠以及豚鼠为动物模型,检测了疫苗的免疫潜力。主要结果如下:1.采用全长的VP1蛋白分别在N端及C端融合不同长度的截短CRT（120-250 aa/120-308 aa）,成功构建了4种不同形式的VP1-CRT融合蛋白（rV4C,rC4V,rV5F和rF5V）。采用了伴侣蛋白Tf16共表达的方法实现了VP1-CRT融合蛋白的可溶性表达。采用凝胶过滤的方法成功实现了VP1-CRT融合蛋白的纯化,并验证其能够形成多聚体形式。采用动态光散射（Dynamic Light Scattering,DLS）等方法检测表明VP1-CRT融合蛋白全部能够形成直径为100 nm左右的大颗粒蛋白。间接ELISA方法分析VP1-CRT融合蛋白的全部能够特异性识别O型FMDV阳性血清,O型FMDV单克隆抗体2D2以及FMDV多肽（VP1 141-160 aa）单抗3D-A11,反应原性良好。2.纯化后的VP1-CRT融合蛋白配合佐剂制成疫苗,初步免疫小鼠,间接ELISA以及双抗夹心ELISA方法检测小鼠免疫后血清中产生了高水平的能够识别VP1蛋白的抗体以及结合FMDV的抗体。免疫豚鼠结果表明所有VP1-CRT融合蛋白可以刺激豚鼠产生高水平的体液免疫应答,rC4V组豚鼠产生的抗体水平与灭活疫苗组无差异。同时检测了豚鼠淋巴细胞分泌IFN-γ,IL-10,IL-18,TNF-α,GM-CSF细胞因子的含量和淋巴细胞的增殖情况,结果表明免疫后的豚鼠产生了一定水平的细胞免疫应答。从7种不同种类的佐剂中优化合适佐剂与重组蛋白配伍,最终鉴定佐剂MontanideTM ISA 50V2和rC4V是最优组合配比疫苗。3.以rC4V为检测抗原,建立了间接rC4V-ELISA检测方法,敏感性和特异性可以分别达到84.2%以及100%。检测了376份临床血清,rC4V-ELISA与LPB-ELISA试剂盒的符合率达到84.4%,该方法具有检测FMDV抗体的潜力,能够用以监测疾病感染及免疫后的抗体水平。4.采用全长的Cap蛋白分别在N端及C端融合不同长度的截短CRT（120-250 aa/120-308 aa）,成功构建了4种不同形式的Cap-CRT融合蛋白（rP4C,rC4P,rP5F和rF5P）。常规优化可溶表达条件成功实现了为了rF5P的可溶性表达。通过Ni-NAT亲和层析纯化的方法获得90%以上纯度的重组蛋白,凝胶过滤的方法分析rF5P也能够形成多聚体形式。DLS等方法检测结果表明rF5P形成的大颗粒直径为100 nm。对前期临床送检的病料中分离的PCV2流行毒株DF-1进行连续培养,病毒滴度可达107.5TCID50/mL,为下一步疫苗研究奠定基础。纯化后的rF5P配合佐剂制成疫苗免疫小鼠,ELISA和IPMA检测小鼠免疫后产生了高水平的体液免疫水平,抗体效价可持续至免疫后56天与商品化疫苗无差异。同时检测了小鼠淋巴细胞分泌细胞因子含量和淋巴细胞的增殖情况,结果表明免疫后的小鼠也能够产生了一定水平的细胞免疫反应。小鼠攻毒DF-1后,RT-PCR检测心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织中的病毒含量,结果表明rF5P疫苗有效地降低了小鼠对DF-1毒株的感染率,可以作为预防PCV2的候选疫苗。
杜江[5]（2017）在《啮齿目动物沙粒病毒科、黄病毒科等7科病毒组及进化研究》文中研究表明全球关于新发突发传染病疫情的报道层出不穷。重大传染病疫情的发生不仅严重威胁人类健康,并会引发人群恐慌、区域性限制等,给社会稳定和经济发展带来巨大冲击。因此,有效防控新发突发传染病已成为人类社会亟待解决的的重要问题之一。全球超过60%的新发传染病是动物源性的,而且所占比例还在逐年增加。啮齿目动物是全球地理位置分布最广、种类最多的哺乳动物种群,它们的生活区域与人类社区和饲养动物有广泛的重叠和紧密的联系。病毒组对人和其它哺乳动物的健康有重要的影响,它是感染人和动物致病的病毒的来源。作为自然界众多病毒最主要的自然宿主,啮齿类动物扮演了人类和其它野生动物联系的纽带,将人类暴露给自然生态系统中可致病的病毒。近年来,国内外的研究人员已经在啮齿目动物体内鉴定出三十余种能感染人致病的病毒,如汉坦病毒、沙粒病毒等,所以了解啮齿目动物病毒组对新发传染病的预警溯源体系具有十分重要的意义。目前,全球范围内啮齿目动物携带病毒组的研究仍处于起步阶段,而我国更缺少针对啮齿目动物携带病毒组的大规模系统性研究。基于此,作为啮齿目动物病毒组学研究的一部分,本博士课题通过宏基因组学的方法,对我国境内代表性啮齿目动物所携带的沙粒病毒科、黄病毒科、戊型肝炎病毒科、小RNA病毒科、星状病毒科、圆环病毒科和细小病毒亚科共7科病毒的病毒组学进行了研究,分析其宿主种类、宿主体内病毒峰度和地域分布,并尝试鉴定新的病毒属或种。此外,这几个病毒科中都包含有能够感染人和哺乳动物的病毒,本课题组从病毒基因组遗传进化的角度对这几科病毒以及与啮齿目动物的联系进行了分析,探索是否存在有潜在的可能感染人类或饲养动物的病毒。在中国疾病预防控制中心的协助下,在我国国家医学媒介生物监测网点的20个地域及气候代表性省份,共采集了啮齿目6个科51种动物,鼩形目鼩鼱科和兔形目鼠兔科4种动物,共计6010份咽拭子和肛拭子样品,并通过外表形态和细胞色素b测序鉴定了哺乳动物的种类。本课题组创新性地根据物种特征、采集地等信息对样品进行混合并制备测序样品,极大地减少了样品制备的工作量。建立文库时采用“过滤-富集-核酸酶消化-病毒核酸提取”策略,并通过加入锚定序列提高了 cDNA文库质量。利用课题组所建立的适合病原体筛查的Hiseq文库建立技术、测序参数以及一系列创新性的面向病原检测的宏基因组学数据分析和质控方法（AS4PS、QC4PS）,排除重复序列、adapter、低质量及长度<50bp的序列,最终得到了 65.6GB的数据,近7亿条100bp有效读长信息（reads）。通过排除宿主信息、细菌、真菌等序列信息,依次比对病毒库-NR库-病毒库,提取获得12,073,729（占全部数据量的1.7%）条病毒reads,分为70个科的病毒。进一步排除掉非哺乳动物病毒,得到了 7,148,634条23个哺乳动物病毒科的病毒序列信息。按地域、物种和病毒科分别提取,最后得到7科病毒序列共计3,298,152条有效reads。分析结果发现,啮齿目动物沙粒病毒分布在10个省的16个种（小型哺乳动物）,黄病毒分布在8个省的12个种,戊型肝炎病毒分布在16个省的36个种,小RNA病毒分布在20省的23个种,星状病毒分布在17省的51个种,圆环病毒分布在20省的55个种,细小病毒亚科分布在20省的52个种。根据病毒组结果的提示,设计了巢式引物,对每个原始样品中上述7科病毒进行了进一步的实验验证,并根据序列相似性选择代表性序列进行全基因组序列的扩增。鉴于绝大多数新病毒株的高通量测序仅获得部分基因组序列,仍有大量未知区域,我们采用了多种分子生物学技术,如对没有polyA尾的RNA病毒进行加尾,以及染色体步移技术、5’RACE系统扩增病毒5’末端、3’RACE系统扩增病毒3’末端,获取病毒全基因组序列。目前已完成7个病毒科28个病毒属65株病毒全基因组序列、73株病毒基因组序列,其中建议新的病毒属7个、新的病毒种55个。本研究在云南、湖南和浙江的家鼠属中发现新的啮齿目动物沙粒病毒,与在东南亚地区引起人发热的Wenzhou病毒亚型具有87%-97%的氨基酸相似性,可能具有传播给人的风险。我们在国际上首次发现啮齿目动物携带黄病毒科瘟病毒属的病毒,以及跳鼠科的三趾跳鼠携带沙粒病毒;在国内首次发现啮齿目动物携带黄病毒科丙型肝炎病毒属的病毒;在大陆地区首次发现啮齿目动物携带细小病毒亚科博卡病毒属的病毒。该结果扩充了啮齿目和鼩行目动物携带的病毒的宿主种类和地域范围,并发现大量新病毒属和新种,扩展了病毒学的分类。本项目通过宏基因组学、分子生物学研究方法,调查了我国生态环境中啮齿目和鼩行目动物宿主所携带病毒的情况,逐步建立不同物种所携带病毒水平的基线数据库;同时发现和鉴定了新病毒,为我国应对动物源性病毒性传染病提供了本底水平的数据,为啮齿目动物源性传染病的预警和防治提供了有力的科学依据,为应对将来潜在的动物源性新发传染病的病原体检测打下了坚实的基础。
黄灿平[6]（2017）在《蝙蝠宿主中新病毒发现及蝙蝠冠状病毒HKU9受体的探索》文中研究说明传染病的暴发（outbreak）和流行（pandemic）严重威胁着人类的健康和生存。在全球化（globalization）和工业化（industralization）背景下,疾病的传播和流行异常迅速。而新病原出现的速度也似乎超过了过去的任何时期。野生动物在人兽共患病（zoonosis）的发生、传播和流行中发挥重要作用。对野生动物所携带病原进行检测、分离与鉴定以及论证其与疾病的相关性,成为当前传染病研究的一个新的热点。随着技术的发展,现代分子生物学方法在病原的发现和鉴定中发挥越来越重要的作用。以宏基因组学（metagenomics）和新一代测序技术（next-generation seqeuncing, NGS）等为代表的分子生物学方法能够从样本中直接分析DNA或RNA遗传物质,在病原鉴定中非常适用。2002年和2012年分别暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）,促使广大研究者密切关注冠状病毒的生物多样性、基因组学和跨物种传播的可能性,尤其是来源于蝙蝠（第二大哺乳动物群体）的冠状病毒。目前已知蝙蝠携带有多种多样的病原体,因此在新发人畜共患病和跨物种传播疾病的监测中,蝙蝠是优先关注的对象。本研究通过泛冠状病毒RT-PCR筛选（pan-coronaviral screening）和新一代测序技术,从棕果蝠（Rousettus leschenaulti）的直肠拭子样本中鉴定出一种新型蝙蝠冠状病毒,将其命名为果蝠冠状病毒GCCDC1 （Rousettus bat coronavirus GCCDC1,Ro-BatCoV GCCDC1）。Ro-BatCoV GCCDC1 在基因组结构和组成上与果蝠冠状病毒HKU9 （Ro-BatCoV HKU9）类似,但是序列和进化分析表明Ro-BatCoV GCCDC1是一种新型蝙蝠冠状病毒。更为引人注意的是,在病毒基因组的3’末端整合有一个独特的基因——p10基因,这个基因在所有已知的冠状病毒中都找不到同源序列,序列和进化分析表明可能来源于一个古老的蝙蝠正呼肠孤病毒。亚基因组mRNA和细胞水平试验表明Ro-BatCoV GCCDC1的p10基因与正呼肠孤病毒的p10基因一样是一个功能基因。在病毒复制周期中,p10基因可能能够促进病毒在细胞与细胞之间转移。这株病毒的发现是单股正链RNA病毒与双股分节段的RNA病毒之间跨科重组的第一次报道。对该冠状病毒的进一步研究能够深入了解病毒间异源重组的机制。蝙蝠冠状病毒HKU9 （Ro-BatCoV HKU9）是一种重要的Beta冠状病毒,系统进化上与MERS-CoV隶属于同一个属。对蝙蝠进行监测的数据表明BatCoV HKU9在蝙蝠群体中广泛流行,因此有必要对这个病毒跨越种间屏障的潜在可能性进行研究。冠状病毒spike蛋白中的受体结合结构域（Receptor binding domain,RBD）识别宿主受体以介导病毒侵入,因此是决定病毒趋向性和传播能力的关键因子。本研究中,通过一系列生物物理和晶体学方法对BatCoV HKU9假定的Spike蛋白RBD进行了研究。表面等离子体共振结果表明HKU9-RBD既不结合SARS-CoV 的受体血管紧张素转化酶 2 （Angiotensin-Converting Enzyme 2,ACE2）,也不结合MERS-CoV的受体CD26。我们进一步解析了 HKU9-RBD的分子结构,分析显示该分子结构由一个核心和一个外部亚结构域组成。核心亚结构域的折叠形式与其他Beta冠状病毒RBD的相似,而外部亚结构域在结构上具有独特的特点,仅由一个单一的螺旋组成,这一结构解释了 HKU9-RBD不与ACE2和CD26结合的原因。通过比较目前已知的所有Beta冠状病毒RBD结构,我们进一步提出同源的亚结构域插入结合模式,核心亚结构域和外部亚结构域通过这一模式锚定在一起。通过对HKU9-RBD的结构解析及其与其他Beta冠状病毒的RBD比较,对于阐明Beta冠状病毒受体结合特性及进化规律具有重要参考价值,对于评价HKU9病毒的跨种传播潜力具有重要提示作用。
邱丽叶[7]（2016）在《禽腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用》文中研究表明禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAd V）是无囊膜、线性双股DNA病毒,属于腺病毒科、禽腺病毒属成员。该病毒可感染鸡、火鸡及其他禽类。FAd V可致鸡发生包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis,IBH）、心包积水综合征（Hydropericardium syndrome,HPS）和肌胃糜烂（Gizzard erosions,GE）等疾病。禽腺病毒属中包含8个种,分为禽腺病毒AE、鹅腺病毒A、隼腺病毒A、及火鸡腺病毒B。蛋鸡和肉鸡均可感染该病毒,通常35周龄较为易感。该病常与禽类其他病原混合感染,感染鸡只可继发再生障碍性贫血、肝炎及产蛋量下降等。FAd V呈世界性分布,病毒可经粪-口途径水平传播,也可垂直传播,给养禽业造成巨大经济损失。本研究建立FAd V荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法,为FAdV的快速检测提供技术手段,同时也为疫病净化提供技术平台,对促进养禽业健康发展具有重要意义。对Gen Bank发表的FAdV-A、B、C、D和E种参考毒株的Hexon基因序列进行多重比对,选择保守区域设计兼并引物,使检测引物具有FAdV各个种的种间通用性。应用常规PCR方法从FAdV-D基因组中扩增Hexon-1基因片段,大小为191bp,将此片段克隆到p MD18-T载体,制备标准品,以标准品为模板进行real-time PCR的扩增,建立标准曲线。标准品在质粒浓度为1×1010拷贝/μL1×104拷贝/μL检测范围内的错误率为0.0599,扩增效率为1.904,斜率为-3.575,具有良好的线性关系。对标准品1×1010拷贝/μL1×104拷贝/μL浓度范围进行real-time PCR扩增,其中标准品的敏感性为1×103拷贝/μL。并对其分别进行组内重复和组间重复,组内重复变异系数分别为0.22%、0.24%、0.11%、0.27%、0.18%、0.35%和0.37%;组间重复变异系数（CV%）分别为0.50%、0.86%、0.73%、1.32%、1.06%、0.56%和0.78%。因此本研究建立FAd V荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性及稳定性。应用建立的荧光定量PCR检测方法,分别对禽腺病毒FAdV-D种及FAd V-C种的最小检出滴度进行测定,对FAd V-D和FAd V-C种的检测下限均为102TCID50/ml,是常规PCR检测方法的10倍。说明本研究建立的检测FAd V荧光定量PCR的方法具有较好的敏感性。将禽腺病毒FAd V-D毒株以相同剂量和滴度（100EID50）分别以卵黄囊（6.5日龄）、尿囊膜（9日龄）、尿囊腔（9日龄）途径接种SPF鸡胚,采集鸡胚的组织包括脑、心脏、肠、肺脏、胸腺、肝脏、腺胃、肾脏、脾脏、法氏囊以及鸡胚尿囊液和鸡胚尿囊膜。结果表明不同接种途径对FAd V-D在SPF鸡胚中的增殖影响较大,卵黄囊途径接种SPF鸡胚,鸡胚尿囊膜及尿囊液中DNA拷贝数高于其他两种接种途径,其中经卵黄囊、尿囊膜、尿囊腔途径接种SPF鸡胚,鸡胚尿囊膜中DNA拷贝数分别为1.32×108拷贝/mg、2.89×105拷贝/mg及9.07×104拷贝/mg,接胚尿囊液中DNA拷贝数分别为4.99×104拷贝/mg、3.28×104拷贝/mg及1.32×104拷贝/mg。因此,FAdV-D在SPF鸡胚中最适接种途径为卵黄囊接种,病毒在鸡胚尿囊膜和尿囊液中良好增殖,可收获尿囊膜及尿囊液作为病毒储液。病毒在鸡胚肝组织中DNA拷贝数最高,为4.67×108拷贝/mg。此外,用Günes等已报道的real-time PCR检测方法对上述结果进行符合性检验,与本研究建立的real-time PCR方法检测结果相比,病毒在鸡胚组织中的分布和组织中的病毒载量具有良好的一致性。FAd V-D感染1日龄SPF鸡,于攻毒后每4天采集口咽和泄殖腔拭子,使用本研究建立的FAd V real-time PCR检测方法检测感染鸡只排毒情况,持续检测至攻毒后72d。结果表明,感染鸡只于攻毒后4d开始排毒,攻毒后72d仍可从感染鸡只口咽和泄殖腔拭子中检测到病毒,经口咽拭子检出率为7/10（70%）,经泄殖腔拭子检出率为8/10（80%）。应用常规PCR检测方法对上述样品进行平行检测,感染鸡只于攻毒后4d开始排毒,至攻毒后72d,鸡只口咽和泄殖腔拭子均检测不到病毒。在攻毒后第8天,感染FAdV-D组的鸡群中有3只鸡发病严重、濒死,将3只濒死鸡安乐死处理,采集组织样品,real-time PCR检测病毒在感染鸡体组织分布情况。结果表明,感染鸡只各组织脏器中均有病毒存在,说明FAd V为泛嗜性病毒,但主要嗜性组织为肠和肝脏,在直肠中检测到病毒基因组拷贝数最高,在脾脏中病毒基因组拷贝数最低。分别使用本研究建立的real-time PCR和常规PCR方法对收集到的我国10个省份143份疑似FAd V感染鸡的组织病料进行检测。发现real-time PCR方法检测阳性率为63.6%（91/143）,常规PCR方法检测阳性率为40.5%（58/143）,说明本研究建立的FAdV real-time PCR检测方法在临床病料检测上具有良好的敏感性。
周妞[8]（2016）在《猪圆环病毒2型-猪瘟病毒共感染细胞的蛋白质组研究》文中提出随着规模化养殖技术的不断进步和发展、交通运输的快捷等因素,增加了猪群之间的接触机会,也为病原体的流行和传播创造了机会,造成发病猪群呈现两种或多种病原的混合感染的现状。越来越多的研究表明PCV2和CSFV在猪体内能够发生共感染,并且临床的研究表明PCV2能干扰CSFV弱毒疫苗的保护效力,给养猪业带来重大的经济损失。然而,PCV2-CSFV共感染时相互作用和对宿主的影响机制还未知。在本研究中,为获得效价较高的CSFV C株的多克隆抗体,利用PEG6000浓缩法和蔗糖密度梯度离心纯化法,制备纯化的CSFV样品。结果表明,经浓缩纯化的CSFV仍具有较高的感染活性,且毒价为病毒原液的101.5倍以上。将纯化的CSFV作为抗原接种新西兰大白兔,获得特异性和效价均较高的抗CSFV兔多抗血清。为了有效地研究PCV2和CSFV共感染过程中病毒的交互影响以及细胞参与病毒复制的潜在机制,建立了一个的体外共感染模型。在该模型下PCV2不受CSFV复制影响,CSFV对PCV2没有免疫排斥现象;而CSFV的增殖却以PCV2剂量依赖性的方式降低。PCV2和CSFV能定位于同一个细胞,且CSFV的E2从正常的细胞质定位,易位到细胞核中。此外,相同剂量的PCV2感染PK15和PK15-CSFV,PCV2的感染率相同,并且介导的细胞凋亡程度无显着性差异;然而,PCV2剂量与细胞凋亡呈现正相关,表明PCV2介导的凋亡可能与CSFV复制下调有关。另外,灭活PCV2及PCV2病毒成分孵育细胞不能介导细胞凋亡或影响CSFV复制,表明PCV2复制介导的凋亡影响CSFV复制。这些结果足以解释临床上PCV2和CSFV共同感染导致更严重的临床症状,以及CSFV弱毒疫苗免疫失败问题。为了探究在PCV2和CSFV共感染过程中涉及的宿主因子和分子机制,使用iTRAQ标记结合LC-MS/MS质谱鉴定技术,分析阴性（NE）、PCV2单独感染（SP）、CSFV单独感染（SC）和PCV2-CSFV共感染（PC）的PK15样品的整体蛋白质组表达情况。在3次重复实验中,共有3932个蛋白均检测到。以表达比例≥ 1.2或≤0.83且p 5 0.05作为上下调的阈值,与NE相比,SP中上、下调蛋白数分别为304个和198个,SC中分别为60个和61个,PC中分别为196个和156个。相对定量PCR、蛋白免疫印迹和共聚焦激光扫描显微镜技术验证的结果表明,大部分基因/蛋白的表达趋势与iTRAQ蛋白质组结果一致。聚类、GO和KEGG分析证明在PCV2和CSFV共感染过程中PCV2具有主导作用。对PC/SC差异表达蛋白进行IPA分析,结果显示蛋白14-3-3ζ、cullin3、ERK1/2、caspase和NF-κB可能在PCV2影响CSFV在体外完成生命周期的过程中具有重要作用。另外,进一步对共感染条件下特异性差异表达的184个蛋白进行KEGG和IPA分析,结果表明线粒体呼吸链复合物I、IV和V的多个蛋白均下调表达,由此推断线粒体可能是PCV2和CSFV共感染时的主要靶标;除了线粒体功能失常外,共感染还特异性影响了氧化磷酸化、Nrf2介导的氧化应激、tRNA装载、Myc介导的凋亡信号传导和细胞内多种代谢通路的信号通路。这些数据为研究PCV2和CSFV共感染过程对细胞通路的影响及其分子机制提供参考。综上,本研究获得了高效价高纯度的CSFV C株病毒以及抗CSFV的兔多抗,为检测CSFV提供工具;建立了 PCV2和CSFV共感染模型,确定共感染过程中PCV2介导的细胞凋亡是削弱CSFV复制的原因;通过基于iTRAQ的蛋白质组学和生物信息学分析,证明了 PCV2和CSFV共感染过程中PCV2的主导作用,并且确定了共感染过程中重要的蛋白分子及其所涉及的信号通路。然而,这些蛋白和信号通路在共感染过程中的确切功能,还需要进一步研究。
廖勤丰[9]（2014）在《新发现的水禽星状病毒、微RNA病毒和嵌杯病毒的分子检测与鉴定》文中研究表明近20年来,新的水禽疫病不断出现,对我国水禽业构成了巨大威胁。因此,筛查水禽群体中可能存在的新病毒对于水禽新现疾病的防控具有十分重要的意义。2011-2012年间,从我国四个省采集水禽样品155份,包括来自江西的2月龄健康朗德鹅粪便样品19份和健康麻鸭粪便样品18份、来自广东和湖北的活禽市场采集的北京鸭粪便样品90份以及从山东采集的出壳前死亡北京鸭胚的肠道样品28份。利用星状病毒ORF1b通用引物进行RT-PCR检测,检出阳性样品20份（12.9%）。对扩增产物的序列进行比较分析的结果显示,20株星状病毒分属两类（A和B）,彼此间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为55%-58%和57-59%,它们与已知禽星状病毒的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为52%-72%和35-79%。进化分析进-步证实,这些毒株均不同于已知的禽星状病毒,属于两类新的星状病毒。A类星状病毒共7株,均来白广东的北京鸭；B类星状病毒包括来自广东的北京鸭源毒株1株、从山东的北京鸭胚中检出的毒株3株、来自江西的麻鸭源毒株2株和朗德鹅源毒株7株。这些结果表明,星状病毒感染的地区分布已很广泛,且至少有三种水禽可感染星状病毒。研究结果还表明,两类星状病毒感染水禽后均可经粪便排毒,其中B类星状病毒具有较广泛的宿主范围。在部分ORF1b区,B类毒株与本室最近检出的鸭星状病毒（duck astrovirus, DAstV） CPH株具有相近的遗传进化关系,其核苷酸与氨基酸序列同源性分别达95%-96%和97-99%,表明它们属于同一个类型,因此,从A类中选DAstV/YP2株,用随机扩增、RT-PCR、5’RACE和3’RACE技术测定了其基因组序列。序列分析表明,不计poly（A）尾,DAstV/YP2基因组长度为7287nt,由12nt的5’UTR、3363nt的ORFla、1545nt的ORF1b、2184nt的ORF2和177nt的5’UTR组成。结果表明,DAstV/YP2具有典型的星状病毒基因组结构。用三个蛋白的全长氨基酸序列进行同源性分析和进化分析的结果表明,DAstV/YP2与已知的禽星状病毒具有较远的遗传进化关系。在衣壳蛋白区,DAstV/YP2与已知的禽星状病毒之间的遗传距离为0.599-0.801,据此可将DAstV/YP2鉴定为星状病毒科禽星状病毒属的一个新病毒种。采用不依赖序列的随机扩增法,并经测序和序列相似性检索,从一份来自广东的北京鸭粪便样品检测到一种新的微RNA病毒（LY株）。随后,采用RT-PCR、5’RACE和3’RACE技术测定了该病毒的基因组序列。序列同源性和进化分析结果表明,该病毒LY与微RNA病毒科Megrivirus属成员间的遗传进化关系最近,在P1、P2、P3、polyprotein和2C+3CD区,该病毒与Megrivirus成员间的氨基酸序列同源性分别为32-68%、35-45%、51-57%、41-50%和61-63%,据此将该病毒鉴定为Megrivirus属内的一个新成员,暂称之为Duck megrivirus （DMV）。序列分析表明,DMV具有类似于MeV-A的基因组结构,但亦有自身的特点。不计poly（A）尾,DMVLY株基因组长度为9700nt,是微RNA病毒科中最长的。最显着的特点位于2A区,该区由两个功能未知的蛋白（2A1和2A2）以及一个parachovirus样的2A3组成。DMV的5’UTR所含内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）属于IVB IRES的变异型,即其Ⅲ域含有一个很长的Ⅲ4螺旋,且Ⅲ域的顶端是一个20-nt长的“8”样保守结构。比较分析显示,所预测的DMV IRES Ⅲ域的二级结构亦见于Me V-A、Mesivirus、鹌鹑微RNA病毒和鸽子微RNA病毒B。以往在IVA和IVC型IRES的、域所见到的保守的内部和顶环在DMV IRES的Ⅱ域高度保守。另外,在不同的基因区,DMV分别与Megrivirus属的两个成员具有相近的遗传进化关系。这些结果表明,在进化过程中,DMV的编码区和非编码区可能发生过基因重组。为了解DMV感染的流行情况,检测了2011-2012年间从山东、广东、湖北和海南采集的另外117份北京鸭样品,从4个地区的样品中均检测到DMV,阳性率为23.9%,结果表明,我国鸭群中DMV的感染率较高,且地区分布较广。采用上述方法,从一份来自江西的朗德鹅粪便样品检测到一种嵌杯病毒。随后,采用RT-PCR.5’RACE和3’RACE技术测定了该病毒的基因组序列。序列分析表明,鹅嵌杯病毒（Goose calicivirus,GoCV）基因组全长8103nt,编码2个ORF,即ORF1和ORF2,这两个ORF位于同一个读框,间隔3nt,这一特性与火鸡嵌杯病毒（Tukey caliivirus, TuCV）类似。长度为6960-nt的ORF1编码一个大的聚蛋白,预测该聚蛋白裂解为非结构蛋白Nterm、NTPase、3A、VPg和Pro-pol以及主要结构蛋白VP1；长度为825-nt的ORF2编码次要结构蛋白VP2。结果表明,GoCV拥有类似于TuCV的基因组结构。与其他嵌杯病毒的比较结果表明,在非结构蛋白、VP1和VP2区,GoCV与TuCV的氨基酸序列同源性最高,分别为62%、38%和52%。进化分析表明,GoCV与TuCV具有相近的遗传进化关系,但亦存在明显的区别,因此,将GoCV鉴定为嵌杯病毒科"Nacovirus"属内的一种新病毒。
杭柏林[10]（2014）在《J亚群禽白血病病毒JS09GY3株感染特性及感染鸡法氏囊转录组学分析》文中研究指明禽白血病（Avian leukosis）是由反转录病毒科中禽白血病／肉瘤病毒（Avian leukosis sarcoma virus, ALSV）引起的禽类良性和恶性肿瘤性传染性疾病。禽白血病在临床上有多种类型,如淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、髓细胞性白血病、血管瘤、肾瘤、肉瘤和骨石化症等,同时导致鸡只体重增长下降、鸡群产蛋性能降低、免疫抑制。鸡的ALV分为6个亚群,即A、B、C、D、E、J,其中E亚群为内源性ALV,其余亚群为外源性ALV。J亚群ALV（ALV-J）于1988年首次在英国被鉴定,然后迅速传播到世界其它国家,给世界养禽业造成了严重的经济损失。在中国大陆,1999年首次从肉鸡中分离到ALV-J。目前,ALV-J感染在中国鸡群中流行很普遍,肿瘤类型多样,并向中国地方品系鸡群扩散。研究中国ALV-J分离株的感染特性有助于理解ALV-J的致病机制。本研究以ALV-JJS09GY3毒株为研究对象,观察了其感染SPF白来航鸡后抗原抗体的变化、临床症状和组织病理学变化以及肿瘤类型的变化等感染特性,并应用基因芯片分析了感染鸡法氏囊中的差异表达基因,为理解ALV-J的致病机制提供了新的观点。1.不同日龄鸡感染ALV-J的抗原和抗体变化规律为了解鸡感染ALV-J后抗原和血清中抗体的变化规律,本研究经卵黄囊途径或肌肉途径,将ALV-J JS09GY3株分别感染6胚龄SPF鸡胚、31日龄和56日龄SPF鸡,于感染后不同时间采集胎粪或泄殖腔棉拭子,同时采集血液、分离血清,以检测p27抗原、ALV-J特异性抗体（J型抗体）和p27抗体。结果显示,胚胎组在各检测点均可检测到p27抗原（仅1只鸡在1日龄时为阴性）,而31日龄组和56日龄组检测不到p27抗原；胚胎组没有检测到p27抗体,31日龄组中80%（4/5）的鸡在3次重复感染后可检测到p27抗体,56日龄组在首次感染后p27抗体的检出率较高（60%）；各组的J型抗体在各检测点上基本为阴性。结果表明,胚胎期感染ALV-J的鸡在出壳后形成免疫耐受,可通过泄殖腔排毒,但其不产生抗体；而高日龄鸡感染ALV-J后不通过泄殖腔排毒,大多数鸡产生p27抗体,但基本不产生J型抗体。2.不同方法检测J亚群禽白血病的效果比较与分析禽白血病是危害家禽养殖业的一种重要的病毒性肿瘤性传染病。快速准确诊断病毒感染对禽白血病的净化具有重要意义。本研究通过病毒分离方法、PCR方法和组织病理学方法对经卵黄囊途径感染ALV-J JS09GY3株后孵出的鸡在不同时间点进行了J亚群禽白血病的检测分析。结果显示,20份样品中,病毒分离-ELISA阳性率为65%,而病毒分离-IFA阳性率为75%,PCR的阳性率为95%,有2只鸡在肝脏上有大体病变,在肝脏、肾脏、心脏和肺脏上出现组织细胞学的变化,而脾脏上没有观察到组织细胞学的变化。研究表明,不同方法检测J亚群禽白血病的结果存在差异,PCR检测的阳性率最高,其在J亚群禽白血病的早期感染检测具有重要意义。3. ALV-J JS09GY3株对SPF鸡的感染特性研究为了解ALV-J JS09GY3株对SPF鸡的感染特性,本研究将ALV-JJS09GY3株通过卵黄囊途径感染6胚龄鸡胚,孵化后将鸡饲养至20周龄,观察临床症状和病理变化,并采集泄殖腔棉拭子以检测p27抗原,采集血液分离血清以检测p27抗体和J型抗体,采集抗凝血分离病毒。结果显示,ALV-J JS09GY3株可以引起感染鸡的死亡；对鸡的体重增长有一定的抑制作用,在8和12周龄时呈显着抑制（p<0.05）；肿瘤总体发生率为72.22%,在4周龄时可以观察到肿瘤样变化,随着日龄增加,机体许多组织器官出现肿瘤；其中血管瘤发生率达58.33%；经组织切片观察,除了经典的血管瘤现象外,还发现了卵巢腺癌和肌肉纤维瘤等：在20周试验期内,可以检测到泄殖腔中的p27抗原,从血液中分离到ALV-J,但不能检测到J型抗体,而p27抗体仅在16和20周龄的部分鸡只中检出。结果提示,JS09GY3株ALV-J的感染性较强,可以用作为建立ALV-J感染生物模型用的生物材料。4. ALV-J感染SPF鸡法氏囊转录组学分析ALV-J感染鸡只后,可导致肿瘤、免疫抑制和提高对其它病原的易感性,进而导致鸡群的高发病率和高死亡率。然而,鸡感染ALV后的机能反应状况还不清楚。本研究通过基因芯片技术探讨了ALV-J JS09GY3株感染SPF鸡后,其法氏囊产生的一系列反应。结果显示,感染鸡法氏囊组织中出现594个差异表达的转录子（差异倍数≥2,p<0.05）,这些差异表达基因涉及细胞过程、结合、生物学调节、代谢加工、刺激反应和免疫系统等反应。通过信号通路分析发现,差异表达基因主要参与了细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、RIG-I-like受体信号通路等。这些差异表达基因主要集中在chrl、chrUnrandom、chr2、chr4、chr7等染色体中。对这些差异表达基因编码蛋白的相互作用进行String预测分析表明,许多差异表达基因编码的蛋白之间存在着相互作用。本研究获得的ALV-J JS09GY3株感染鸡法氏囊反应谱为更好的理解ALV-J感染的分子机制提供了理论基础。
二、禽类圆环病毒病——PMWS研究的先导（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、禽类圆环病毒病——PMWS研究的先导（论文提纲范文）
（1）表达NDV蛋白的重组酵母构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 新城疫病毒的发现 |
| 1.1.2 新城疫病毒的理化性质与基因组结构 |
| 1.1.3 新城疫病毒的类型 |
| 1.1.4 新城疫病毒的致病性与感染后临床症状 |
| 1.2 新城疫病毒检测技术 |
| 1.2.1 血清学检测 |
| 1.2.2 分子生物学技术检测 |
| 1.3 新城疫病毒疫苗主要类型 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 载体疫苗 |
| 1.3.3 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.3.4 纳米粒子递送疫苗 |
| 1.3.5 生物佐剂疫苗 |
| 1.4 酿酒酵母表达系统 |
| 1.4.1 酿酒酵母表面展示表达系统 |
| 1.4.2 酿酒酵母表达系统的特点及应用 |
| 1.5 本课题研究的目的与意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 目的和意义 |
| 第2章 新城疫病毒F与HN基因酿酒酵母表达载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验用毒株、质粒及引物 |
| 2.2.2 实验用主要试剂 |
| 2.2.3 培养基的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 新城疫病毒F和HN蛋白片段的生物信息学分析 |
| 2.3.2 新城疫病毒RNA的提取 |
| 2.3.3 反转录 |
| 2.3.4 目的基因的扩增与克隆 |
| 2.3.5 目的片段纯化回收 |
| 2.3.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 |
| 2.3.7 PCR回收产物的酶切及与载体的连接 |
| 2.3.8 连接产物的转化与鉴定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 新城疫病毒F和HN蛋白片段的生物信息学分析 |
| 2.4.2 新城疫病毒F与HN基因的克隆 |
| 2.4.3 重组质粒验证 |
| 2.5 分析与讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 新城疫病毒F与HN蛋白片段在酿酒酵母表面的表达及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验用酵母质粒、引物和菌株 |
| 3.2.2 实验用主要试剂 |
| 3.2.3 主要溶液和培养基配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 PCR反应体系 |
| 3.3.2 酶切构建转化体系 |
| 3.3.3 酵母转化 |
| 3.3.4 酵母基因组提取 |
| 3.3.5 Western blot鉴定 |
| 3.3.6 F与HN蛋白片段酿酒酵母表面展示菌株生长曲线 |
| 3.3.7 免疫荧光 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 酵母转化构建NDV F和 HN蛋白片段表面展示菌株 |
| 3.4.2 重组菌株验证 |
| 3.4.3 新城疫病毒F与HN蛋白酿酒酵母表面展示菌株的生长曲线 |
| 3.4.4 新城疫病毒F与HN蛋白的表达鉴定 |
| 3.4.5 蛋白表达免疫荧光结果 |
| 3.5 分析与讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 新城疫病毒F/HN酿酒酵母表面展示疫苗免疫效果评估 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验用主要试剂 |
| 4.2.2 主要溶液和培养基配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 原核表达载体构建 |
| 4.3.2 蛋白纯化 |
| 4.3.3 酶联免疫吸附测定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 新城疫病毒HN蛋白原核表达载体构建 |
| 4.4.2 新城疫病毒HN原核蛋白的纯化 |
| 4.4.3 新城疫病毒血清抗体的ELISA检测 |
| 4.5 分析与讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（2）猪圆环病毒2型Cap蛋白亲和肽配基的理性设计、鉴定及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪圆环病毒的发现与分类 |
| 1.1 猪圆环病毒2 型 |
| 1.2 猪圆环病毒2 型的病原特征 |
| 1.3 猪圆环病毒2 型基因组及编码蛋白功能 |
| 1.4 猪圆环病毒2 型流行病学 |
| 1.5 猪圆环病毒2 型粒子结构 |
| 1.6 猪圆环病毒2 型疫苗 |
| 2 亲和肽配基 |
| 3 亲和肽配基的理性设计和筛选 |
| 3.1 噬菌体展示技术 |
| 3.2 组合化学技术 |
| 3.3 mRNA展示技术 |
| 3.4 计算机虚拟筛选技术 |
| 4 疫苗载体 |
| 4.1 金纳米颗粒 |
| 4.2 脂质体 |
| 4.3 聚合物纳米颗粒 |
| 第二章 猪圆环病毒2 型Cap蛋白亲和肽配基的理性设计 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 分子模拟软件及设备 |
| 1.2 虚拟肽库的构建 |
| 1.3 PCV2 Cap蛋白晶体结构的准备 |
| 1.4 对接活性口袋 |
| 1.5 分子对接 |
| 1.6 分子表面分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCV2 Cap蛋白的氨基酸序列分析 |
| 2.2 活性口袋设定 |
| 2.3 对接结果评价 |
| 2.4 多肽与PCV2 Cap之间的亲和力分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 猪圆环病毒2 型Cap蛋白亲和肽配基的筛选与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验仪器与设备 |
| 1.2 实验试剂及配制 |
| 1.3 构建pET-28a-PCV2 Cap表达载体 |
| 1.4 多肽与PCV2 Cap蛋白的亲和性和特异性检测 |
| 1.5 LSPR测定候选肽的K_D值 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 p ET-28a-PCV2 Cap表达载体的成功构建 |
| 2.2 PCV2 Cap蛋白的成功表达和纯化 |
| 2.3 PCV2 Cap蛋白免疫活性的测定 |
| 2.4 ELISA定性初筛多肽与PCV2 Cap蛋白的亲和力 |
| 2.5 候选肽的特异性鉴定 |
| 2.6 LSPR定量检测候选肽亲和力常数K_D值 |
| 3 讨论 |
| 第四章 亲和肽配基吸附剂的制备及纯化条件优化 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验仪器与设备 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 候选肽纯化PCV2 Cap蛋白能力的初步鉴定 |
| 1.5 亲和吸附剂的制备及纯化条件优化 |
| 1.6 洗脱条件的摸索 |
| 1.7 洗脱产物的活性鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 候选肽初步纯化PCV2 Cap蛋白的效果 |
| 2.2 L11 肽配基载量和偶联效率的测定 |
| 2.3 pH影响 |
| 2.4 盐离子浓度影响 |
| 2.5 配基密度影响 |
| 2.6 洗脱条件的摸索 |
| 2.7 洗脱产物的活性鉴定 |
| 2.8 小鼠免疫血清鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 构建纯化自组装的PLGA-PCV2 Cap纳米颗粒 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验仪器和设备 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 L11 亲和肽与PCV2 Cap蛋白结合位点的鉴定 |
| 1.4 PLGA-PCV2 Cap纳米颗粒的制备与表征 |
| 1.5 细胞毒性 |
| 1.6 细胞摄取 |
| 1.7 小鼠免疫血清鉴定 |
| 1.8 中和抗体的检测 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 L11 亲和肽与PCV2 Cap蛋白结合位点的鉴定 |
| 2.2 PLGA-PCV2 Cap纳米粒的表征 |
| 2.3 PLGA对 APCs的细胞毒性和摄取 |
| 2.4 抗体水平的检测 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）我国猪肉供应风险及对策研究（论文提纲范文）
| 1 猪肉供应风险DIIS研究框架 |
| 2 我国猪肉供应风险分析 |
| 2.1 猪肉产量与价格波动 |
| 2.2 生猪产业困境 |
| 3 猪肉供需平衡维护方式分析 |
| 3.1 改变生产模式，扩大养殖规模 |
| 3.2 实行生猪畜牧指标配给政策 |
| 3.3 保障干鲜瓜果类、水产类、肉蛋类营养型食品的供给 |
| 4 疫病环境下国内外肉类供应管理经验 |
| 4.1 我国应对高致病性禽流感疫情的经验 |
| 4.2 美国应对古典猪瘟疫情的经验 |
| 5 结语 |
（4）截短钙网蛋白融合FMDV VP1及PCV2 Cap蛋白表达形成多聚体的免疫原性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 FMDV的研究进展 |
| 1.1 FMD简介 |
| 1.2 FMDV的病原学 |
| 1.3 FMD的防控 |
| 第2章 PCV2的研究进展 |
| 2.1 PCV2简介 |
| 2.2 PCV2病原学 |
| 2.3 PCV2 的防控 |
| 第3章 CRT的研究进展 |
| 3.1 CRT简介 |
| 3.2 截短CRT的功能研究 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 FMDV VP1-CRT融合蛋白制备和反应原性分析 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 重组VP1-CRT融合蛋白对小鼠及豚鼠的免疫效果评价 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 VP1-CRT融合蛋白(rC4V)抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.1 试剂及血清 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 PCV2 Cap-CRT融合蛋白的制备和免疫原性分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）啮齿目动物沙粒病毒科、黄病毒科等7科病毒组及进化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 英文缩略词表 第一章 前言 |
| 一、啮齿动物源性病毒与传染病 |
| 二、沙粒病毒科、戊型肝炎病毒科等7科病毒 |
| 2.1. 沙粒病毒科 |
| 2.2. 小RNA病毒科 |
| 2.3. 黄病毒科 |
| 2.4. 戊型肝炎病毒科 |
| 2.5. 星状病毒科 |
| 2.6. 细小病毒亚科 |
| 2.7. 圆环病毒科 |
| 三、病毒组 |
| 四、新一代测序技术与动物源性病毒 |
| 五、本研究的立题依据 |
| 六、实验设计 |
| 6.1. 采样 |
| 6.2. 技术路线 第二章 材料和方法 |
| 一、实验材料仪器 |
| 1.1. 实验所需载体 |
| 1.2. 主要试剂耗材 |
| 1.3. 主要实验仪器 |
| 1.4. 溶液配置 |
| 二、实验方法 |
| 2.1. 样品及建立核酸文库 |
| 2.2. Hiseq文库构建及Hiseq测序准备实验 |
| 2.3. 生物信息学分析 |
| 2.4. 病毒鉴定及保守区域扩增 |
| 2.5. 病毒全基因组扩增 |
| 2.6. 系统进化分析 第三章 实验结果 |
| 一、啮齿目和鼩形目宏基因组分析 |
| 1.1. 样品采集 |
| 1.2. 样品合并富集及cDNA文库建立 |
| 1.3. 宏基因组测序结果 |
| 1.4. 生物信息分析结果 |
| 1.5. 啮齿动物携带沙粒病毒科、黄病毒科等病毒组分析 |
| 二、新型啮齿目和鼩形目动物病毒筛查鉴定 |
| 2.1. 病毒鉴定及全基因组扩增 |
| 2.2. 主要的RNA病毒 |
| 2.3. 主要的DNA病毒 第四章 讨论 |
| 一、啮齿目动物病毒组 |
| 二、啮齿目动物病毒 |
| 2.1. 沙粒病毒 |
| 2.2. 黄病毒 |
| 2.3. 小RNA病毒 |
| 2.4. 戊型肝炎病毒、星状病毒、圆环病毒、细小病毒 |
| 三、结论 创新点 致谢 博士期间发表论文 参考文献 附录 |
（6）蝙蝠宿主中新病毒发现及蝙蝠冠状病毒HKU9受体的探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 研究内容 |
| 第一章 果蝠冠状病毒GCCDC1鉴定及其特征性p10基因的起源和功能研究 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 蝙蝠样本检测 |
| 1.2.2 细胞培养与病毒分离 |
| 1.2.3 病毒命名及全基因组测序 |
| 1.2.4 病毒全基因组分析 |
| 1.2.5 进化分析 |
| 1.2.6 呼肠孤病毒p10基因重组到Ro-BatCoV GCCDC1基因组中的证据 |
| 1.2.7 Ro-BatCoV GCCDC1亚基因组结构 |
| 1.2.8 p10基因是一个功能基因 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 蝙蝠冠状病毒HKU9 spike蛋白推测的受体结合结构域:Beta冠状病毒受体结合基序的进化 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HKU9-RBD的表达与纯化 |
| 2.2.2 HKU9 Spike蛋白结构特征及HKU9-RBD序列特点 |
| 2.2.3 HKU9-RBD与SARS-CoV及MERS-CoV受体的结合情况 |
| 2.2.4 HKU9-RBD晶体生长条件 |
| 2.2.5 重原子结合试验 |
| 2.2.6 HKU9-RBD晶体结构 |
| 2.2.7 Beta冠状病毒中RBD核心亚结构域的结构保守性 |
| 2.2.8 同源相互作用模式将外部亚结构域锚定在核心亚结构域上 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 云南省墨江哈尼族自治县废弃矿洞中不明原因重症肺炎事件病原学初步调查 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试剂和材料 |
| 3.1.2 样本采集 |
| 3.1.3 样本处理 |
| 3.1.4 核酸提取 |
| 3.1.5 引物设计 |
| 3.1.6 样本检测 |
| 3.1.7 序列同源与进化分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 样本检测 |
| 3.2.2 序列同源与进化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第二部分 文献综述 |
| 第四章 新发动物源性病原及其对人类的致病性 |
| 第一节 新发传染病概念及分类 |
| 第二节 近30年来出现的新发传染病 |
| 第三节 新发传染病频发的生态和环境因素 |
| 第四节 野生动物在新发传染病跨物种传播中的作用 |
| 第五章 蝙蝠与新发传染病 |
| 第一节 流感和冠状病毒的跨物种传播 |
| 第二节 蝙蝠的生物学和生态学特性 |
| 第三节 蝙蝠体内携带的重要病原 |
| 第四节 蝙蝠在疾病根除计划中的作用 |
| 第六章 新病毒发现技术 |
| 第一节 病毒发现的传统方法和技术 |
| 第二节 新病毒发现的分子生物学技术 |
| 简并引物PCR检测技术 |
| 差减杂交技术 |
| DNA酶处理-序列非依赖性单引物扩增技术(DNase-SISPA) |
| 以cDNA扩增片段长度多态性为基础的病毒发现(VIDISCA) |
| 第三节 宏基因组学和新一代测序技术 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文章发表 |
| 致谢 |
（7）禽腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 禽腺病毒概述 |
| 1.2 禽腺病毒分类 |
| 1.3 禽腺病毒的生物学特点 |
| 1.3.1 禽腺病毒的形态结构和理化特性 |
| 1.3.2 禽腺病毒的基因组结构 |
| 1.3.3 禽腺病毒主要蛋白及功能 |
| 1.3.4 禽腺病毒病毒复制 |
| 1.4 禽腺病毒检测方法 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.2 病毒分离鉴定 |
| 1.4.3 分子生物学技术 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 鸡胚、载体与菌种 |
| 2.2 酶类与主要生化试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 FAd V基因组DNA的提取 |
| 2.5 标准品的制备 |
| 2.5.1 引物 |
| 2.5.2 目的基因片段PCR扩增 |
| 2.5.3 目的片段胶回收 |
| 2.5.4 p MD18-T载体与胶回收产物连接 |
| 2.5.5 连接产物的转化 |
| 2.5.6 重组质粒PCR鉴定及测序鉴定 |
| 2.5.7 重组质粒的大量制备 |
| 2.5.8 标准品浓度计算 |
| 2.6 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.6.1 荧光定量PCR反应体系的优化 |
| 2.6.2 荧光定量PCR反应程序的优化 |
| 2.6.3 标准曲线的构建 |
| 2.7 FAd V荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.7.1 荧光定量PCR反应条件的建立 |
| 2.7.2 荧光定量PCR结果判定 |
| 2.8 特异性试验 |
| 2.9 敏感性试验 |
| 2.9.1 病毒TCID50测定 |
| 2.9.2 荧光定量PCR检测方法敏感性试验 |
| 2.10 重复性和稳定性试验 |
| 2.11 两种荧光定量PCR检测方法的比较 |
| 2.12 FAdV荧光定量PCR检测方法的初步应用 |
| 2.12.1 动物实验分组 |
| 2.12.2 荧光定量PCR方法检测感染鸡的排毒 |
| 2.12.3 FAd V在鸡体内的组织分布 |
| 2.12.4 应用荧光定量PCR检测临床病料 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 FAd V Hexon-1 和 52K基因片段PCR扩增 |
| 3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.3 标准品的制备及拷贝数测定 |
| 3.4 FAd V荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.4.1 荧光定量PCR反应最佳条件 |
| 3.4.2 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.5 特异性试验 |
| 3.6 敏感性试验 |
| 3.6.1 FAd V-C，FAd V-D TCID50测定 |
| 3.6.2 荧光定量PCR检测方法敏感性 |
| 3.7 重复性和稳定性试验 |
| 3.8 两种FAd V荧光定量PCR检测方法的比较 |
| 3.8.1 本研究建立荧光定量PCR检测方法 |
| 3.8.2 其他荧光定量PCR检测方法 |
| 3.8.3 两种不同的荧光定量PCR检测方法的比较 |
| 3.9 FAd V荧光定量PCR检测方法初步应用 |
| 3.9.1 荧光定量PCR方法检测感染鸡只排毒 |
| 3.9.2 FAdV在鸡体内的组织分布 |
| 3.9.3 FAd V荧光定量PCR方法检测临床病料 |
| 4 讨论 |
| 4.1 禽腺病毒感染现状 |
| 4.2 禽腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 4.2.1 禽腺病毒荧光定量PCR检测方法的通用性 |
| 4.2.2 禽腺病毒荧光定量PCR检测方法的优化 |
| 4.3 禽腺病毒的分离 |
| 4.4 鸡感染禽腺病毒带毒及排毒情况 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）猪圆环病毒2型-猪瘟病毒共感染细胞的蛋白质组研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 论文创新点 研究意义 技术路线 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒2型研究进展 |
| 1 PCV的发现与分类学地位 |
| 2 PCV的生物学特性 |
| 3 PCV2的基因组结构与编码蛋白 |
| 3.1 PCV2的基因组结构 |
| 3.2 ORF1基因与Rep、Rep'蛋白 |
| 3.3 ORF2基因与Cap蛋白 |
| 3.4 ORF3基因与ORF3蛋白 |
| 3.5 ORF4基因与ORF4蛋白 |
| 3.6 ORF5基因与ORF5蛋白 |
| 4 PCV2生命周期 |
| 4.1 PCV2感染宿主 |
| 4.2 PCV2的吸附与入侵 |
| 4.3 PCV2的运输 |
| 4.4 PCV2 DNA复制和转录 |
| 第二章 猪瘟病毒研究进展 |
| 1 CSFV的发现与分类学地位 |
| 2 CSFV的生物学特性 |
| 3 CSFV基因组结构与编码蛋白 |
| 3.1 CSFV基因组结构 |
| 3.2 CSFV的结构蛋白和非结构蛋白 |
| 4 CSFV的生命周期 |
| 4.1 CSFV感染宿主 |
| 4.2 CSFV的吸附与入侵 |
| 4.3 CSFV基因组复制 |
| 4.4 CSFV蛋白翻译 |
| 4.5 病毒粒子组装和释放 |
| 5 CSFV毒力因子 |
| 第三章 猪重要病毒共感染的研究进展 |
| 1 猪病毒共感染现状 |
| 2 猪病毒共感染的机制研究 |
| 第四章 高通量蛋白质组学研究进展 |
| 1 蛋白质组学概述 |
| 2 高通量蛋白质组学研究技术 |
| 2.1 Bottom-up蛋白质组学 |
| 2.2 Top-down蛋白质组学 |
| 2.3 其他新兴的技术 |
| 3 蛋白质组学在生命科学研究中的应用 |
| 3.1 蛋白质组学在细胞生物学的应用 |
| 3.2 蛋白质组学在细胞信号通路的应用 |
| 3.3 蛋白质组学在临床诊断的应用 |
| 3.4 蛋白质组学在病毒感染研究中的应用 第二部分 研究内容 |
| 第一章 猪瘟病毒纯化与多抗制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞与实验动物 |
| 1.2 毒株与菌株 |
| 1.3 试剂与抗体 |
| 1.4 器材与软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 病毒浓缩 |
| 2.2 病毒纯化 |
| 2.3 BCA测定病毒蛋白浓度 |
| 2.4 透射电镜观察 |
| 2.5 CSFV绝对定量PCR的建立 |
| 2.6 CSFV感染细胞 |
| 2.7 间接免疫荧光检测(IFA)检测病毒TCID_(50) |
| 2.8 抗CSFV兔多抗的制备 |
| 2.9 IFA检测血清效价 |
| 2.10 ELISA检测血清 |
| 2.11 数据分析及作图 |
| 3 结果 |
| 3.1 CSFV绝对定量PCR的建立 |
| 3.2 病毒浓缩和纯化 |
| 3.3 抗CSFV兔多抗的IFA效价检测 |
| 3.4 抗CSFV兔多抗的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 第二章 猪圆环病毒2型与猪瘟病毒共感染模型的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 毒株与菌株 |
| 1.3 试剂与抗体 |
| 1.4 器材与软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PCV2感染细胞 |
| 2.2 CSFV感染细胞 |
| 2.3 IFA测定病毒感染情况及子代病毒TCID_(50) |
| 2.4 带毒细胞的建立 |
| 2.5 流式细胞术检测细胞感染率 |
| 2.6 PCV2绝对定量PCR的建立 |
| 2.7 普通激光共聚焦显微镜(CLSM)和超高分辨显微镜(SIM和STORM) |
| 2.8 CCK-8法检测细胞活性 |
| 2.9 相对定量PCR检测CSFV的复制水平 |
| 2.10 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 2.11 化学发光法检测Caspase 3/7活性 |
| 2.12 PCV2灭活方法比较 |
| 2.13 酚氯仿法抽提病毒DNA |
| 2.14 数据分析及作图 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞对病毒的允许性 |
| 3.2 恒定感染CSFV的细胞系的建立 |
| 3.3 共感染情况下PCV2和CSFV的定位情况 |
| 3.4 PCV2和CSFV在PK15和ST中的共感染比例 |
| 3.5 PCV2绝对定量PCR的建立 |
| 3.6 共感染对病毒复制的影响 |
| 3.7 PCV2在PK15-CSFV中介导的凋亡 |
| 3.8 PCV2对PK15-CSFV的影响依赖于PCV2的复制 |
| 4 讨论 |
| 第三章 基于iTRAQ技术的猪圆环病毒2型-猪瘟病毒共感染PK15的蛋白质组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 毒株与菌株 |
| 1.3 试剂与抗体 |
| 1.4 器材与软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 样品制备 |
| 2.2 细胞样品的裂解 |
| 2.3 蛋白样品浓度测定 |
| 2.4 SDS-PAGE电泳 |
| 2.5 考马斯亮蓝染色 |
| 2.6 Western blotting分析 |
| 2.7 酶解和肽段定量 |
| 2.8 肽段标记 |
| 2.9 肽段的SCX分级 |
| 2.10 LC-MS/MS分析 |
| 2.11 质谱数据分析 |
| 2.12 生物信息学分析 |
| 2.13 SYBR green法荧光定量PCR验证差异表达蛋白 |
| 2.14 CLSM观察 |
| 2.15 数据分析及作图 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 样品制备及检测 |
| 3.2 肽段标记及SCX分级 |
| 3.3 质谱鉴定结果 |
| 3.4 蛋白质的差异表达分析 |
| 3.5 差异表达蛋白验证 |
| 3.6 蛋白质组的层次聚类分析 |
| 3.7 差异表达蛋白的GO分析 |
| 3.8 差异表达蛋白的KEGG分析 |
| 3.9 PC/SC差异表达蛋白的IPA分析 |
| 3.10 PCV2-CSFV共感染下特异性差异表达的蛋白 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCV2在PCV2-CSFV共感染过程中的主导地位 |
| 4.2 PCV2-CSFV共感染特异性差异表达蛋白的分析 全文总结 展望 参考文献 第三部分 附录 |
| 附录A iTRAQ结合LC-MS/MS鉴定的不同组之间的差异蛋白信息 |
| 附录B 全文缩略语 |
| 附录C 常用缓冲液及配方 致谢 作者简历 |
（9）新发现的水禽星状病毒、微RNA病毒和嵌杯病毒的分子检测与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 星状病毒概述 |
| 1.2 微RNA病毒概述 |
| 1.3 嵌杯病毒概述 |
| 1.4 随机扩增法 |
| 1.5 病毒宏基因组学 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 1.7 研究内容 |
| 第二章 两种新的鸭星状病毒的分子检测与鉴定 |
| 摘要 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 临床样品 |
| 2.2.2 鸭胚和SPF鸡胚 |
| 2.2.3 主要试剂和试剂盒 |
| 2.2.4 主要溶液及其配制 |
| 2.2.5 主要仪器设备 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 样品处理 |
| 2.3.2 RNA提取 |
| 2.3.3 星状病毒的检测 |
| 2.3.4 PCR产物的回收与克隆 |
| 2.3.5 PCR鉴定及测序 |
| 2.3.6 病毒分离与培养 |
| 2.3.7 随机扩增 |
| 2.3.8 序列处理和组装 |
| 2.3.9 星状病毒的基因组测序 |
| 2.3.10 序列分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 星状病毒的检测 |
| 2.4.2 病毒培养 |
| 2.4.3 基因组测序 |
| 2.4.4 基因组结构分析 |
| 2.4.5 非编码区分析 |
| 2.4.6 核糖体移框信号分析 |
| 2.4.7 非结构蛋白分析 |
| 2.4.8 衣壳蛋白分析 |
| 2.4.9 DAstV/YP2与其他禽星状病毒的遗传进化关系 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 我国水禽群体星状病毒的感染和分布情况 |
| 2.5.2 DAstV/YP2的基因组结构特点 |
| 2.5.3 DAstV/YP2的分类地位 |
| 第三章 一种新的鸭微RNA病毒的分子检测与鉴定 |
| 摘要 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 临床样品 |
| 3.2.2 试剂、试剂盒、溶液及仪器设备 |
| 3.2.3 鸭胚、SPF鸡胚及细胞 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 样品处理 |
| 3.3.2 随机扩增及序列组装 |
| 3.3.3 基因组测序 |
| 3.3.4 分子检测 |
| 3.3.5 病毒培养 |
| 3.3.6 序列分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 随机扩增 |
| 3.4.2 基因组测序 |
| 3.4.3 基因组结构分析 |
| 3.4.4 LY与其他微RNA病毒的关系 |
| 3.4.5 聚蛋白裂解位点预测和保守基序分析 |
| 3.4.6 非编码区分析 |
| 3.4.7 病毒培养 |
| 3.4.8 分子检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 DMV的分子检测 |
| 3.5.2 DMV的分类地位 |
| 3.5.3 DMV的基因组结构特点 |
| 第四章 一种新的鹅嵌杯病毒的分子检测与鉴定 |
| 搞要 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 临床样品 |
| 4.2.2 试剂、试剂盒、溶液及仪器设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 样品处理 |
| 4.3.2 随机扩增 |
| 4.3.3 基因组测序 |
| 4.3.4 鹅杯状病毒的检测 |
| 4.3.5 序列分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 随机扩增 |
| 4.4.2 基因组测序 |
| 4.4.3 基因组结构分析 |
| 4.4.4 聚蛋白保守基序分析 |
| 4.4.5 同源性分析与进化分析 |
| 4.4.6 分子检测 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 GoCV的检测 |
| 4.5.2 GoCV的基因组结构 |
| 4.5.3 GoCV的分类地位 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）J亚群禽白血病病毒JS09GY3株感染特性及感染鸡法氏囊转录组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第1章 禽白血病研究进展 |
| 1 禽白血病研究简史 |
| 2 禽白血病的公共卫生意义 |
| 3 禽白血病病毒 |
| 4 禽白血病的流行病学 |
| 5 禽白血病的临床表现 |
| 6 禽白血病的致病机制 |
| 7 禽白血病的诊断 |
| 8 禽白血病的防制 |
| 第2章 转录组学技术在动物病原研究中的应用 |
| 1 转录组学技术在动物性细菌研究中的应用 |
| 2 转录组学技术在动物性病毒研究中的应用 |
| 3 转录组学技术在动物性寄生虫研究中的应用 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第3章 不同日龄鸡感染ALV-J的抗原和抗体变化规律 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第4章 不同方法检测J亚群禽白血病的效果比较与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第5章 ALV-J JS09GY3株对SPF鸡的感染特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第6章 ALV-J感染SPF鸡法氏囊转录组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的文章及出版的着作 |
四、禽类圆环病毒病——PMWS研究的先导（论文参考文献）
- [1]表达NDV蛋白的重组酵母构建及免疫效力评价[D]. 姚舜禹. 天津大学, 2020(02)
- [2]猪圆环病毒2型Cap蛋白亲和肽配基的理性设计、鉴定及应用[D]. 郝俊芳. 四川农业大学, 2020
- [3]我国猪肉供应风险及对策研究[J]. 牟笛,许静斯,冯佳昊,陈安,李雪娇. 中国科学院院刊, 2020(03)
- [4]截短钙网蛋白融合FMDV VP1及PCV2 Cap蛋白表达形成多聚体的免疫原性分析[D]. 刘畅. 吉林大学, 2019(02)
- [5]啮齿目动物沙粒病毒科、黄病毒科等7科病毒组及进化研究[D]. 杜江. 北京协和医学院, 2017(11)
- [6]蝙蝠宿主中新病毒发现及蝙蝠冠状病毒HKU9受体的探索[D]. 黄灿平. 中国疾病预防控制中心, 2017(02)
- [7]禽腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用[D]. 邱丽叶. 东北农业大学, 2016(02)
- [8]猪圆环病毒2型-猪瘟病毒共感染细胞的蛋白质组研究[D]. 周妞. 浙江大学, 2016(12)
- [9]新发现的水禽星状病毒、微RNA病毒和嵌杯病毒的分子检测与鉴定[D]. 廖勤丰. 中国农业大学, 2014(11)
- [10]J亚群禽白血病病毒JS09GY3株感染特性及感染鸡法氏囊转录组学分析[D]. 杭柏林. 扬州大学, 2014(01)